Địa chỉ hiện tại: OX11 0DE, Vương quốc Anh, Tòa nhà Diamond, Khu Khoa học và Đổi mới Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Vương quốc Anh, Công ty TNHH Nguồn sáng Diamond, Trung tâm Hình ảnh Sinh học Điện tử.
Phức hợp thu nhận ánh sáng trung tâm phản ứng 1 (RC-LH1) là thành phần quang hợp cốt lõi của vi khuẩn quang dưỡng màu tím. Chúng tôi đã giới thiệu hai cấu trúc hiển vi điện tử đông lạnh của phức hợp RC-LH1 từ Rhodopseudomonas palustris. Cấu trúc có độ phân giải 2,65 Å của phức hợp RC-LH114-W bao gồm 14 vòng lặp tiểu đơn vị LH1 bao quanh RC, bị gián đoạn bởi protein W, trong khi phức hợp không có protein W hoàn toàn là thành phần RC được bao quanh bởi RC. Vòng lặp LH1 gồm 16 tiểu đơn vị khép kín. Việc so sánh các cấu trúc này cung cấp những hiểu biết sâu sắc về động lực học của quinone trong phức hợp RC-LH1, bao gồm cả những thay đổi cấu hình chưa được xác định trước đây khi liên kết quinone tại vị trí RC QB, cũng như vị trí của các vị trí liên kết quinone phụ trợ, giúp truyền chúng đến RC. Cấu trúc độc đáo của protein W ngăn cản sự đóng lại của vòng lặp LH1, do đó tạo ra một kênh để tăng tốc quá trình trao đổi quinone/quinolone.
Năng lượng do quang hợp cung cấp có thể duy trì hầu hết sự sống trên trái đất và có tiềm năng lớn cho công nghệ sinh học năng lượng mặt trời. Trong khi thúc đẩy quang hợp toàn cầu, vi khuẩn quang dưỡng màu tím cũng thể hiện nhiều chế độ năng lượng và khả năng trao đổi chất khác nhau. Chúng có thể tránh quang hợp và phát triển như vi khuẩn dị dưỡng trong bóng tối, có thể cố định nitơ và carbon dioxide, sản xuất hydro và phân hủy các hợp chất thơm (1-3). Để cung cấp năng lượng cho các quá trình này, ánh sáng phải được chuyển đổi nhanh chóng và hiệu quả thành năng lượng hóa học. Quá trình này bắt đầu khi phức hợp ăng-ten bẫy ánh sáng hấp thụ ánh sáng và truyền năng lượng bị giữ lại đến trung tâm phản ứng (RC), do đó bắt đầu quá trình tách điện tích (4-7). Đơn vị cơ bản của quang hợp trong vi khuẩn quang dưỡng màu tím bao gồm RC loại 2, được bao quanh bởi phức hợp thu hoạch ánh sáng 1 (LH1), tạo thành phức hợp lõi RC-LH1. LH1 được hình thành bởi một mảng các dị dimer αβ cong, mỗi dị dimer liên kết với hai phân tử diệp lục vi khuẩn (BChl) a và một hoặc hai carotenoid (8-12). Ăng-ten LH1 đơn giản nhất bao gồm 16 hoặc 17 dị dimer αβ bao quanh RC (9-13) trong một vòng khép kín, nhưng trong các phức hợp lõi khác, các peptit xuyên màng làm gián đoạn tính liên tục của LH1 xung quanh, do đó thúc đẩy sự khuếch tán quinol/quinone giữa RC và phức hợp cytochrome bc1 (11, 13-15). Cây quang hợp màu tím Rhodopseudomonas (Rps.) là một sinh vật mẫu có thể hiểu được sự chuyển giao năng lượng và electron hỗ trợ quá trình quang hợp. Cấu trúc tinh thể đầu tiên của Rps. Mô hình phức hợp RC-LH1 palustris là RC, được bao quanh bởi 15 vòng LH1 dị dimer, bị gián đoạn bởi một protein chưa xác định được gọi là “Protein W” (14). Protein-W sau đó được xác định là RPA4402, một protein 10,5kDa chưa được đặc trưng với ba xoắn ốc xuyên màng (TMH) được dự đoán (16). Chúng tôi đề xuất đổi tên gen rpa4402 mã hóa protein W thành pufW để nhất quán với danh pháp được sử dụng cho các gen mã hóa các tiểu đơn vị RC-L, M (pufL, pufM) và LH1α, β (pufA, pufB). Điều thú vị là protein W chỉ có mặt trong khoảng 10% RC-LH1, cho thấy Rps. palustris tạo ra hai phức hợp RC-LH1 khác nhau. Ở đây, chúng tôi báo cáo cấu trúc cryo-EM độ phân giải cao của hai phức hợp lõi, một phức hợp có protein W và 14 dị dimer αβ, phức hợp còn lại không có protein W và một vòng LH1 dị dimer khép kín gồm 16 phân tử. Cấu trúc của chúng tôi thể hiện một bước tiến quan trọng trong việc hiểu biết về phức hợp RC-LH1 của Rps. palustris, bởi vì chúng tôi đã phân tích quần thể đồng nhất của mỗi biến thể và có độ phân giải đủ để xác định rõ ràng từng peptide và các sắc tố liên kết cũng như các lipid và quinone liên quan. So sánh các cấu trúc này cho thấy ba protein TMH-W chưa từng được tìm thấy trong bất kỳ phức hợp RC-LH1 nào khác cho đến nay tạo ra một kênh quinone để tăng tốc quá trình trao đổi quinone/quinolone. Một số vị trí liên kết lipid và quinone được bảo tồn đã được xác định, và chúng tôi đã phát hiện ra một sự thay đổi cấu hình mới sau khi kết hợp quinone và RC, có thể phù hợp với RC của hệ thống quang hợp II (PSII) của các sinh vật quang hợp được oxy hóa. Phát hiện của chúng tôi cung cấp những hiểu biết mới về động học của quá trình liên kết và trao đổi quinone/quinolone trong phức hợp lõi RC-LH1 của vi khuẩn quang hợp màu tím.
Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu chi tiết hai phức hợp được tìm thấy trong Rps. palustris, chúng tôi phân lập từng RC-LH1 bằng các phương pháp sinh hóa. Phức hợp thiếu protein W (sau đây gọi là ΔpufW) được tinh chế từ chủng thiếu gen pufW (16), và chỉ có thể tạo ra một phức hợp RC-LH1. Phức hợp chứa protein W được tạo ra bởi một chủng. Protein W của chủng này được sửa đổi bằng thẻ 10x His ở đầu C của nó, để phức hợp chứa protein W có thể được kết hợp hiệu quả với hầu hết các protein W bị thiếu bằng cách cố định kim loại. Phức hợp được tách hiệu quả (16) bằng Sắc ký ái lực (IMAC).
Như thể hiện trong Hình 1, cả hai phức hợp đều chứa một RC ba tiểu đơn vị (RC-L, RC-M và RC-H) được bao quanh bởi một anten LH1. Cấu trúc 2,80 Å của phức hợp thiếu protein-W cho thấy 16 dị dimer αβ, tạo thành một vòng LH1 khép kín bao quanh hoàn toàn RC, sau đây được gọi là phức hợp RC-LH116. Cấu trúc 2,65 Å của phức hợp chứa protein-W có một LH1 gồm 14 dị dimer bị gián đoạn bởi protein-W, sau đây được gọi là RC-LH114-W.
(A và B) Hình ảnh bề mặt của hợp chất. (C và D) Các sắc tố liên kết được biểu thị bằng các thanh. (E và F) Các phức hợp được quan sát từ bề mặt tế bào chất có các peptit và các tiểu đơn vị LH1 được biểu thị bằng hình vẽ hoạt hình, và được đánh số theo chiều kim đồng hồ từ khoảng trống protein-W [phù hợp với cách đánh số Rba. phức hợp sphaeroides (13)]. Đối với LH1-α, màu của tiểu đơn vị protein là màu vàng; đối với LH1-β, màu của tiểu đơn vị protein là màu xanh lam; đối với protein-W, protein có màu đỏ; đối với RC-H, nó có màu lục lam; đối với RC-L, nó có màu cam; đối với RC-M, màu đỏ tươi. Các đồng yếu tố được biểu thị bằng các thanh, màu xanh lá cây biểu thị các phân tử BChl và BPh a, màu tím biểu thị carotenoid, và màu vàng biểu thị các phân tử UQ10. (G và H) Hình ảnh phóng to của khoảng trống protein-W trong vùng tương đương của phức hợp RC-LH114-W (G) và phức hợp RC-LH116 (H). Các đồng yếu tố được hiển thị dưới dạng lấp đầy không gian, quinone liên kết được hiển thị bằng màu xanh lam. Khoảng trống protein-W được làm nổi bật bằng một đường chấm màu xanh lam trong (G), và các lỗ nhỏ nơi quinone/quinolol khuếch tán trên vòng LH116 được làm nổi bật bằng một đường chấm màu đen trong (H).
Hình 1 (A và B) cho thấy RC được bao quanh bởi các mảng mở hoặc đóng của các dị hợp tử LH1αβ, mỗi dị hợp tử liên kết với hai BChl và một carotenoid (Hình 1, C và D). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng Rps là phức hợp LH1. Trong con đường sinh tổng hợp xanthin của tảo xoắn, các loài này chứa quần thể carotenoid hỗn hợp (17). Tuy nhiên, spiropyrroxanthin là carotenoid chiếm ưu thế và mật độ của nó là thỏa đáng. Do đó, chúng tôi đã chọn mô hình hóa spiroxanthin tại tất cả các vị trí liên kết LH1. Các chuỗi polypeptide alpha và beta là các TMH đơn với vùng ngoài màng ngắn (Hình 1, A, B, E và F). Mặc dù mật độ của 17 dư lượng ở đầu C không được quan sát thấy, chuỗi polypeptide alpha đã bị cắt từ Met1 đến Ala46 trong cả hai phức hợp. Chuỗi polypeptide β đã bị khử từ Gly4 đến Tyr52 trong RC-LH116 và từ Ser5 đến Tyr52 trong RC-LH114-W. Không quan sát thấy mật độ của 3 hoặc 4 gốc N-terminal hoặc 13 gốc C-terminal (Hình S1). Phân tích khối phổ của phức hợp RC-LH1 hỗn hợp được điều chế từ chủng hoang dã cho thấy vùng bị thiếu là kết quả của sự phân cắt không đồng nhất của các peptit này (Hình S1 và S2). Sự formyl hóa N-terminal của α-Met1 cũng được quan sát thấy (f). Phân tích cho thấy peptit α bao gồm các gốc fMet1 đến Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, và peptit β bao gồm các gốc Ser2 đến Ala53, điều này phù hợp với bản đồ mật độ EM ở nhiệt độ thấp.
Sự phối hợp của α-His29 và β-His36 làm cho BChls đối mặt với nhau; mỗi dị dimer αβ lắp ráp với các lân cận của nó để tạo thành một vòng mở (RC-LH114-W) hoặc một vòng đóng (RC-LH116) xung quanh RC. Mảng sắc tố liên kết exciton (Hình 1, C và D). So với dải 877 nm của RC-LH114-W, sự dịch chuyển đỏ hấp thụ 880 nm của RC-LH116 là 3 nm (Hình 2A). Tuy nhiên, phổ lưỡng sắc tròn gần như giống nhau (Hình 2B), cho thấy mặc dù có sự khác biệt rõ ràng giữa vòng mở và vòng đóng, môi trường cục bộ của BChls rất giống nhau. Sự dịch chuyển đỏ hấp thụ có thể là kết quả của việc giảm chuyển động nhiệt và tăng độ ổn định trên vòng đóng (18, 19), sự thay đổi trong liên kết sắc tố do vòng đóng gây ra (20, 21), hoặc sự kết hợp của hai hiệu ứng này (11).
(A) Phổ hấp thụ tia cực tím/ánh sáng nhìn thấy/cận hồng ngoại, các đỉnh được đánh dấu bằng các sắc tố tương ứng và được chuẩn hóa theo đỉnh BPh ở 775 nm. (B) Phổ lưỡng sắc tròn được chuẩn hóa theo độ hấp thụ BChl ở 805 nm. (C và D) Các phổ ΔA được chọn từ phổ hấp thụ theo thời gian của phức hợp RC-LH114-W (C) và phức hợp RC-LH116 (D). Để so sánh tốt hơn, tất cả các phổ đều được chuẩn hóa theo ∆A là −A ở 0,2 ps. (E) Tốc độ oxy hóa cytochrome c2 sau khi chiếu xạ khi có mặt các nồng độ UQ2 khác nhau (xem Hình S8 để biết dữ liệu thô). (F) Trong các tế bào được nuôi cấy dưới ánh sáng cường độ thấp, trung bình hoặc cao (lần lượt là 10, 30 hoặc 300 μMm-2 s-1), tỷ lệ protein W và các tiểu đơn vị RC-L trong phức hợp tinh khiết và màng được tách ra. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp điện di gel polyacrylamide SDS và xét nghiệm miễn dịch (xem Hình S9 để biết dữ liệu thô). Xác định tỷ lệ so với phức hợp RC-LH114-W đã được tinh chế. Tỷ lệ mol của RC-L so với protein-W trong phức hợp là 1:1.
Các BChl ở vị trí 1 trong vòng αβ14 bị biến dạng của RC-LH114-W (Hình 1, A, C và E) gần với chất cho chính RC (P) hơn 6,8Å so với các BChl tương đương trong RC-LH116 (Hình 1, B, D và F, và Hình S3); tuy nhiên, động học hấp thụ tức thời của hai phức hợp cho thấy rằng đối với RC-LH114-W và RC-LH116, hằng số thời gian truyền năng lượng kích thích từ LH1 đến RC lần lượt là 40 ±4 và 44±3 ps (Hình 2, C và D, Hình S4 và Bảng S2). Cũng không có sự khác biệt đáng kể trong quá trình truyền điện tử bên trong RC (Hình S5 và văn bản bổ sung liên quan). Chúng tôi nghi ngờ rằng sự tương ứng chặt chẽ về thời gian truyền năng lượng giữa LH1 và RC-P là do khoảng cách, góc và năng lượng tiềm năng tương tự của hầu hết các BChl trong hai vòng LH1. Có vẻ như việc khai thác mô hình năng lượng LH1 để đạt được khoảng cách tối thiểu không nhanh hơn so với việc truyền năng lượng trực tiếp từ các vị trí không tối ưu đến RC. Vòng lặp LH1 hở trong RC-LH114-W cũng có thể trải qua chuyển động nhiệt không đáng kể trong điều kiện nhiệt độ thấp để phân tích cấu trúc, và có một cấu hình vòng αβ14 dài hơn ở nhiệt độ phòng từ khoảng cách sắc tố của βBChls tại vị trí của RC 1.
Phức hợp RC-LH116 chứa 32 BChl và 16 carotenoid, và sự sắp xếp tổng thể của nó giống với sự sắp xếp thu được từ Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Mã số Protein Data Bank (PDB) 5Y5S] (9), chủng Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (Mã số PDB 7C9R) (12) và tảo lục (Blc.viridis) (Mã số PDB 6ET5) (10). Sau khi căn chỉnh, chỉ quan sát thấy những sai lệch nhỏ về vị trí của các dị dimer αβ, đặc biệt là 1-5, 15 và 16 (Hình S6). Sự hiện diện của protein-W có tác động đáng kể đến cấu trúc của LH1. Ba TMH của nó được kết nối bằng các vòng ngắn, với đầu N nằm ở phía lòng ống của phức hợp và đầu C nằm ở phía tế bào chất (Hình 1A và 3, A đến D). Protein-W chủ yếu là kỵ nước (Hình 3B), và TMH2 cùng TMH3 tương tác với LH1αβ-14 để tạo thành bề mặt xuyên màng (Hình 3, B và E đến G). Vùng giao diện chủ yếu bao gồm các gốc Phe, Leu và Val trong vùng xuyên màng. Các gốc này được xếp chồng lên nhau với các axit amin kỵ nước và sắc tố αβ-14. Một số gốc phân cực cũng góp phần vào tương tác, bao gồm liên kết hydro giữa W-Thr68 và β-Trp42 trên bề mặt khoang phức hợp (Hình 3, F và G). Trên bề mặt tế bào chất, Gln34 nằm liền kề với nhóm keto của carotenoid αβ-14. Ngoài ra, phân tử n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) đã được xác định, và đuôi kỵ nước của nó kéo dài đến vùng giao diện giữa protein-W và αβ-14, và đuôi lipid có thể nằm trong cơ thể. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng các vùng phân giải C-terminal của protein W và RCH rất gần nhau, nhưng không nằm trong phạm vi hình thành các tương tác đặc hiệu (Hình 1, A và E). Tuy nhiên, có thể có các tương tác trong các axit amin C-terminal chưa được phân giải của hai protein này, điều này có thể cung cấp một cơ chế cho việc tuyển dụng protein W trong quá trình lắp ráp phức hợp RC-LH114-W.
(A) Protein-W, ở dạng hoạt hình, đối diện với giao diện LH1αβ14, có chuỗi bên hình que (màu đỏ), được hiển thị trong một phần của sơ đồ điện thế tĩnh điện (bề mặt màu xám trong suốt với mức đường viền 0,13). (B) Protein-W được biểu diễn bằng bề mặt màu kỵ nước. Các vùng phân cực và tích điện được hiển thị màu lục lam, các vùng kỵ nước được hiển thị màu trắng và các vùng kỵ nước mạnh được hiển thị màu cam. (C và D) Protein-W được biểu diễn ở dạng hoạt hình, hướng của nó giống như trong (A) (C), và được xoay 180° (D). Theo vị trí trong chuỗi, các dư lượng có thể phân biệt được sử dụng sơ đồ màu cầu vồng, trong đó đầu N màu xanh lam và đầu C màu đỏ. (E) Protein-W ở cùng góc nhìn như trong (A), và các dư lượng tại giao diện của protein-W:LH1 được biểu diễn bằng các que có gắn dấu. (F) Protein-W được xoay 90° so với (E) và LH1αβ14 trong hình minh họa dạng hoạt hình, và so với các dư lượng giao diện trong hình minh họa dạng thanh. Các dư lượng nhô ra từ chuỗi polypeptide beta được đánh dấu. Đồng yếu tố được hiển thị dưới dạng thanh có màu trùng với Hình 1, β-DDM bị phân hủy được hiển thị màu xám, và oxy được hiển thị màu đỏ. (G) Góc nhìn trong (F) được xoay 180°, với các dư lượng nổi bật của chuỗi polypeptide alpha được đánh dấu.
Protein-W thay thế một dị dimer αβ (thứ 15 trong Hình 1F), do đó ngăn chặn sự đóng vòng và làm nghiêng ba dị dimer αβ đầu tiên. Quan sát thấy góc nghiêng tối đa của dị dimer αβ-1 đầu tiên so với pháp tuyến của màng là từ 25° đến 29° (Hình 1, A và E), được tạo thành bởi độ nghiêng từ 2° đến 8° của αβ-1 trong RC A sharp contrast-LH116 (Hình 1, B và F). Dị dimer thứ hai và thứ ba nghiêng lần lượt ở góc từ 12° đến 22° và từ 5° đến 10°. Do sự cản trở không gian của RC, độ nghiêng của αβ-1 không bao gồm cặp αβ thứ hai (tương ứng với αβ thứ 16 trong Hình 1F), do đó tạo thành một khoảng trống rõ ràng trong vòng LH1 (Hình 1, A và E). Do thiếu hai dị dimer αβ, kèm theo sự mất đi bốn BChl và hai carotenoid, không có carotenoid nào liên kết với tiểu đơn vị αβ-1 bị xoắn, dẫn đến vòng LH114-W chứa 13 carotenoid và 28 BChl. Ước tính độ phân giải cục bộ của hai phức hợp trong vùng αβ1 đến 7 thấp hơn so với phần còn lại của vòng LH1, điều này có thể phản ánh tính dẻo vốn có của tiểu đơn vị LH1 liền kề với vị trí RC QB (Hình 4).
Hình ảnh của RC-LH114-W (A và B) và RC-LH116 (C và D) được hiển thị từ cùng một góc nhìn từ trên xuống/từ bên cạnh (A và B) (A và C) và bề mặt khoang của Hình 1 (B và D). Các chú thích màu được hiển thị ở bên phải.
Phức hợp lõi đặc trưng duy nhất khác với tỷ lệ stoichiometric là 1:14 là dimer RC-LH1-PufX của Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Tuy nhiên, protein W và PufX không có sự tương đồng rõ ràng và có tác động đáng kể đến cấu trúc LH1 tương ứng của chúng. PufX là một TMH đơn với miền tế bào chất đầu N tương tác với phía tế bào chất của tiểu đơn vị RC-H (13) tại vị trí tương ứng với Rps. palustris LH116αβ-16. PufX tạo ra một kênh trao đổi quinone/quinolone giữa RC-LH1 và phức hợp cytochrome bcl và có mặt trong tất cả các phức hợp lõi của Rba. sphaeroides (13). Mặc dù giao diện monome-monome nằm trong Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX nằm ở vị trí liên kết của protein W trong RC-LH114-W, và khoảng trống do PufX và protein-W tạo ra nằm ở vị trí tương đương (Hình S7A). Khoảng trống trong RC-LH114-W cũng thẳng hàng với kênh quinone giả định (8) của Pseudomonas rosea LH1, được hình thành bởi các peptide không liên quan đến protein W hoặc PufX (Hình S7B). Ngoài ra, kênh quinone trong Blc. Emerald green LH1 được hình thành bằng cách loại trừ một tiểu đơn vị γ (7) nằm ở vị trí tương tự (Hình S7C). Mặc dù được trung gian bởi các protein khác nhau, sự xuất hiện của các kênh quinone/quinolol này ở vị trí chung trong phức hợp RC-LH1 dường như là một ví dụ về sự tiến hóa hội tụ, cho thấy khoảng trống do protein W tạo ra có thể hoạt động như một kênh quinone.
Khoảng trống trong vòng lặp LH114-W cho phép hình thành một vùng màng liên tục giữa không gian bên trong của phức hợp RC-LH114-W và màng chính (Hình 1G), thay vì kết nối hai miền thông qua một lỗ protein như trong protein. Phức hợp RC-LH116 tương tự như phức hợp Tch đóng. Giống như kim (22) (Hình 1H). Vì sự khuếch tán của quinone qua màng nhanh hơn sự khuếch tán qua kênh protein hẹp, vòng lặp LH114-W mở có thể cho phép chuyển hóa RC nhanh hơn vòng lặp LH116 đóng, và sự khuếch tán của quinone vào RC có thể bị hạn chế hơn. Để kiểm tra xem protein W có ảnh hưởng đến sự chuyển đổi quinone qua RC hay không, chúng tôi đã thực hiện xét nghiệm oxy hóa cytochrome trên một nồng độ nhất định của ubiquinone 2 (UQ2) (một chất tương tự của UQ10 tự nhiên với đuôi isoprene ngắn hơn) (Hình 2E). Mặc dù sự hiện diện của quinone tạo phức cản trở việc xác định chính xác hằng số Michaelis biểu kiến ​​(RC-LH114-W và RC-LH116 phù hợp với nồng độ lần lượt là 0,2±0,1μM và 0,5±0,2μM), tốc độ tối đa của RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) lớn hơn 28±5% so với RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Ban đầu, chúng tôi ước tính rằng protein-W có mặt trong khoảng 10% phức hợp lõi (16); ở đây, tỷ lệ chiếm chỗ của các tế bào tăng trưởng trong điều kiện ánh sáng yếu, ánh sáng trung bình và ánh sáng mạnh lần lượt là 15±0,6%, 11±1% và 0,9±0,5% (Hình 2F). So sánh định lượng bằng phương pháp đo phổ khối lượng cho thấy việc bổ sung thẻ histidine không làm giảm lượng tương đối của protein-W so với các chủng hoang dã (P = 0,59), do đó các mức độ này không phải là hiện tượng giả tạo của protein-W đã được sửa đổi (Hình S10). Tuy nhiên, tỷ lệ chiếm chỗ thấp của protein-W trong phức hợp RC-LH1 có thể cho phép một số RC lật với tốc độ nhanh hơn, do đó làm giảm sự trao đổi quinone/quinolone chậm hơn trong phức hợp RC-LH116. Chúng tôi nhận thấy rằng tỷ lệ chiếm dụng ánh sáng cao không phù hợp với dữ liệu phiên mã gần đây, cho thấy biểu hiện gen pufW tăng lên dưới ánh sáng mạnh (Hình S11) (23). Sự khác biệt giữa phiên mã pufW và sự kết hợp protein-W vào phức hợp RC-LH1 gây nhầm lẫn và có thể phản ánh sự điều chỉnh phức tạp của protein.
Trong RC-LH114-W, 6 phân tử cardiolipin (CDL), 7 phân tử phosphatidylcholine (POPC), 1 phân tử phosphatidylglycerol (POPG) và 29 phân tử β-DDM được phân bổ và mô hình hóa trong đó 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG và 12 βDDM. RC-LH116 (Hình 5, A và B). Trong hai cấu trúc này, CDL hầu như nằm ở phía tế bào chất của phức hợp, trong khi POPC, POPG và β-DDM chủ yếu nằm ở phía lòng ống. Hai phân tử lipid và chất tẩy rửa được phân lập trong vùng αβ-1 đến αβ-6 của phức hợp RC-LH114-W (Hình 5A), và năm phân tử được phân lập trong vùng tương đương của RC-LH116 (Hình 5B). Nhiều lipid hơn được tìm thấy ở phía bên kia của phức hợp, chủ yếu là CDL, tích tụ giữa RC và αβ-7 đến αβ-13 (Hình 5, A và B). Các lipid và chất tẩy rửa khác có cấu trúc được xác định nằm bên ngoài vòng LH1, và các chuỗi acyl được xác định rõ ràng kéo dài giữa các tiểu đơn vị LH1, tạm thời được chỉ định là β-DDM trong RC-LH114-W, và được định nghĩa là β-DDM trong hỗn hợp RC A của β-DDM và POPC-LH116. Vị trí tương tự của các lipid và chất tẩy rửa tạo phức trong cấu trúc của chúng tôi cho thấy chúng là các vị trí liên kết có liên quan về mặt sinh lý (Hình S12A). Vị trí của các phân tử tương đương trong Tch cũng có sự nhất quán tốt. Gentle và Trv. Chủng 970 RC-LH1s (Hình S12, B đến E) (9, 12) và các dư lượng liên kết hydro của nhóm đầu lipid cho thấy sự bảo tồn khá tốt trong sự sắp xếp trình tự (Hình S13), cho thấy CDL được bảo tồn liên kết với RC (24), các vị trí này có thể được bảo tồn trong phức hợp RC-LH1.
(A và B) Các peptide RC-LH114-W (A) và RC-LH116 (B) được biểu diễn bằng hình vẽ hoạt hình, và các sắc tố được biểu diễn bằng các thanh, sử dụng sơ đồ màu trong Hình 1. Lipid được hiển thị màu đỏ, và chất tẩy rửa được hiển thị màu xám. UQ liên kết với các vị trí RC QA và QB có màu vàng, trong khi UQ riêng lẻ có màu xanh lam. (C và D) Các góc nhìn tương tự như (A) và (B), nhưng đã lược bỏ lipid. (E đến G) Hình ảnh phóng to của Q1 (E), Q2 (F) và Q3 (G) từ RC-LH116, với các chuỗi bên ảnh hưởng lẫn nhau. Các liên kết hydro được hiển thị bằng các đường chấm đen.
Trong RC-LH116, cả RC QA và QB UQ, tham gia vào quá trình truyền electron trong quá trình tách điện tích, đều bị phân hủy tại các vị trí liên kết của chúng. Tuy nhiên, trong RC-LH114-W, quinone QB chưa được phân giải và sẽ được thảo luận chi tiết hơn bên dưới. Ngoài các quinone QA và QB, hai phân tử UQ tạo phức (nằm giữa vòng RC và LH1) được phân bổ trong cấu trúc RC-LH114-W theo các nhóm đầu được phân giải rõ ràng của chúng (lần lượt nằm trong không gian Q1 và Q2). (Hình 5C). Hai đơn vị isoprene được gán cho Q1, và bản đồ mật độ phân giải hoàn chỉnh 10 đuôi isoprene của Q2. Trong cấu trúc của RC-LH116, ba phân tử UQ10 tạo phức (Q1 đến Q3, Hình 5D) đã được phân giải, và tất cả các phân tử đều có mật độ rõ ràng dọc theo đuôi (Hình 5, D đến G). Trong hai cấu trúc, vị trí của các nhóm đầu quinone của Q1 và Q2 có sự nhất quán tuyệt vời (Hình S12F), và chúng chỉ tương tác với RC. Q1 nằm ở lối vào khe W của RC-LH114-W (Hình 1G và 5, C, D và E), và Q2 nằm gần vị trí liên kết QB (Hình 5, C, D và F). Các gốc L-Trp143 và L-Trp269 được bảo tồn nằm rất gần Q1 và Q2 và cung cấp các tương tác xếp chồng π tiềm năng (Hình 5, E và F, và Hình S12). L-Gln88, cách oxy xa nhất của Q1 3,0 Å, cung cấp một liên kết hydro mạnh (Hình 5E); gốc này được bảo tồn trong tất cả các RC ngoại trừ mối quan hệ xa nhất (Hình S13). L-Ser91 được thay thế một cách bảo tồn cho Thr trong hầu hết các RC khác (Hình S13), cách oxy metyl của Q1 3,8 Angstrom và có thể tạo ra các liên kết hydro yếu (Hình 5E). Q3 dường như không có tương tác cụ thể, nhưng nằm trong vùng kỵ nước giữa tiểu đơn vị RC-M và tiểu đơn vị LH1-α 5 đến 6 (Hình 5, D và G). Q1, Q2 và Q3 hoặc các quinone liên kết gần đó cũng đã được xác định trong Tch. Gentle, Trv. Strain 970 và Blc. Cấu trúc iris (9, 10, 12) chỉ ra một vị trí liên kết quinone phụ trợ được bảo tồn trong phức hợp RC-LH1 (Hình S12G). Năm phân tử UQ bị phân hủy trong RC-LH116 phù hợp tốt với giá trị 5,8±0,7 của mỗi phức chất được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), trong khi ba phân tử UQ bị phân hủy trong RC-LH114-W thấp hơn giá trị đo được là 6,2±0,3 (Hình S14), cho thấy có các phân tử UQ chưa được phân giải trong cấu trúc.
Các polypeptide L và M giả đối xứng đều chứa năm TMH và tạo thành một heterodimer kết hợp một dimer BChl, hai monomer BChl, hai monomer thực khuẩn (BPh), một sắt không phải heme và một hoặc hai phân tử UQ10. Thông qua sự hiện diện của liên kết hydro trên nhóm ketone cuối cùng và sự tích lũy đã biết của nó trong Rps, carotenoid được kết hợp vào tiểu đơn vị M, được đặt tên là cis-3,4-dehydroorhodopin. Loài (25). Miền màng ngoài của RC-H được neo vào màng bằng một TMH duy nhất. Cấu trúc RC tổng thể tương tự như RC ba tiểu đơn vị của các loài liên quan (chẳng hạn như Rba). sphaeroides (ID PDB: 3I4D). Các vòng macro của BChl và BPh, khung carotenoid và sắt không phải heme chồng chéo trong phạm vi độ phân giải của các cấu trúc này, cũng như nhóm đầu UQ10 tại vị trí QA và quinone QB tại RC-LH116 (Hình S15).
Sự có sẵn của hai cấu trúc RC với tỷ lệ chiếm chỗ QB khác nhau mang lại cơ hội mới để kiểm tra những thay đổi cấu hình nhất quán đi kèm với sự liên kết quinone QB. Trong phức hợp RC-LH116, quinone QB nằm ở vị trí “gần” được liên kết hoàn toàn (26), nhưng sự tách rời của RC-LH114-W không có quinone QB. Không có quinone QB trong RC-LH114-W, điều này đáng ngạc nhiên vì phức hợp này hoạt động, thậm chí còn hoạt động hơn cả phức hợp RC-LH116 với quinone QB được phân giải về mặt cấu trúc. Mặc dù hai vòng LH1 liên kết với khoảng sáu quinone, năm quinone được phân giải về mặt cấu trúc trong vòng RC-LH116 đóng, trong khi chỉ có ba quinone bị giới hạn về mặt cấu trúc trong vòng RC-LH114-W mở. Sự rối loạn cấu trúc gia tăng này có thể phản ánh sự thay thế nhanh hơn các vị trí QB của RC-LH114-W, động học quinone nhanh hơn trong phức hợp và khả năng vượt qua vòng lặp LH1 tăng lên. Chúng tôi cho rằng sự thiếu hụt UQ tại vị trí RC QB của RC-LH114-W có thể là kết quả của một phức hợp phức tạp và hoạt động mạnh hơn, và vị trí QB của RC-LH114-W đã bị đóng băng ngay lập tức trong quá trình chuyển hóa UQ. Giai đoạn cụ thể (lối vào vị trí QB đã bị đóng) phản ánh sự hình thành của hoạt động này.
Nếu không có QB, sự quay kèm theo của L-Phe217 đến vị trí không tương thích với sự liên kết của UQ10 sẽ gây ra va chạm không gian với đơn vị isoprene đầu tiên của đuôi (Hình 6A). Ngoài ra, những thay đổi cấu hình chính rõ ràng cũng được quan sát thấy, đặc biệt là xoắn ốc de (xoắn ốc ngắn trong vòng lặp giữa TMH D và E) nơi L-Phe217 dịch chuyển đến túi liên kết QB và sự quay của L-Tyr223 (Hình 6A) để phá vỡ liên kết hydro với khung M-Asp45 và đóng lối vào vị trí liên kết QB (Hình 6B). Xoắn ốc de xoay quanh gốc của nó, Cα của L-Ser209 dịch chuyển 0,33Å, trong khi L-Val221Cα dịch chuyển 3,52Å. Không có thay đổi nào có thể quan sát được ở TMH D và E, chúng chồng khít lên nhau trong cả hai cấu trúc (Hình 6A). Theo như chúng tôi biết, đây là cấu trúc đầu tiên trong RC tự nhiên đóng vị trí QB. So sánh với cấu trúc hoàn chỉnh (liên kết với QB) cho thấy rằng trước khi quinone bị khử, cần có sự thay đổi cấu hình để nó đi vào quinone. L-Phe217 xoay để tạo thành tương tác xếp chồng π với nhóm đầu quinone, và xoắn ốc dịch chuyển ra ngoài, cho phép khung của L-Gly222 và chuỗi bên của L-Tyr223 tạo thành mạng lưới liên kết hydro với cấu trúc liên kết hydro ổn định (Hình 6, A và C).
(A) Hình hoạt họa chồng chéo của hình chiếu ba chiều (chuỗi L, màu cam/chuỗi M, màu đỏ tươi) và cấu trúc apo (màu xám), trong đó các dư lượng chính được hiển thị dưới dạng biểu diễn hình que. UQ10 được biểu diễn bằng một thanh màu vàng. Đường chấm chấm chỉ ra các liên kết hydro được hình thành trong toàn bộ cấu trúc. (B và C) Biểu diễn bề mặt của apolipoprotein và toàn bộ cấu trúc vòng, làm nổi bật oxy chuỗi bên của L-Phe217 màu xanh lam và L-Tyr223 màu đỏ tương ứng. Tiểu đơn vị L có màu cam; các tiểu đơn vị M và H không được tô màu. (D và E) Apolipoprotein (D) và toàn bộ (E) vị trí RC QB [màu sắc theo (A) tương ứng] và Thermophilus thermophilus PSII (màu xanh lá cây, màu xanh lam với quinone nhựa; ID PDB: 3WU2) Căn chỉnh (58).
Thật bất ngờ, mặc dù có một số cấu trúc RC thiếu QB mà không có LH1, nhưng những thay đổi về cấu trúc được quan sát trong nghiên cứu này chưa từng được báo cáo trước đây. Chúng bao gồm cấu trúc thiếu QB từ Blc. viridis (Mã PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (Mã PDB: 1EYS) (28) và Rba. sphaeroides (Mã PDB: 1OGV) (29), tất cả đều gần giống với cấu trúc QB tổng thể của chúng. Kiểm tra kỹ 3PRC cho thấy các phân tử chất tẩy LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) liên kết ở lối vào vị trí QB, điều này có thể ngăn cản sự sắp xếp lại thành cấu trúc đóng. Mặc dù LDAO không phân hủy ở cùng vị trí trong 1EYS hoặc 1OGV, nhưng các RC này được điều chế bằng cùng một chất tẩy và do đó có thể tạo ra hiệu ứng tương tự. Cấu trúc tinh thể của Rba. RC Sphaeroides kết tinh cùng với cytochrome c2 (ID PDB: 1L9B) dường như cũng có một vị trí QB đóng. Tuy nhiên, trong trường hợp này, vùng đầu N của chuỗi polypeptide RC-M (tương tác với vị trí liên kết QB thông qua liên kết H của gốc Tyr trên xoắn ốc Q) có cấu hình không tự nhiên, và sự thay đổi cấu hình QB không được nghiên cứu thêm (30). Điều đáng mừng là chúng tôi không thấy loại biến dạng này của chuỗi polypeptide M trong cấu trúc RC-LH114-W, gần giống với vùng đầu N của RC-LH116. Cũng cần lưu ý rằng sau khi loại bỏ anten LH1 dựa trên chất tẩy rửa, các RC apolipoprotein trong PDB đã được giải quyết, loại bỏ các bể quinone bên trong và lipid trong khoảng trống giữa RC và bề mặt bên trong của vòng LH1 xung quanh (31, 32). RC vẫn hoạt động vì nó giữ lại tất cả các đồng yếu tố, ngoại trừ quinone QB có thể phân hủy, kém ổn định hơn và thường bị mất trong quá trình chuẩn bị (33). Ngoài ra, người ta biết rằng việc loại bỏ LH1 và lipid vòng tự nhiên khỏi RC có thể ảnh hưởng đến các chức năng, chẳng hạn như rút ngắn tuổi thọ của trạng thái P+QB tách điện tích (31, 34, 35). Do đó, chúng tôi suy đoán rằng sự tồn tại của vòng LH1 cục bộ bao quanh RC có thể duy trì vị trí QB “đóng”, do đó bảo tồn môi trường cục bộ gần QB.
Mặc dù apolipoprotein (không có quinone QB) và cấu trúc hoàn chỉnh chỉ đại diện cho hai hình ảnh chụp nhanh về sự chuyển hóa của vị trí QB, chứ không phải một chuỗi các sự kiện, nhưng có những dấu hiệu cho thấy sự liên kết có thể được điều chỉnh để ngăn chặn sự tái liên kết bởi hydroquinone nhằm ức chế sự ức chế chất nền. Sự tương tác của quinolol và quinone gần vị trí QB của apolipoprotein có thể khác nhau, dẫn đến việc bị RC từ chối. Từ lâu người ta đã đề xuất rằng những thay đổi về cấu trúc đóng vai trò trong việc liên kết và khử quinone. Khả năng của RC đông lạnh để khử quinone sau khi thích nghi với bóng tối bị suy giảm (36); tinh thể học tia X cho thấy rằng tổn thương này là do quinone QB bị mắc kẹt trong một cấu trúc “xa” cách vị trí gần hoạt động khoảng 4,5 Å (26), 37). Chúng tôi đề xuất rằng cấu trúc liên kết xa này là một hình ảnh chụp nhanh của trạng thái trung gian giữa apolipoprotein và cấu trúc vòng hoàn chỉnh, theo sau tương tác ban đầu với quinone và sự mở ra của vị trí QB.
RC loại II được tìm thấy trong phức hợp PSII của một số vi khuẩn quang dưỡng và vi khuẩn lam, tảo và thực vật có sự bảo tồn về cấu trúc và chức năng (38). Sự sắp xếp cấu trúc được thể hiện trong Hình 6 (D và E) nhấn mạnh sự tương đồng giữa RC PSII và vị trí QB của phức hợp RC vi khuẩn. So sánh này từ lâu đã là một mô hình để nghiên cứu các hệ thống liên quan chặt chẽ đến liên kết và khử quinone. Các ấn phẩm trước đây cho thấy những thay đổi về cấu hình đi kèm với quá trình khử quinone của PSII (39, 40). Do đó, xét đến sự bảo tồn tiến hóa của RC, cơ chế liên kết chưa được quan sát trước đây này cũng có thể áp dụng cho vị trí QB của RC PSII ở thực vật quang dưỡng có oxy.
Các chủng Rps ΔpufW (đột biến xóa pufW không được đánh dấu) và PufW-His (protein-W gắn thẻ 10x His ở đầu C được biểu hiện từ locus pufW tự nhiên). palustris CGA009 đã được mô tả trong công trình trước đây của chúng tôi (16). Các chủng này và chủng bố mẹ kiểu hoang dã đồng gen được phục hồi từ tủ đông bằng cách cấy một lượng nhỏ tế bào lên đĩa thạch PYE (mỗi loại 5 g/lít) (được bảo quản trong LB ở -80 °C, chứa 50% (w/v) glycerol), protein, chiết xuất nấm men và succinate) [1,5% (w/v)]. Đĩa được ủ qua đêm trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong điều kiện kỵ khí, sau đó được chiếu sáng bằng ánh sáng trắng (~50 μmolm-2 s-1) do bóng đèn halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) cung cấp trong 3 đến 5 ngày cho đến khi xuất hiện một khuẩn lạc duy nhất. Một khuẩn lạc duy nhất được sử dụng để cấy vào 10 ml môi trường M22+ (41) được bổ sung 0,1% (w/v) axit casamino (sau đây gọi là M22). Nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện ít oxy trong bóng tối ở 34°C với lắc ở tốc độ 180 vòng/phút trong 48 giờ, sau đó 70 ml dịch nuôi cấy được cấy vào trong cùng điều kiện trong 24 giờ. Một dịch nuôi cấy bán hiếu khí với thể tích 1 ml được sử dụng để cấy vào 30 ml môi trường M22 trong một chai thủy tinh trong suốt có nắp vặn đa năng 30 ml và được chiếu xạ với khuấy trộn (~50μmolm-2 s-1) trong 48 giờ bằng que khuấy từ vô trùng. Sau đó, 30 ml dịch nuôi cấy được cấy vào khoảng 1 lít dịch nuôi cấy trong cùng điều kiện, sau đó được sử dụng để cấy vào khoảng 9 lít dịch nuôi cấy được chiếu sáng ở ~200 μmolm-2 s-1 trong 72 giờ. Các tế bào được thu hoạch bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 7132 RCF trong 30 phút, huyền phù lại trong khoảng 10 ml dung dịch tris-HCl 20 mM (pH 8.0), và bảo quản ở -20°C cho đến khi cần sử dụng.
Sau khi rã đông, thêm một ít tinh thể deoxyribonuclease I (Merck, Anh), lysozyme (Merck, Anh) và hai viên thuốc ức chế protease holoenzyme Roche (Merck, Anh) vào hỗn dịch tế bào. Trong máy ép áp suất French 20.000 psi (Aminco, Mỹ), tế bào được phá vỡ từ 8 đến 12 lần. Sau khi loại bỏ các tế bào chưa bị phá vỡ và các mảnh vụn không tan bằng cách ly tâm ở 18.500 RCF trong 15 phút ở 4°C, màng tế bào được kết tủa từ dịch ly giải có màu bằng cách ly tâm ở 113.000 RCF trong 2 giờ ở 43.000°C. Loại bỏ phần hòa tan và hòa tan lại màng tế bào có màu trong 100 đến 200 ml dung dịch tris-HCl 20 mM (pH 8.0) và đồng nhất hóa cho đến khi không còn các cụm kết tủa nhìn thấy được. Màng treo được ủ trong dung dịch tris-HCl 20 mM (pH 8.0) (Anatrace, USA) chứa 2% (w/v) β-DDM trong 1 giờ trong bóng tối ở 4°C với khuấy nhẹ. Sau đó ly tâm ở 70°C để hòa tan 150.000 RCF ở 4°C trong 1 giờ nhằm loại bỏ các chất không tan còn sót lại.
Màng hòa tan từ chủng ΔpufW được cho vào cột trao đổi ion DEAE Sepharose 50 ml với ba thể tích cột (CV) dung dịch đệm liên kết [20 mM tris-HCl (pH 8.0) chứa 0,03% (w/v) β-DDM]. Rửa cột với hai CV dung dịch đệm liên kết, sau đó rửa cột với hai dung dịch đệm liên kết chứa 50 mM NaCl. Phức hợp RC-LH116 được rửa giải bằng gradient tuyến tính từ 150 đến 300 mM NaCl (trong dung dịch đệm liên kết) với 1,75 CV, và phức hợp liên kết còn lại được rửa giải bằng dung dịch đệm liên kết chứa 300 mM NaCl với 0,5 CV. Thu thập phổ hấp thụ trong khoảng từ 250 đến 1000 nm, giữ lại phần có tỷ lệ hấp thụ (A880/A280) lớn hơn 1 trong khoảng 880 đến 280 nm, pha loãng hai lần trong dung dịch đệm liên kết, và sử dụng lại quy trình tương tự trên cột DEAE để tinh chế. Pha loãng các phần có tỷ lệ A880/A280 cao hơn 1,7 và tỷ lệ A880/A805 cao hơn 3,0, thực hiện vòng trao đổi ion thứ ba, và giữ lại các phần có tỷ lệ A880/A280 cao hơn 2,2 và tỷ lệ A880/A805 cao hơn 5,0. Phức hợp đã được tinh chế một phần được cô đặc đến khoảng 2 ml trong bộ lọc ly tâm Amicon có trọng lượng phân tử cắt bỏ (MWCO) 100.000 (Merck, Anh), và được nạp vào cột sắc ký loại trừ kích thước Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, Mỹ) chứa dung dịch đệm NaCl 200 mM, sau đó được rửa giải trong cùng dung dịch đệm ở tốc độ 1,5 CV. Thu thập phổ hấp thụ của phân đoạn loại trừ kích thước, và cô đặc các phổ hấp thụ có tỷ lệ A880/A280 trên 2,4 và tỷ lệ A880/A805 trên 5,8 đến 100 A880, và sử dụng ngay lập tức để chuẩn bị lưới cryo-TEM hoặc bảo quản. Giữ ở -80°C cho đến khi cần sử dụng.
Màng hòa tan từ chủng PufW-His được cho vào cột HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) chứa 200 mM NaCl và 0,03% (w/w)) trong dung dịch đệm IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Cột được rửa bằng năm CV dung dịch đệm IMAC, sau đó bằng năm CV dung dịch đệm IMAC chứa 10 mM histidine. Phức hợp lõi được rửa giải khỏi cột bằng năm dung dịch đệm IMAC chứa 100 mM histidine. Phần chứa phức hợp RC-LH114-W được cô đặc đến ~10 ml trong bể khuấy có trang bị màng lọc Amicon 100.000 MWCO (Merck, Anh), pha loãng 20 lần với dung dịch đệm liên kết, sau đó thêm vào 25 ml trong cột DEAE Sepharose. Bốn CV liên kết với dung dịch đệm được sử dụng trước đó. Rửa cột bằng bốn dung dịch đệm liên kết CV, sau đó rửa giải phức hợp trên tám CV theo gradient tuyến tính từ 0 đến 100 mM NaCl (trong dung dịch đệm liên kết), và bốn CV còn lại chứa 100 mM dung dịch đệm liên kết. Các phức hợp còn lại được rửa giải trên natri clorua kết hợp với các phân đoạn có tỷ lệ A880/A280 cao hơn 2,4 và tỷ lệ A880/A805 cao hơn 4,6 được cô đặc đến khoảng 2 ml trong bộ lọc ly tâm Amicon 100.000 MWCO, và được nạp vào 1,5 CV IMAC trong cột sắc ký loại trừ kích thước Superdex 200 16/600 đã được cân bằng dung dịch đệm trước đó, rồi được rửa giải trong cùng dung dịch đệm đó qua 1,5 CV. Thu thập phổ hấp thụ của các phân đoạn loại trừ kích thước và tập trung các phổ hấp thụ có tỷ lệ A880/A280 trên 2,1 và tỷ lệ A880/A805 trên 4,6 đến 100 A880, được sử dụng ngay lập tức để chuẩn bị lưới TEM đông lạnh hoặc bảo quản ở -80°C cho đến khi cần dùng.
Máy làm lạnh ngâm Leica EM GP được sử dụng để chuẩn bị lưới TEM nhiệt độ thấp. Hợp chất được pha loãng trong dung dịch đệm IMAC đến độ hấp thụ A880 là 50, sau đó 5μl được nhỏ lên lưới đồng phủ carbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 mới được xử lý bằng phóng điện phát sáng (Agar Scientific, Anh). Ủ lưới ở 20°C và độ ẩm tương đối 60% trong 30 giây, sau đó thấm khô trong 3 giây, rồi làm lạnh nhanh trong etan lỏng ở -176°C.
Dữ liệu của phức hợp RC-LH114-W được ghi lại trên eBIC (Trung tâm Hình ảnh Sinh học Điện tử) (Nguồn sáng Kim cương Anh) bằng kính hiển vi Titan Krios, hoạt động ở điện áp gia tốc 300kV, với độ phóng đại danh nghĩa 130.000× và năng lượng 20 eV. Máy ảnh Gatan 968 GIF Quantum với đầu dò đỉnh K2 được sử dụng để ghi hình ở chế độ đếm nhằm thu thập dữ liệu. Kích thước pixel đã hiệu chuẩn là 1,048Å, và tốc độ liều là 3,83 e-Å-2s-1. Quá trình thu thập phim diễn ra trong 11 giây và chia thành 40 phần. Sử dụng vùng phủ carbon để lấy nét lại kính hiển vi, sau đó thu thập ba phim cho mỗi lỗ. Tổng cộng, 3130 phim đã được thu thập, với giá trị lệch tiêu cự từ -1 đến -3μm.
Dữ liệu cho phức hợp RC-LH116 được thu thập bằng cùng một kính hiển vi tại Phòng thí nghiệm Cấu trúc sinh học Asterbury (Đại học Leeds, Anh). Dữ liệu được thu thập ở chế độ đếm với độ phóng đại 130k, và kích thước pixel được hiệu chỉnh thành 1,065 Å với liều lượng 4,6 e-Å-2s-1. Đoạn phim được ghi lại trong 12 giây và chia thành 48 phần. Tổng cộng có 3359 đoạn phim được thu thập, với giá trị độ lệch tiêu cự từ -1 đến -3μm.
Tất cả quá trình xử lý dữ liệu được thực hiện trong quy trình Relion 3.0 (42). Sử dụng Motioncorr 2 (43) để hiệu chỉnh chuyển động chùm tia bằng cách trọng số liều lượng, sau đó sử dụng CTFFIND 4.1 (44) để xác định tham số CTF (hàm truyền độ tương phản). Các ảnh chụp hiển vi điển hình sau các giai đoạn xử lý ban đầu này được hiển thị trong Hình 2. S16. Mẫu lựa chọn tự động được tạo ra bằng cách chọn thủ công khoảng 250 pixel trong số 1000 hạt trong khung 250 pixel và không có phân loại hai chiều (2D) tham chiếu, do đó loại bỏ những phân loại đáp ứng tiêu chí nhiễm bẩn mẫu hoặc không có đặc điểm rõ ràng. Sau đó, quá trình lựa chọn tự động được thực hiện trên tất cả các ảnh chụp hiển vi, và RC-LH114-W có 849.359 hạt, và phức hợp RC-LH116 có 476.547 hạt. Tất cả các hạt được chọn đều trải qua hai vòng phân loại 2D không tham chiếu, và sau mỗi lần chạy, các hạt đáp ứng điều kiện vùng carbon, bị nhiễm bẩn mẫu, không có đặc điểm rõ ràng hoặc các hạt chồng chéo mạnh sẽ bị loại bỏ, dẫn đến 772.033 (90,9%) và 359.678 (75,5%) hạt được sử dụng để phân loại 3D RC-LH114-W và RC-LH116 tương ứng. Mô hình tham chiếu 3D ban đầu được tạo ra bằng phương pháp giảm độ dốc ngẫu nhiên. Sử dụng mô hình ban đầu làm tham chiếu, các hạt được chọn được phân loại thành bốn loại trong không gian 3D. Sử dụng mô hình trong loại này làm tham chiếu, thực hiện tinh chỉnh 3D trên các hạt trong loại lớn nhất, sau đó sử dụng bộ lọc thông thấp 15Å ban đầu để bao phủ vùng dung môi, thêm 6 pixel cạnh mềm và xử lý hậu kỳ các pixel để hiệu chỉnh hàm truyền điều chế đỉnh Gatan K2 của bộ dò trên cùng. Đối với tập dữ liệu RC-LH114-W, mô hình ban đầu này đã được sửa đổi bằng cách loại bỏ mật độ mạnh ở các cạnh của mặt nạ (tách rời khỏi mật độ phức hợp lõi trong UCSF Chimera). Các mô hình thu được (độ phân giải của RC-LH114-W và RC-LH116 lần lượt là 3,91 và 4,16 Å) được sử dụng làm tham chiếu cho vòng phân loại 3D thứ hai. Các hạt được sử dụng được nhóm vào lớp 3D ban đầu và không chứa mối tương quan mạnh với vùng lân cận. Có sự chồng chéo hoặc thiếu các đặc điểm cấu trúc rõ ràng. Sau vòng phân loại 3D thứ hai, danh mục có độ phân giải cao nhất đã được chọn [Đối với RC-LH114-W, một danh mục gồm 377.703 hạt (44,5%), đối với RC-LH116, có hai danh mục, tổng cộng 260.752 hạt (54,7%), trong đó chúng chỉ giống nhau khi được căn chỉnh sau phép quay ban đầu với một sự khác biệt nhỏ]. Các hạt được chọn được trích xuất lại trong một hộp 400 pixel và được tinh chỉnh bằng phương pháp tinh chỉnh 3D. Mặt nạ dung môi được tạo ra bằng cách sử dụng bộ lọc thông thấp 15Å ban đầu, mở rộng bản đồ 3 pixel và mặt nạ mềm 3 pixel. Sử dụng phương pháp tinh chỉnh CTF trên từng hạt, hiệu chỉnh chuyển động trên từng hạt và vòng tinh chỉnh CTF thứ hai trên từng hạt, tinh chỉnh 3D, tạo mặt nạ dung môi và xử lý hậu kỳ được thực hiện sau mỗi bước để tinh chỉnh thêm kết cấu thu được. Sử dụng giá trị cắt FSC (Hệ số tương quan vỏ Fourier) là 0,143, độ phân giải của các mô hình cuối cùng của RC-LH114-W và RC-LH116 lần lượt là 2,65 và 2,80Å. Đường cong FSC của mô hình cuối cùng được hiển thị trong Hình 2. S17.
Tất cả các trình tự protein được tải xuống từ UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) được sử dụng để xây dựng mô hình tương đồng của RC, chứa các trình tự protein của RC-L, RC-M và RC-H và cấu trúc tinh thể của Rba. sphaeroides RC được sử dụng làm khuôn mẫu (ID PDB: 5LSE) (46). Sử dụng công cụ “fit map” trong UCSF Chimera để khớp mô hình được tạo với bản đồ (47), cải thiện cấu trúc protein và đồng yếu tố [4×BChl a (tên dư lượng thư viện monome = BCL), 2×BPh a (BPH), một hoặc hai loại UQ10 (U10), một sắt không heme (Fe) và một 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] sử dụng Coot (48) để thêm vào. Vì QAK không có sẵn trong thư viện monome nên nó được tham số hóa bằng công cụ eLBOW trong PHENIX (49).
Tiếp theo, tiểu đơn vị LH1 được xây dựng. Ban đầu, công cụ xây dựng tự động trong PHENIX (49) được sử dụng để tự động xây dựng một phần trình tự LH1 bằng cách sử dụng bản đồ và trình tự protein LH1-α và LH1-β làm đầu vào. Chọn tiểu đơn vị LH1 hoàn chỉnh nhất, trích xuất nó và tải nó vào Coot, thêm thủ công trình tự bị thiếu vào đó và tinh chỉnh thủ công toàn bộ cấu trúc trước khi thêm hai BCl (BCL) và một spirilloxanthin (CRT) [theo mật độ Rps liên quan của phức hợp LH1 và hàm lượng carotenoid đã biết. Loài (17)]. Sao chép tiểu đơn vị LH1 hoàn chỉnh và sử dụng “Công cụ Bản đồ Ghép nối” của UCSF Chimera để ghép nối vào vùng không phải mô hình liền kề của mật độ LH1, sau đó tinh chỉnh nó trong Coot; lặp lại quá trình cho đến khi tất cả các tiểu đơn vị LH1 đã được mô hình hóa. Đối với cấu trúc RC-LH114-W, bằng cách trích xuất mật độ chưa được phân bổ trong Coot, protein được phân đoạn khỏi các thành phần phi protein còn lại trong bản đồ USCF Chimera và công cụ Autobuild được sử dụng để thiết lập mô hình ban đầu và các tiểu đơn vị còn lại (protein-W) Mô hình hóa. Trong PHENIX (49). Thêm bất kỳ chuỗi nào bị thiếu vào mô hình kết quả trong Coot (48), và sau đó tinh chỉnh thủ công toàn bộ tiểu đơn vị. Mật độ chưa được phân bổ còn lại phù hợp với sự kết hợp của lipid (ID thư viện monome PDB của CDL = CDL, POPC = 6PL và POPG = PGT), chất tẩy β-DDM (LMT) và các phân tử UQ10 (U10). Sử dụng tối ưu hóa PHENIX (49) và tối ưu hóa thủ công trong Coot (48) để hoàn thiện mô hình ban đầu hoàn chỉnh cho đến khi thống kê mô hình và chất lượng hình ảnh của sự phù hợp không thể được cải thiện thêm nữa. Cuối cùng, sử dụng LocScale (50) để làm sắc nét bản đồ cục bộ, và sau đó thực hiện một số chu kỳ khác của việc mô hình hóa mật độ chưa được phân bổ và tối ưu hóa tự động và thủ công.
Các peptit, đồng yếu tố và các lipid và quinone khác được gắn kết trong các vùng mật độ tương ứng được thể hiện trong Hình 1 và 2. S18 đến S23. Thông tin thống kê của mô hình cuối cùng được thể hiện trong Bảng S1.
Trừ khi có quy định khác, phổ hấp thụ UV/Vis/NIR được thu thập trên máy quang phổ Cary60 (Agilent, Hoa Kỳ) với khoảng cách 1 nm từ 250 nm đến 1000 nm và thời gian tích hợp là 0,1 giây.
Pha loãng mẫu trong cuvet thạch anh có đường truyền 2 mm đến A880 = 1, và thu thập phổ hấp thụ trong khoảng từ 400 đến 1000 nm. Phổ lưỡng sắc tròn được thu thập trên máy đo quang phổ phân cực Jasco 810 (Jasco, Nhật Bản) với khoảng cách 1 nm trong khoảng từ 400 nm đến 950 nm ở tốc độ quét 20 nm/phút.
Hệ số hấp thụ mol được xác định bằng cách pha loãng phức chất lõi đến A880 khoảng 50. Pha loãng thể tích 10μl trong 990μl dung dịch đệm liên kết hoặc metanol, và thu thập phổ hấp thụ ngay lập tức để giảm thiểu sự phân hủy BChl. Hàm lượng BChl của mỗi mẫu metanol được tính bằng hệ số hấp thụ ở 771 nm là 54,8 mM-1 cm-1, và hệ số hấp thụ được xác định (51). Chia nồng độ BChl đo được cho 32 (RC-LH114-W) hoặc 36 (RC-LH116) để xác định nồng độ phức chất lõi, sau đó được sử dụng để xác định phổ hấp thụ của cùng một mẫu được thu thập trong dung dịch đệm. Hệ số hấp thụ song song. Ba phép đo lặp lại được thực hiện cho mỗi mẫu, và độ hấp thụ trung bình của BChl Qy tối đa được sử dụng để tính toán. Hệ số hấp thụ của RC-LH114-W đo được ở bước sóng 878 nm là 3280±140 mM-1 cm-1, trong khi hệ số hấp thụ của RC-LH116 đo được ở bước sóng 880 nm là 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 được định lượng theo phương pháp trong (52). Tóm lại, HPLC pha ngược (RP-HPLC) được thực hiện bằng hệ thống HPLC Agilent 1200. Hòa tan khoảng 0,02 nmol RC-LH116 hoặc RC-LH114-W trong 50μl methanol:chloroform 50:50 chứa 0,02% (w/v) ferric chloride, và tiêm Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm đã được cân bằng trước với tốc độ 1 ml-1 min-1 ở 40°C trong dung môi HPLC (methanol:2-propanol 80:20) vào cột ×25 cm. Thực hiện rửa giải đẳng tốc trong dung môi HPLC để theo dõi độ hấp thụ ở 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoid) và 780 nm (BChl) trong 1 giờ. Đỉnh trên sắc ký đồ 275 nm ở phút 25,5 được tích phân, và không chứa bất kỳ hợp chất nào khác có thể phát hiện được. Diện tích tích phân được sử dụng để tính toán lượng mol UQ10 được chiết xuất dựa trên đường cong hiệu chuẩn được tính toán từ việc tiêm các chất chuẩn tinh khiết từ 0 đến 5,8 nmol (Hình S14). Mỗi mẫu được phân tích ba lần lặp lại, và sai số được báo cáo tương ứng với độ lệch chuẩn của giá trị trung bình.
Một dung dịch chứa phức hợp RC-LH1 với độ hấp thụ Qy tối đa là 0,1 được pha chế với 30 μM cytochrome c2 khử từ tim ngựa (Merck, Anh) và 0 đến 50 μMUQ2 (Merck, Anh). Ba mẫu 1 ml được chuẩn bị ở mỗi nồng độ UQ2 và ủ qua đêm trong bóng tối ở 4°C để đảm bảo thích nghi hoàn toàn với bóng tối trước khi đo. Dung dịch được nạp vào máy quang phổ mô-đun OLIS RSM1000 được trang bị cách tử ngọn lửa 300 nm/500 vạch, khe hở đầu vào 1,24 mm, khe hở giữa 0,12 mm và khe hở đầu ra 0,6 mm. Một bộ lọc thông dải dài 600 nm được đặt ở đầu vào của ống quang mẫu và ống nhân quang tham chiếu để loại trừ ánh sáng kích thích. Độ hấp thụ được theo dõi ở bước sóng 550 nm với thời gian tích hợp là 0,15 s. Ánh sáng kích thích được phát ra từ đèn LED M880F2 880 nm (Thorlabs Ltd., Anh) thông qua cáp quang với cường độ 90% qua bộ điều khiển DC2200 (Thorlabs Ltd., Anh) và được chiếu vào nguồn sáng ở góc 90°. Chùm tia đo được đặt ngược hướng với gương để phản xạ lại bất kỳ ánh sáng nào ban đầu không được mẫu hấp thụ. Theo dõi độ hấp thụ 10 giây trước khi chiếu sáng 50 giây. Sau đó, độ hấp thụ được tiếp tục theo dõi trong 60 giây trong bóng tối để đánh giá mức độ quinolol tự động khử cytochrome c23+ (xem Hình S8 để biết dữ liệu thô).
Dữ liệu được xử lý bằng cách khớp một tốc độ ban đầu tuyến tính trong khoảng thời gian từ 0,5 đến 10 giây (tùy thuộc vào nồng độ UQ2) và tính trung bình tốc độ của cả ba mẫu ở mỗi nồng độ UQ2. Nồng độ RC-LH1 được tính toán bằng hệ số hấp thụ tương ứng được sử dụng để chuyển đổi tốc độ thành hiệu suất xúc tác, được vẽ đồ thị trong Origin Pro 2019 (OriginLab, Hoa Kỳ), và được khớp với mô hình Michaelis-Menten để xác định các giá trị Km và Kcat biểu kiến.
Đối với các phép đo hấp thụ thoáng qua, mẫu RC-LH1 được pha loãng đến nồng độ ~2μM trong dung dịch đệm IMAC chứa 50 mM natri ascorbat (Merck, Hoa Kỳ) và 0,4 mM Terbutin (Merck, Hoa Kỳ). Axit ascorbic được sử dụng làm chất cho electron hy sinh, và tert-butaclofen được sử dụng làm chất ức chế QB để đảm bảo chất cho RC chính vẫn ở dạng khử (tức là không bị oxy hóa quang học) trong suốt quá trình đo. Khoảng 3 ml mẫu được thêm vào một buồng quay tùy chỉnh (đường kính khoảng 0,1 m, 350 vòng/phút) với chiều dài đường truyền quang học 2 mm để đảm bảo mẫu trong đường đi của laser có đủ thời gian thích nghi trong bóng tối giữa các xung kích thích. Sử dụng các xung laser ~100 fs để khuếch đại hệ thống laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, Hoa Kỳ) nhằm kích thích mẫu ở bước sóng 880 nm với tần số lặp lại 1 kHz (20 nJ cho vùng cận hồng ngoại hoặc 100 nJ cho vùng khả kiến). Trước khi thu thập dữ liệu, hãy chiếu ánh sáng kích thích lên mẫu trong khoảng 30 phút. Việc chiếu sáng sẽ gây ra hiện tượng bất hoạt QA (có thể làm giảm hoạt tính QA xuống một hoặc hai lần). Tuy nhiên, xin lưu ý rằng quá trình này có thể đảo ngược vì sau một thời gian dài thích nghi trong bóng tối, RC sẽ từ từ trở lại hoạt tính QA. Máy quang phổ Helios (Ultrafast Systems, Hoa Kỳ) được sử dụng để đo phổ thoáng qua với thời gian trễ từ -10 đến 7000 ps. Sử dụng phần mềm Surface Xplorer (Ultrafast Systems, Hoa Kỳ) để tách nhóm các tập dữ liệu, sau đó hợp nhất và chuẩn hóa. Sử dụng gói phần mềm CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) để sử dụng tập dữ liệu kết hợp nhằm thu được phổ vi sai liên quan đến sự phân rã, hoặc sử dụng một hàm tích chập nhiều số mũ với đáp ứng của thiết bị để phù hợp với sự tiến hóa phổ đơn bước sóng trong Origin (OriginLab, Hoa Kỳ).
Như đã đề cập ở trên (53), một màng quang hợp chứa phức hợp LH1 thiếu cả RC và anten LH2 ngoại vi đã được chuẩn bị. Màng được pha loãng trong 20 mM tris (pH 8.0) và sau đó được đưa vào một cuvette thạch anh có đường dẫn quang học 2 mm. Một xung laser 30 nJ được sử dụng để kích thích mẫu ở bước sóng 540 nm với thời gian trễ từ -10 đến 7000 ps. Xử lý tập dữ liệu như đã mô tả cho mẫu Rps. pal.
Màng được lắng bằng cách ly tâm ở 150.000 RCF trong 2 giờ ở 4°C, sau đó độ hấp thụ ở 880 nm của nó được hòa tan lại trong 20 mM tris-HCl (pH 8,0) và 200 mM NaCl. Hòa tan màng bằng cách khuấy chậm trong 2% (w/v) β-DDM trong 1 giờ trong bóng tối ở 4°C. Mẫu được pha loãng trong 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8,0) (TEAB; Merck, Anh) đến nồng độ protein là 2,5 mg ml-1 (phân tích Bio-Rad). Quá trình xử lý tiếp theo được thực hiện theo phương pháp đã công bố trước đây (54), bắt đầu bằng việc pha loãng 50 μg protein vào tổng cộng 50 μl TEAB chứa 1% (w/v) natri laurat (Merck, Anh). Sau khi siêu âm trong 60 giây, mẫu được khử bằng 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, Anh) ở 37°C trong 30 phút. Để S-alkyl hóa, ủ mẫu với 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, Anh) và thêm từ dung dịch gốc isopropanol 200 mM trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Quá trình tiêu hóa protein được thực hiện bằng cách thêm 2 μg hỗn hợp trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega, Anh) và ủ ở 37°C trong 3 giờ. Chất hoạt động bề mặt laurat được chiết xuất bằng cách thêm 50 μl ethyl acetate và 10 μl axit trifluoroacetic (TFA) loại LC 10% (v/v; Thermo Fisher Scientific, Anh) và khuấy đều trong 60 giây. Quá trình tách pha được thúc đẩy bằng ly tâm ở 15.700 RCF trong 5 phút. Theo quy trình của nhà sản xuất, cột ly tâm C18 (Thermo Fisher Scientific, Anh) được sử dụng để hút và khử muối cẩn thận pha dưới chứa peptide. Sau khi làm khô bằng ly tâm chân không, mẫu được hòa tan trong 0,5% TFA và 3% acetonitrile, và 500 ng được phân tích bằng sắc ký pha đảo nano kết hợp với phổ khối lượng sử dụng các thông số hệ thống đã được mô tả chi tiết trước đó.
Sử dụng MaxQuant v.1.5.3.30 (56) để xác định và định lượng protein nhằm tìm kiếm cơ sở dữ liệu proteome của Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Dữ liệu proteomics khối phổ đã được gửi vào Liên minh ProteomeXchange thông qua kho lưu trữ đối tác PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) với mã định danh tập dữ liệu PXD020402.
Để phân tích bằng RPLC kết hợp với phép đo phổ khối ion hóa phun điện, phức hợp RC-LH1 được chuẩn bị từ Rps kiểu hoang dã. Sử dụng phương pháp đã được công bố trước đây (16), nồng độ protein được tạo ra trong tế bào palustris là 2 mg ml-1 trong 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl và 0,03% (w/v) β- (phân tích Bio-Rad) ) DDM. Theo quy trình của nhà sản xuất, sử dụng bộ dụng cụ tinh chế 2D (GE Healthcare, Hoa Kỳ) để chiết xuất 10 μg protein bằng phương pháp kết tủa và hòa tan kết tủa trong 20 μl axit formic (FA) 60% (v/v), Acetonitrile 20% (v/v) và nước 20% (v/v). Năm microlít được phân tích bằng RPLC (Dionex RSLC) kết hợp với phép đo phổ khối (Maxis UHR-TOF, Bruker). Sử dụng cột MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Anh) để tách ở 60°C và 100μl/phút, với gradient từ 85% (v/v) dung môi A [0,1% (v/v) FA và 0,02% (v/v) TFA trong nước] đến 85% (v/v) dung môi B [0,1% (v/v) FA và 0,02% (v/v) TFA trong 90% (v/v) acetonitrile]. Sử dụng nguồn ion hóa phun điện tiêu chuẩn và các thông số mặc định trong hơn 60 phút, máy quang phổ khối thu được dải khối lượng từ 100 đến 2750 m/z (tỷ lệ khối lượng trên điện tích). Với sự trợ giúp của công cụ FindPept từ cổng thông tin sinh học ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), hãy ánh xạ phổ khối lượng đến các tiểu đơn vị của phức hợp.
Các tế bào được nuôi cấy trong 72 giờ dưới 100 ml NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) hoặc high (300μMm-2 s-1) ánh sáng. Môi trường M22 (môi trường M22 trong đó amoni sulfat bị loại bỏ và natri succinat được thay thế bằng natri axetat) trong chai có nắp vặn 100 ml (23). Trong năm chu kỳ 30 giây, các hạt thủy tinh 0,1 micron được thêm vào với tỷ lệ thể tích 1:1 để làm tan tế bào và làm lạnh trên đá trong 5 phút. Chất không tan, tế bào không bị vỡ và các hạt thủy tinh được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 16.000 RCF trong 10 phút trong máy ly tâm vi mô để bàn. Màng được tách trong rotor Ti 70.1 với tốc độ quay 100.000 RCF trong dung dịch tris-HCl 20 mM (pH 8.0) với gradient sucrose 40/15% (w/w) trong 10 giờ.
Như đã mô tả trong công trình trước đây của chúng tôi, phát hiện miễn dịch thẻ His trên PufW (16). Tóm lại, phức hợp lõi tinh khiết (11,8 nM) hoặc màng chứa cùng nồng độ RC (được xác định bằng cách oxy hóa trừ đi phổ khác biệt đã khử và khớp với tải trên gel nhuộm) trong dung dịch đệm tải SDS 2x (Merck, Anh) được pha loãng hai lần. Các protein được tách trên gel NuPage bis-tris 12% bản sao (Thermo Fisher Scientific, Anh). Gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Anh) để tải và hiển thị tiểu đơn vị RC-L. Protein trên gel thứ hai được chuyển sang màng polyvinylidene fluoride (PVDF) hoạt hóa bằng methanol (Thermo Fisher Scientific, Anh) để xét nghiệm miễn dịch. Màng PVDF được chặn bằng dung dịch gồm 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 và 5% (w/v) sữa bột tách kem, sau đó được ủ với kháng thể chính anti-His (pha loãng trong dung dịch đệm kháng thể [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl và 0,05% (v/v) Tween-20] theo tỷ lệ 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) trong 4 giờ. Sau khi rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút trong dung dịch đệm kháng thể, màng được kết hợp với kháng thể thứ cấp kháng chuột liên hợp với peroxidase cải ngựa (Sigma-Aldrich, Anh) (pha loãng 1:10.000 trong dung dịch đệm kháng thể). Ủ để phát hiện (5 phút sau 3 lần rửa trong dung dịch đệm kháng thể) bằng chất nền phát quang hóa học WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Ý) và máy chụp ảnh Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Anh).
Bằng cách vẽ phân bố cường độ của từng gel nhuộm hoặc làn xét nghiệm miễn dịch, tích hợp diện tích dưới đỉnh và tính toán tỷ lệ cường độ của RC-L (gel nhuộm) và Protein-W (xét nghiệm miễn dịch), trong ImageJ (57) Xử lý hình ảnh. Các tỷ lệ này được chuyển đổi thành tỷ lệ mol bằng cách giả định rằng tỷ lệ RC-L so với protein-W trong mẫu RC-LH114-W tinh khiết là 1:1 và chuẩn hóa toàn bộ tập dữ liệu cho phù hợp.
Để xem tài liệu bổ sung cho bài viết này, vui lòng truy cập http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Đây là bài báo được truy cập mở và phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Ghi công của Creative Commons. Bài báo cho phép sử dụng, phân phối và sao chép không hạn chế trên mọi phương tiện với điều kiện tác phẩm gốc được trích dẫn đúng cách.
Lưu ý: Chúng tôi chỉ yêu cầu bạn cung cấp địa chỉ email để người mà bạn giới thiệu đến trang này biết rằng bạn muốn họ xem email đó và đó không phải là thư rác. Chúng tôi sẽ không thu thập bất kỳ địa chỉ email nào.
Câu hỏi này được sử dụng để kiểm tra xem bạn có phải là khách truy cập hay không và ngăn chặn việc gửi thư rác tự động.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Cấu trúc độ phân giải cao của phức hợp bẫy ánh sáng 1 trong trung tâm phản ứng cung cấp những hiểu biết mới về động lực học của quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Cấu trúc độ phân giải cao của phức hợp bẫy ánh sáng 1 trong trung tâm phản ứng cung cấp những hiểu biết mới về động lực học của quinone.
©2021 Hiệp hội vì sự tiến bộ của khoa học Hoa Kỳ. mọi quyền được bảo lưu. AAAS là đối tác của HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef và COUNTER. Khoa học nâng cao ISSN 2375-2548.