Bài viết này là một phần của đề tài nghiên cứu “Các công nghệ xử lý sinh học tiên tiến và quy trình tái chế hợp chất hữu cơ tổng hợp (SOC)”. Xem tất cả 14 bài viết
Các hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene và các dẫn xuất naphthalene (methylnaphthalene, axit naphthoic, 1-naphthyl-N-methylcarbamate, v.v.) được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp và có khả năng gây độc gen, đột biến và/hoặc gây ung thư cho sinh vật. Những hợp chất hữu cơ tổng hợp (SOC) hay chất ngoại lai này được coi là chất ô nhiễm ưu tiên và gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với môi trường toàn cầu và sức khỏe cộng đồng. Cường độ hoạt động của con người (ví dụ: khí hóa than, lọc dầu, khí thải xe cộ và ứng dụng nông nghiệp) quyết định nồng độ, số phận và sự vận chuyển của các hợp chất phổ biến và bền vững này. Bên cạnh các phương pháp xử lý/loại bỏ vật lý và hóa học, các công nghệ xanh và thân thiện với môi trường như xử lý sinh học, sử dụng vi sinh vật có khả năng phân hủy hoàn toàn các PAH hoặc chuyển đổi chúng thành các sản phẩm phụ không độc hại, đã nổi lên như một giải pháp thay thế an toàn, tiết kiệm chi phí và đầy hứa hẹn. Nhiều loài vi khuẩn thuộc các ngành Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia và Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus và Paenibacillus) và Actinobacteria (Rhodococcus và Arthrobacter) trong hệ vi sinh vật đất đã chứng minh khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ khác nhau. Các nghiên cứu về chuyển hóa, hệ gen học và phân tích siêu hệ gen giúp chúng ta hiểu được sự phức tạp và đa dạng của quá trình dị hóa ở những dạng sống đơn giản này, từ đó có thể được ứng dụng để phân hủy sinh học hiệu quả. Sự tồn tại lâu dài của PAH đã dẫn đến sự xuất hiện các kiểu hình phân hủy mới thông qua chuyển gen ngang bằng cách sử dụng các yếu tố di truyền như plasmid, transposon, thể thực khuẩn, đảo hệ gen và các yếu tố liên hợp tích hợp. Sinh học hệ thống và kỹ thuật di truyền của các chủng phân lập cụ thể hoặc các quần thể mô hình (liên hợp) có thể cho phép xử lý sinh học toàn diện, nhanh chóng và hiệu quả các PAH này thông qua các hiệu ứng hiệp đồng. Trong bài đánh giá này, chúng tôi tập trung vào các con đường trao đổi chất khác nhau và sự đa dạng, thành phần và sự đa dạng di truyền, cũng như các phản ứng/thích nghi tế bào của vi khuẩn phân hủy naphthalene và các dẫn xuất naphthalene. Điều này sẽ cung cấp thông tin sinh thái cho ứng dụng thực địa và tối ưu hóa chủng vi sinh vật để xử lý sinh học hiệu quả.
Sự phát triển nhanh chóng của các ngành công nghiệp (hóa dầu, nông nghiệp, dược phẩm, thuốc nhuộm dệt, mỹ phẩm, v.v.) đã góp phần vào sự thịnh vượng kinh tế toàn cầu và nâng cao mức sống. Sự phát triển theo cấp số nhân này đã dẫn đến việc sản xuất một lượng lớn các hợp chất hữu cơ tổng hợp (SOC), được sử dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau. Các hợp chất ngoại lai hay SOC này bao gồm hydrocarbon thơm đa vòng (PAH), thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, chất hóa dẻo, thuốc nhuộm, dược phẩm, organophosphate, chất chống cháy, dung môi hữu cơ dễ bay hơi, v.v. Chúng được thải vào khí quyển, hệ sinh thái thủy sinh và trên cạn, nơi chúng gây ra những tác động đa chiều, gây ảnh hưởng bất lợi đến nhiều dạng sinh vật thông qua việc làm thay đổi các tính chất lý hóa và cấu trúc cộng đồng (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Nhiều chất ô nhiễm thơm có tác động mạnh mẽ và tàn phá đến nhiều hệ sinh thái nguyên vẹn/điểm nóng đa dạng sinh học (ví dụ: rạn san hô, các tảng băng ở Bắc Cực/Nam Cực, hồ trên núi cao, trầm tích đáy biển sâu, v.v.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Các nghiên cứu địa vi sinh vật gần đây đã chỉ ra rằng sự lắng đọng của chất hữu cơ tổng hợp (ví dụ: chất ô nhiễm thơm) và các dẫn xuất của chúng trên bề mặt các công trình nhân tạo (môi trường xây dựng) (ví dụ: các di tích văn hóa và tượng đài làm bằng đá granit, đá, gỗ và kim loại) làm tăng tốc độ xuống cấp của chúng (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Hoạt động của con người có thể làm tăng cường và trầm trọng thêm sự xuống cấp sinh học của các di tích và công trình kiến ​​trúc thông qua ô nhiễm không khí và biến đổi khí hậu (Liu et al. 2020). Các chất ô nhiễm hữu cơ này phản ứng với hơi nước trong khí quyển và lắng đọng trên cấu trúc, gây ra sự xuống cấp vật lý và hóa học của vật liệu. Phân hủy sinh học được hiểu rộng rãi là những thay đổi không mong muốn về hình thức và tính chất của vật liệu do các sinh vật sống gây ra, ảnh hưởng đến quá trình bảo tồn (Pochon và Jaton, 1967). Hoạt động của vi sinh vật (quá trình trao đổi chất) của các hợp chất này có thể làm giảm tính toàn vẹn cấu trúc, hiệu quả bảo tồn và giá trị văn hóa (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Mặt khác, trong một số trường hợp, sự thích nghi và phản ứng của vi sinh vật đối với các cấu trúc này lại được coi là có lợi vì chúng tạo thành màng sinh học và các lớp vỏ bảo vệ khác, làm giảm tốc độ phân hủy (Martino, 2016). Do đó, việc phát triển các chiến lược bảo tồn bền vững lâu dài hiệu quả cho các công trình bằng đá, kim loại và gỗ đòi hỏi sự hiểu biết thấu đáo về các quá trình chính liên quan đến quá trình này. So với các quá trình tự nhiên (quá trình địa chất, cháy rừng, phun trào núi lửa, phản ứng của thực vật và vi khuẩn), hoạt động của con người dẫn đến việc giải phóng một lượng lớn hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) và các carbon hữu cơ (OC) khác vào hệ sinh thái. Nhiều PAH được sử dụng trong nông nghiệp (thuốc trừ sâu và thuốc diệt côn trùng như DDT, atrazine, carbaryl, pentachlorophenol, v.v.), công nghiệp (dầu thô, bùn/chất thải dầu mỏ, nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, PCB, chất hóa dẻo, chất tẩy rửa, chất khử trùng, chất xông hơi, hương liệu và chất bảo quản), sản phẩm chăm sóc cá nhân (kem chống nắng, chất khử trùng, thuốc chống côn trùng và xạ hương đa vòng) và đạn dược (chất nổ như 2,4,6-TNT) là những chất ngoại lai tiềm tàng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe hành tinh (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna và Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Danh sách này có thể được mở rộng để bao gồm các hợp chất có nguồn gốc từ dầu mỏ (dầu nhiên liệu, chất bôi trơn, asphaltenes), nhựa sinh học có trọng lượng phân tử cao và chất lỏng ion (Amde et al., 2015). Bảng 1 liệt kê các chất ô nhiễm thơm khác nhau và ứng dụng của chúng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong những năm gần đây, lượng phát thải các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi do con người gây ra, cũng như carbon dioxide và các khí nhà kính khác, đã bắt đầu gia tăng (Dvorak et al., 2017). Tuy nhiên, tác động của con người vượt trội hơn đáng kể so với tác động tự nhiên. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng một số hợp chất hữu cơ bền vững (SOC) tồn tại trong nhiều môi trường và đã được xác định là các chất ô nhiễm mới nổi có tác động bất lợi đến hệ sinh thái (Hình 1). Các cơ quan môi trường như Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (USEPA) đã đưa nhiều chất ô nhiễm này vào danh sách ưu tiên do đặc tính gây độc tế bào, gây đột biến gen, gây đột biến và gây ung thư của chúng. Do đó, cần có các quy định xử lý nghiêm ngặt và các chiến lược hiệu quả để xử lý/loại bỏ chất thải khỏi các hệ sinh thái bị ô nhiễm. Nhiều phương pháp xử lý vật lý và hóa học như nhiệt phân, xử lý nhiệt oxy hóa, sục khí, chôn lấp, đốt rác, v.v. đều không hiệu quả, tốn kém và tạo ra các sản phẩm phụ ăn mòn, độc hại và khó xử lý. Với nhận thức ngày càng tăng về môi trường toàn cầu, các vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất ô nhiễm này và các dẫn xuất của chúng (như halogen hóa, nitro, alkyl và/hoặc methyl) đang thu hút sự chú ý ngày càng lớn (Fennell et al., 2004; Haritash và Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Việc sử dụng các vi sinh vật bản địa này, riêng lẻ hoặc trong các quần thể hỗn hợp (cụm vi sinh vật), để loại bỏ các chất ô nhiễm thơm có nhiều ưu điểm về an toàn môi trường, chi phí, hiệu quả, tính bền vững và năng suất. Các nhà nghiên cứu cũng đang khám phá sự tích hợp các quy trình vi sinh với các phương pháp điện hóa khử oxy hóa, cụ thể là hệ thống điện hóa sinh học (BES), như một công nghệ đầy hứa hẹn để xử lý/loại bỏ chất ô nhiễm (Huang et al., 2011). Công nghệ BES ngày càng thu hút sự chú ý nhờ hiệu quả cao, chi phí thấp, an toàn môi trường, hoạt động ở nhiệt độ phòng, vật liệu tương thích sinh học và khả năng thu hồi các sản phẩm phụ có giá trị (ví dụ: điện, nhiên liệu và hóa chất) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Sự ra đời của công nghệ giải trình tự gen tốc độ cao và các công cụ/phương pháp omics đã cung cấp một lượng lớn thông tin mới về điều hòa gen, proteomics và fluxomics của các phản ứng của các vi sinh vật phân hủy khác nhau. Việc kết hợp các công cụ này với sinh học hệ thống đã giúp chúng ta hiểu rõ hơn về việc lựa chọn và tinh chỉnh các con đường dị hóa mục tiêu trong vi sinh vật (tức là thiết kế trao đổi chất) để đạt được hiệu quả phân hủy sinh học. Để thiết kế các chiến lược xử lý sinh học hiệu quả bằng cách sử dụng các vi sinh vật ứng cử viên phù hợp, chúng ta cần hiểu tiềm năng sinh hóa, sự đa dạng trao đổi chất, thành phần di truyền và sinh thái học (tự sinh thái học/sinh thái học cộng sinh) của vi sinh vật.
Hình 1. Nguồn gốc và con đường lan truyền của các PAH phân tử thấp qua các môi trường khác nhau và các yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến sinh vật. Các đường nét đứt thể hiện sự tương tác giữa các yếu tố hệ sinh thái.
Trong bài tổng quan này, chúng tôi đã cố gắng tóm tắt dữ liệu về sự phân hủy các PAH đơn giản như naphthalene và các dẫn xuất naphthalene bởi các chủng vi khuẩn khác nhau, bao gồm các con đường trao đổi chất và sự đa dạng, các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy, thành phần/nội dung và sự đa dạng của gen, phản ứng tế bào và các khía cạnh khác nhau của quá trình xử lý sinh học. Hiểu biết ở cấp độ sinh hóa và phân tử sẽ giúp xác định các chủng vi khuẩn chủ phù hợp và việc kỹ thuật di truyền tiếp theo của chúng để xử lý sinh học hiệu quả các chất ô nhiễm ưu tiên này. Điều này sẽ giúp phát triển các chiến lược để thiết lập các quần thể vi khuẩn đặc thù tại địa điểm cụ thể nhằm xử lý sinh học hiệu quả.
Sự hiện diện của một lượng lớn các hợp chất thơm độc hại và nguy hiểm (thỏa mãn quy tắc Huckel 4n + 2π electron, n = 1, 2, 3, …) gây ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với nhiều môi trường khác nhau như không khí, đất, trầm tích, nước mặt và nước ngầm (Puglisi et al., 2007). Các hợp chất này có vòng benzen đơn (đơn vòng) hoặc nhiều vòng benzen (đa vòng) được sắp xếp theo dạng tuyến tính, góc cạnh hoặc cụm và thể hiện tính ổn định (ổn định/không ổn định) trong môi trường do năng lượng cộng hưởng âm cao và tính trơ (trơ), điều này có thể được giải thích bởi tính kỵ nước và trạng thái khử của chúng. Khi vòng thơm được thay thế thêm bằng các nhóm metyl (-CH3), cacboxyl (-COOH), hydroxyl (-OH) hoặc sunfonat (-HSO3), nó trở nên ổn định hơn, có ái lực mạnh hơn với các đại phân tử và tích lũy sinh học trong hệ thống sinh học (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Một số hydrocarbon thơm đa vòng có trọng lượng phân tử thấp (LMWAHs), chẳng hạn như naphthalene và các dẫn xuất của nó [metylnaphthalene, axit naphthoic, naphthalenesulfonat và 1-naphthyl N-metylcarbamate (carbaryl)], đã được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ đưa vào danh sách các chất ô nhiễm hữu cơ ưu tiên vì có khả năng gây độc gen, gây đột biến và/hoặc gây ung thư (Cerniglia, 1984). Việc thải loại NM-PAH này vào môi trường có thể dẫn đến sự tích lũy sinh học của các hợp chất này ở tất cả các cấp độ của chuỗi thức ăn, do đó ảnh hưởng đến sức khỏe của hệ sinh thái (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Nguồn gốc và con đường lây lan của PAH đến sinh vật chủ yếu thông qua sự di chuyển và tương tác giữa các thành phần khác nhau của hệ sinh thái như đất, nước ngầm, nước mặt, cây trồng và khí quyển (Arey và Atkinson, 2003). Hình 1 minh họa sự tương tác và phân bố của các PAH có trọng lượng phân tử thấp khác nhau trong hệ sinh thái và con đường lây lan của chúng đến sinh vật/con người. PAH lắng đọng trên bề mặt do ô nhiễm không khí và thông qua sự di chuyển (trôi dạt) của khí thải phương tiện giao thông, khí thải công nghiệp (khí hóa than, đốt cháy và sản xuất than cốc) và sự lắng đọng của chúng. Các hoạt động công nghiệp như sản xuất dệt may tổng hợp, thuốc nhuộm và sơn; bảo quản gỗ; chế biến cao su; sản xuất xi măng; sản xuất thuốc trừ sâu; và ứng dụng nông nghiệp là những nguồn chính gây ô nhiễm PAH trong hệ thống trên cạn và dưới nước (Bamforth và Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đất ở khu vực ngoại ô và đô thị, gần đường cao tốc và ở các thành phố lớn dễ bị nhiễm hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) hơn do khí thải từ các nhà máy điện, hệ thống sưởi ấm nhà ở, tải trọng giao thông đường bộ và đường hàng không, và các hoạt động xây dựng (Suman et al., 2016). (2008) đã chỉ ra rằng nồng độ PAH trong đất gần đường ở New Orleans, Louisiana, Hoa Kỳ cao tới 7189 μg/kg, trong khi ở không gian mở, chúng chỉ là 2404 μg/kg. Tương tự, mức PAH cao tới 300 μg/kg đã được báo cáo ở các khu vực gần các địa điểm khí hóa than ở một số thành phố của Hoa Kỳ (Kanaly và Harayama, 2000; Bamforth và Singleton, 2005). Đất từ ​​nhiều thành phố khác nhau của Ấn Độ như Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni và Venkataraman, 2000) và Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) được báo cáo là chứa nồng độ PAH cao. Các hợp chất thơm dễ dàng được hấp phụ lên các hạt đất, chất hữu cơ và khoáng sét, do đó trở thành các bể chứa carbon chính trong hệ sinh thái (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Các nguồn chính của PAH trong hệ sinh thái thủy sinh là lượng mưa (mưa ướt/khô và hơi nước), dòng chảy đô thị, xả nước thải, bổ sung nước ngầm, v.v. (Srogi, 2007). Người ta ước tính rằng khoảng 80% PAH trong hệ sinh thái biển có nguồn gốc từ lượng mưa, lắng đọng và xả thải (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Nồng độ PAH cao hơn trong nước mặt hoặc nước rỉ từ các bãi thải chất thải rắn cuối cùng sẽ rò rỉ vào nước ngầm, gây ra mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng vì hơn 70% dân số ở Nam và Đông Nam Á sử dụng nước ngầm (Duttagupta et al., 2019). Một nghiên cứu gần đây của Duttagupta et al. (2020) về phân tích sông (32) và nước ngầm (235) từ Tây Bengal, Ấn Độ, cho thấy ước tính 53% cư dân thành thị và 44% cư dân nông thôn (tổng cộng 20 triệu cư dân) có thể tiếp xúc với naphthalene (4,9–10,6 μg/L) và các dẫn xuất của nó. Các mô hình sử dụng đất khác nhau và việc khai thác nước ngầm tăng lên được coi là các yếu tố chính kiểm soát sự vận chuyển thẳng đứng (đối lưu) của PAH có trọng lượng phân tử thấp trong lòng đất. Nước chảy tràn từ nông nghiệp, nước thải sinh hoạt và công nghiệp, và chất thải rắn/rác thải đã được chứng minh là bị ảnh hưởng bởi PAH trong lưu vực sông và trầm tích dưới lòng đất. Lượng mưa trong khí quyển càng làm trầm trọng thêm tình trạng ô nhiễm PAH. Nồng độ cao của PAH và các dẫn xuất alkyl của chúng (tổng cộng 51 chất) đã được báo cáo ở các sông/lưu vực trên toàn thế giới, chẳng hạn như sông Fraser, sông Louan, sông Denso, sông Missouri, sông Anacostia, sông Ebro và sông Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Trong trầm tích lưu vực sông Hằng, naphthalene và phenanthrene được phát hiện là những chất quan trọng nhất (có trong 70% mẫu) (Duttagupta et al., 2019). Hơn nữa, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc khử trùng nước uống bằng clo có thể dẫn đến sự hình thành các PAH chứa oxy và clo độc hại hơn (Manoli và Samara, 1999). PAH tích tụ trong ngũ cốc, trái cây và rau quả do cây hấp thụ từ đất, nước ngầm và nước mưa bị ô nhiễm (Fismes et al., 2002). Nhiều sinh vật thủy sinh như cá, trai, sò và tôm bị nhiễm PAH thông qua việc tiêu thụ thực phẩm và nước biển bị ô nhiễm, cũng như qua mô và da (Mackay và Fraser, 2000). Các phương pháp nấu/chế biến như nướng, quay, hun khói, chiên, sấy khô, nướng bánh và nấu bằng than cũng có thể dẫn đến lượng PAH đáng kể trong thực phẩm. Điều này phần lớn phụ thuộc vào việc lựa chọn vật liệu hun khói, hàm lượng hydrocarbon phenolic/thơm, quy trình nấu, loại thiết bị sưởi, hàm lượng độ ẩm, lượng oxy cung cấp và nhiệt độ đốt cháy (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) cũng đã được phát hiện trong sữa ở các nồng độ khác nhau (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Sự tích tụ các PAH này trong thực phẩm cũng phụ thuộc vào các đặc tính lý hóa của thực phẩm, trong khi tác động độc hại của chúng liên quan đến các chức năng sinh lý, hoạt động trao đổi chất, sự hấp thụ, phân bố và phân bố trong cơ thể (Mechini et al., 2011).
Tính độc hại và tác hại của các hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) đã được biết đến từ lâu (Cherniglia, 1984). Các hydrocarbon thơm đa vòng có trọng lượng phân tử thấp (LMW-PAH) (hai đến ba vòng) có thể liên kết cộng hóa trị với nhiều đại phân tử khác nhau như DNA, RNA và protein và có khả năng gây ung thư (Santarelli và cộng sự, 2008). Do bản chất kỵ nước, chúng được ngăn cách bởi màng lipid. Ở người, các monooxygenase cytochrome P450 oxy hóa PAH thành epoxide, một số trong đó có tính phản ứng cao (ví dụ: baediol epoxide) và có thể dẫn đến sự biến đổi các tế bào bình thường thành tế bào ác tính (Marston và cộng sự, 2001). Ngoài ra, các sản phẩm chuyển hóa của PAH như quinone, phenol, epoxide, diol, v.v. còn độc hại hơn cả các hợp chất ban đầu. Một số PAH và các chất trung gian chuyển hóa của chúng có thể ảnh hưởng đến hormone và các enzyme khác nhau trong quá trình trao đổi chất, do đó ảnh hưởng xấu đến sự tăng trưởng, hệ thần kinh trung ương, hệ sinh sản và hệ miễn dịch (Swetha và Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Tiếp xúc ngắn hạn với PAH có trọng lượng phân tử thấp được báo cáo là gây suy giảm chức năng phổi và huyết khối ở người mắc bệnh hen suyễn và làm tăng nguy cơ ung thư da, phổi, bàng quang và đường tiêu hóa (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Các nghiên cứu trên động vật cũng cho thấy rằng việc tiếp xúc với PAH có thể gây ra những tác động bất lợi đến chức năng sinh sản và sự phát triển, đồng thời có thể gây đục thủy tinh thể, tổn thương thận và gan, và vàng da. Nhiều sản phẩm chuyển hóa sinh học của PAH như diol, epoxide, quinone và các gốc tự do (cation) đã được chứng minh là tạo thành các chất cộng hợp với DNA. Các chất cộng hợp bền vững đã được chứng minh là làm thay đổi bộ máy sao chép DNA, trong khi các chất cộng hợp không bền vững có thể làm mất purin trong DNA (chủ yếu thành adenine và đôi khi thành guanine); cả hai đều có thể tạo ra lỗi dẫn đến đột biến (Schweigert và cộng sự 2001). Ngoài ra, quinone (benzo-/pan-) có thể tạo ra các gốc oxy phản ứng (ROS), gây tổn thương nghiêm trọng cho DNA và các đại phân tử khác, do đó ảnh hưởng đến chức năng/khả năng sống của mô (Ewa và Danuta 2017). Tiếp xúc mãn tính với nồng độ thấp của pyrene, biphenyl và naphthalene đã được báo cáo là gây ung thư ở động vật thí nghiệm (Diggs và cộng sự 2012). Do độc tính gây chết người của chúng, việc làm sạch/loại bỏ các PAH này khỏi các khu vực bị ảnh hưởng/ô nhiễm là một ưu tiên hàng đầu.
Nhiều phương pháp vật lý và hóa học đã được sử dụng để loại bỏ PAH khỏi các địa điểm/môi trường bị ô nhiễm. Các quy trình như đốt, khử clo, oxy hóa bằng tia cực tím, cố định và chiết xuất bằng dung môi có nhiều nhược điểm, bao gồm sự hình thành các sản phẩm phụ độc hại, độ phức tạp của quy trình, các vấn đề về an toàn và quy định, hiệu quả thấp và chi phí cao. Tuy nhiên, phân hủy sinh học bằng vi sinh vật (gọi là xử lý sinh học) là một phương pháp thay thế đầy hứa hẹn, liên quan đến việc sử dụng vi sinh vật dưới dạng nuôi cấy thuần chủng hoặc khuẩn lạc. So với các phương pháp vật lý và hóa học, quy trình này thân thiện với môi trường, không xâm lấn, tiết kiệm chi phí và bền vững. Xử lý sinh học có thể được thực hiện tại địa điểm bị ảnh hưởng (tại chỗ) hoặc tại một địa điểm được chuẩn bị đặc biệt (ngoài chỗ) và do đó được coi là một phương pháp xử lý bền vững hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học truyền thống (Juhasz và Naidu, 2000; Andreoni và Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Việc hiểu rõ các bước trao đổi chất của vi sinh vật liên quan đến sự phân hủy các chất ô nhiễm thơm có ý nghĩa khoa học và kinh tế to lớn đối với sự bền vững sinh thái và môi trường. Ước tính có khoảng 2,1×10¹⁸ gam carbon (C) được lưu trữ trong trầm tích và các hợp chất hữu cơ (ví dụ: dầu mỏ, khí đốt tự nhiên và than đá, tức là nhiên liệu hóa thạch) trên toàn thế giới, đóng góp đáng kể vào chu trình carbon toàn cầu. Tuy nhiên, quá trình công nghiệp hóa nhanh chóng, khai thác nhiên liệu hóa thạch và các hoạt động của con người đang làm cạn kiệt các bể chứa carbon trong thạch quyển này, giải phóng ước tính 5,5×10¹⁵ gam carbon hữu cơ (dưới dạng chất ô nhiễm) vào khí quyển hàng năm (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Phần lớn lượng carbon hữu cơ này xâm nhập vào hệ sinh thái trên cạn và biển thông qua quá trình lắng đọng, vận chuyển và dòng chảy. Ngoài ra, các chất ô nhiễm tổng hợp mới có nguồn gốc từ nhiên liệu hóa thạch, chẳng hạn như nhựa, chất dẻo hóa và chất ổn định nhựa (phthalate và các đồng phân của chúng), gây ô nhiễm nghiêm trọng các hệ sinh thái biển, đất và thủy sinh cũng như sinh vật của chúng, do đó làm trầm trọng thêm các rủi ro khí hậu toàn cầu. Nhiều loại vi nhựa, nano nhựa, mảnh vụn nhựa và các sản phẩm monome độc ​​hại có nguồn gốc từ polyetylen terephthalate (PET) đã tích tụ ở Thái Bình Dương giữa Bắc Mỹ và Đông Nam Á, tạo thành "Vùng rác thải khổng lồ Thái Bình Dương", gây hại cho sinh vật biển (Newell và cộng sự, 2020). Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng không thể loại bỏ các chất ô nhiễm/chất thải này bằng bất kỳ phương pháp vật lý hoặc hóa học nào. Trong bối cảnh này, các vi sinh vật hữu ích nhất là những vi sinh vật có khả năng chuyển hóa oxy hóa các chất ô nhiễm thành carbon dioxide, năng lượng hóa học và các sản phẩm phụ không độc hại khác, cuối cùng tham gia vào các quá trình chu trình dinh dưỡng khác (H, O, N, S, P, Fe, v.v.). Do đó, việc hiểu biết về sinh lý sinh thái vi sinh vật của quá trình khoáng hóa chất ô nhiễm thơm và kiểm soát môi trường của nó là rất quan trọng để đánh giá chu trình carbon vi sinh vật, ngân sách carbon ròng và rủi ro khí hậu trong tương lai. Trước nhu cầu cấp thiết phải loại bỏ các hợp chất này khỏi môi trường, nhiều ngành công nghiệp sinh thái tập trung vào công nghệ sạch đã xuất hiện. Ngoài ra, việc tận dụng chất thải công nghiệp/hóa chất thải tích tụ trong hệ sinh thái (tức là phương pháp biến chất thải thành của cải) được coi là một trong những trụ cột của nền kinh tế tuần hoàn và các mục tiêu phát triển bền vững (Close et al., 2012). Do đó, việc hiểu rõ các khía cạnh chuyển hóa, enzym và di truyền của các ứng viên phân hủy tiềm năng này là vô cùng quan trọng để loại bỏ và xử lý sinh học hiệu quả các chất ô nhiễm thơm như vậy.
Trong số nhiều chất ô nhiễm thơm, chúng tôi đặc biệt chú ý đến các PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene và các dẫn xuất naphthalene. Các hợp chất này là thành phần chính của nhiên liệu có nguồn gốc từ dầu mỏ, thuốc nhuộm dệt, sản phẩm tiêu dùng, thuốc trừ sâu (thuốc chống mối mọt và thuốc đuổi côn trùng), chất dẻo hóa và tanin, do đó chúng phổ biến rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái (Preuss và cộng sự, 2003). Các báo cáo gần đây nhấn mạnh sự tích tụ nồng độ naphthalene trong trầm tích tầng chứa nước, nước ngầm và đất dưới bề mặt, vùng không bão hòa và lòng sông, cho thấy khả năng tích lũy sinh học của nó trong môi trường (Duttagupta và cộng sự, 2019, 2020). Bảng 2 tóm tắt các tính chất lý hóa, ứng dụng và tác động đến sức khỏe của naphthalene và các dẫn xuất của nó. So với các PAH có trọng lượng phân tử cao khác, naphthalene và các dẫn xuất của nó ít kỵ nước hơn, dễ tan trong nước hơn và phân bố rộng rãi trong hệ sinh thái, do đó chúng thường được sử dụng làm chất nền mẫu để nghiên cứu quá trình trao đổi chất, di truyền và đa dạng trao đổi chất của PAH. Một số lượng lớn vi sinh vật có khả năng chuyển hóa naphthalene và các dẫn xuất của nó, và có nhiều thông tin toàn diện về các con đường trao đổi chất, enzyme và đặc điểm điều chỉnh của chúng (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Ngoài ra, naphthalene và các dẫn xuất của nó được chỉ định là các hợp chất nguyên mẫu để đánh giá ô nhiễm môi trường do sự phong phú và khả năng sinh học cao của chúng. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ ước tính rằng nồng độ naphthalene trung bình là 5,19 μg/m³ từ khói thuốc lá, chủ yếu do quá trình đốt cháy không hoàn toàn, và từ 7,8 đến 46 μg từ khói thuốc thụ động, trong khi mức độ phơi nhiễm với creosote và naphthalene cao hơn từ 100 đến 10.000 lần (Preuss và cộng sự, 2003). Đặc biệt, naphthalene được phát hiện có độc tính đối với hệ hô hấp và khả năng gây ung thư tùy thuộc vào loài, khu vực và giới tính. Dựa trên các nghiên cứu trên động vật, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại naphthalene là "chất có khả năng gây ung thư ở người" (Nhóm 2B)¹. Phơi nhiễm với các dẫn xuất naphthalene, chủ yếu qua đường hít hoặc đường uống, gây tổn thương mô phổi và làm tăng tỷ lệ mắc khối u phổi ở chuột và chuột bạch (Chương trình Độc chất học Quốc gia²). Các tác dụng cấp tính bao gồm buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy, đau đầu, lú lẫn, đổ mồ hôi nhiều, sốt, nhịp tim nhanh, v.v. Mặt khác, thuốc trừ sâu carbamate phổ rộng carbaryl (1-naphthyl N-methylcarbamate) được báo cáo là độc hại đối với động vật không xương sống dưới nước, động vật lưỡng cư, ong mật và con người, và đã được chứng minh là ức chế acetylcholinesterase gây tê liệt (Smulders et al., 2003; Bulen và Distel, 2011). Do đó, việc hiểu rõ các cơ chế phân hủy vi sinh vật, điều hòa gen, phản ứng enzym và tế bào là rất quan trọng để phát triển các chiến lược xử lý sinh học trong môi trường bị ô nhiễm.
Bảng 2. Thông tin chi tiết về các tính chất lý hóa, công dụng, phương pháp nhận dạng và các bệnh liên quan của naphthalene và các dẫn xuất của nó.
Trong các môi trường ô nhiễm, các chất ô nhiễm thơm kỵ nước và ưa lipid có thể gây ra nhiều tác động lên hệ vi sinh vật môi trường (cộng đồng vi sinh vật), chẳng hạn như thay đổi độ linh động của màng tế bào, tính thấm của màng, sự trương phồng của lớp lipid kép, sự gián đoạn quá trình truyền năng lượng (chuỗi vận chuyển electron/lực động proton) và hoạt động của các protein liên kết với màng (Sikkema et al., 1995). Ngoài ra, một số chất trung gian hòa tan như catechol và quinone tạo ra các gốc oxy phản ứng (ROS) và tạo thành các chất cộng hợp với DNA và protein (Penning et al., 1999). Do đó, sự hiện diện nhiều các hợp chất này trong hệ sinh thái tạo ra áp lực chọn lọc lên các cộng đồng vi sinh vật để trở thành những tác nhân phân hủy hiệu quả ở nhiều cấp độ sinh lý khác nhau, bao gồm hấp thụ/vận chuyển, chuyển hóa nội bào, đồng hóa/sử dụng và phân vùng.
Tìm kiếm trong Dự án Cơ sở dữ liệu Ribosomal-II (RDP-II) cho thấy tổng cộng 926 loài vi khuẩn đã được phân lập từ môi trường nuôi cấy hoặc môi trường làm giàu bị nhiễm naphthalene hoặc các dẫn xuất của nó. Nhóm Proteobacteria có số lượng đại diện cao nhất (n = 755), tiếp theo là Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) và vi khuẩn chưa được phân loại (8) (Hình 2). Các đại diện của γ-Proteobacteria (Pseudomonadales và Xanthomonadales) chiếm ưu thế trong tất cả các nhóm vi khuẩn Gram âm với hàm lượng G+C cao (54%), trong khi Clostridiales và Bacillales (30%) là các nhóm vi khuẩn Gram dương với hàm lượng G+C thấp. Vi khuẩn Pseudomonas (với số lượng nhiều nhất, 338 loài) được báo cáo là có khả năng phân hủy naphthalene và các dẫn xuất metyl của nó trong nhiều hệ sinh thái bị ô nhiễm khác nhau (nhựa than đá, dầu mỏ, dầu thô, bùn thải, sự cố tràn dầu, nước thải, chất thải hữu cơ và bãi chôn lấp) cũng như trong các hệ sinh thái nguyên vẹn (đất, sông, trầm tích và nước ngầm) (Hình 2). Hơn nữa, các nghiên cứu làm giàu và phân tích metagenomic của một số khu vực này cho thấy các loài Legionella và Clostridium chưa được nuôi cấy có thể có khả năng phân hủy, cho thấy cần phải nuôi cấy các vi khuẩn này để nghiên cứu các con đường mới và sự đa dạng trao đổi chất.
Hình 2. Sự đa dạng về phân loại và phân bố sinh thái của các đại diện vi khuẩn trong môi trường bị ô nhiễm bởi naphthalene và các dẫn xuất của naphthalene.
Trong số các vi sinh vật phân hủy hydrocarbon thơm khác nhau, hầu hết đều có khả năng phân hủy naphthalene như nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Trình tự các sự kiện liên quan đến quá trình chuyển hóa naphthalene đã được mô tả đối với loài Pseudomonas sp. (các chủng: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 và CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 và các chủng khác (ND6 và AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis và Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Quá trình trao đổi chất được khởi đầu bởi một dioxygenase đa thành phần [naphthalene dioxygenase (NDO), một dioxygenase hydroxyl hóa vòng] xúc tác quá trình oxy hóa một trong các vòng thơm của naphthalene bằng cách sử dụng oxy phân tử làm chất nền còn lại, chuyển đổi naphthalene thành cis-naphthalenediol (Hình 3). Cis-dihydrodiol được chuyển đổi thành 1,2-dihydroxynaphthalene được phân giải bởi một dehydrogenase. Một dioxygenase phân cắt vòng, 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase (12DHNDO), chuyển đổi 1,2-dihydroxynaphthalene thành axit 2-hydroxychromene-2-carboxylic. Sự đồng phân hóa cis-trans nhờ enzym tạo ra trans-o-hydroxybenzylidenepyruvate, chất này được phân cắt bởi hydratase aldolase thành salicylic aldehyde và pyruvate. Axit hữu cơ pyruvate là hợp chất C3 đầu tiên được tạo ra từ khung carbon của naphthalene và được đưa vào con đường carbon trung tâm. Ngoài ra, dehydrogenase salicylaldehyde phụ thuộc NAD+ chuyển đổi salicylaldehyde thành axit salicylic. Quá trình trao đổi chất ở giai đoạn này được gọi là “con đường trên” của sự phân hủy naphthalene. Con đường này rất phổ biến ở hầu hết các vi khuẩn phân hủy naphthalene. Tuy nhiên, có một vài ngoại lệ; ví dụ, ở vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus hamburgii 2, sự phân hủy naphthalene được bắt đầu bởi naphthalene 2,3-dioxygenase để tạo thành 2,3-dihydroxynaphthalene (Annweiler et al., 2000).
Hình 3. Các con đường phân hủy naphthalene, methylnaphthalene, axit naphthoic và carbaryl. Các số được khoanh tròn đại diện cho các enzyme chịu trách nhiệm chuyển đổi tuần tự naphthalene và các dẫn xuất của nó thành các sản phẩm tiếp theo. 1 — naphthalene dioxygenase (NDO); 2, cis-dihydrodiol dehydrogenase; 3, 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase; 4, 2-hydroxychromene-2-carboxylic acid isomerase; 5, trans-O-hydroxybenzylidenepyruvate hydratase aldolase; 6, salicylaldehyde dehydrogenase; 7, salicylate 1-hydroxylase; 8, catechol 2,3-dioxygenase (C23DO); 9, 2-hydroxymuconate semialdehyde dehydrogenase; 10, 2-oxopent-4-enoate hydratase; 11, 4-hydroxy-2-oxopentanoate aldolase; 12, acetaldehyde dehydrogenase; 13, catechol-1,2-dioxygenase (C12DO); 14, muconate cycloisomerase; 15, muconolactone delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenollactone hydrolase; 17, β-ketoadipate succinyl-CoA transferase; 18, β-ketoadipate-CoA thiolase; 19, succinyl-CoA: acetyl-CoA succinyltransferase; 20, salicylate 5-hydroxylase; 21 – gentisate 1,2-dioxygenase (GDO); 22, maleylpyruvate isomerase; 23, fumarylpyruvate hydrolase; 24, methylnaphthalene hydroxylase (NDO); 25, hydroxymethylnaphthalene dehydrogenase; 26, naphthaldehyde dehydrogenase; 27, 3-formylsalicylic acid oxidase; 28, hydroxyisophthalate decarboxylase; 29, carbaryl hydrolase (CH); 30, 1-naphthol-2-hydroxylase.
Tùy thuộc vào sinh vật và cấu trúc di truyền của nó, axit salicylic tạo thành sẽ được chuyển hóa tiếp tục thông qua con đường catechol sử dụng salicylate 1-hydroxylase (S1H) hoặc thông qua con đường gentisate sử dụng salicylate 5-hydroxylase (S5H) (Hình 3). Vì axit salicylic là chất trung gian chính trong quá trình chuyển hóa naphthalene (con đường trên), các bước từ axit salicylic đến chất trung gian TCA thường được gọi là con đường dưới, và các gen được tổ chức thành một operon duy nhất. Người ta thường thấy rằng các gen trong operon con đường trên (nah) và operon con đường dưới (sal) được điều hòa bởi các yếu tố điều hòa chung; ví dụ, NahR và axit salicylic hoạt động như chất cảm ứng, cho phép cả hai operon chuyển hóa hoàn toàn naphthalene (Phale et al., 2019, 2020).
Ngoài ra, catechol được phân cắt theo chu kỳ thành 2-hydroxymuconate semialdehyde thông qua con đường meta bởi catechol 2,3-dioxygenase (C23DO) (Yen et al., 1988) và tiếp tục được thủy phân bởi 2-hydroxymuconate semialdehyde hydrolase để tạo thành 2-hydroxypent-2,4-dienoic acid. 2-hydroxypent-2,4-dienoate sau đó được chuyển đổi thành pyruvate và acetaldehyde bởi một hydratase (2-oxopent-4-enoate hydratase) và một aldolase (4-hydroxy-2-oxopentanoate aldolase) và sau đó đi vào con đường carbon trung tâm (Hình 3). Mặt khác, catechol được phân cắt theo chu kỳ thành cis,cis-muconate thông qua con đường ortho bởi catechol 1,2-oxygenase (C12DO). Muconate cycloisomerase, muconolactone isomerase và β-ketoadipate-nollactone hydrolase chuyển đổi cis,cis-muconate thành 3-oxoadipate, chất này đi vào con đường carbon trung tâm thông qua succinyl-CoA và acetyl-CoA (Nozaki et al., 1968) (Hình 3).
Trong con đường gentisate (2,5-dihydroxybenzoate), vòng thơm bị phân cắt bởi gentisate 1,2-dioxygenase (GDO) để tạo thành maleylpyruvate. Sản phẩm này có thể được thủy phân trực tiếp thành pyruvate và malate, hoặc có thể được đồng phân hóa để tạo thành fumarylpyruvate, sau đó có thể được thủy phân thành pyruvate và fumarate (Larkin và Day, 1986). Sự lựa chọn con đường thay thế đã được quan sát thấy ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương ở cấp độ sinh hóa và di truyền (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas) thích sử dụng axit salicylic, một chất cảm ứng chuyển hóa naphthalene, khử carboxyl nó thành catechol bằng cách sử dụng salicylate 1-hydroxylase (Gibson và Subramanian, 1984). Mặt khác, ở vi khuẩn Gram dương (Rhodococcus), salicylate 5-hydroxylase chuyển đổi axit salicylic thành axit gentisic, trong khi axit salicylic không có tác dụng cảm ứng lên quá trình phiên mã của gen naphthalene (Grund et al., 1992) (Hình 3).
Đã có báo cáo cho rằng các loài như Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, các loài Pseudomonas và Mycobacterium có thể phân hủy monomethylnaphthalene hoặc dimethylnaphthalene (Dean-Raymond và Bartha, 1975; Cane và Williams, 1982; Mahajan và cộng sự, 1994; Dutta và cộng sự, 1998; Hedlund và cộng sự, 1999). Trong số đó, con đường phân hủy 1-methylnaphthalene và 2-methylnaphthalene của Pseudomonas sp. CSV86 đã được nghiên cứu rõ ràng ở cấp độ sinh hóa và enzym (Mahajan và cộng sự, 1994). 1-Methylnaphthalene được chuyển hóa thông qua hai con đường. Đầu tiên, vòng thơm được hydroxyl hóa (vòng không thế của methylnaphthalene) để tạo thành cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaphthalene, chất này tiếp tục được oxy hóa thành methyl salicylate và methylcatechol, sau đó đi vào con đường carbon trung tâm sau khi vòng bị phân cắt (Hình 3). Con đường này được gọi là “con đường nguồn carbon”. Trong “con đường giải độc” thứ hai, nhóm methyl có thể được hydroxyl hóa bởi NDO để tạo thành 1-hydroxymethylnaphthalene, chất này tiếp tục được oxy hóa thành 1-naphthoic acid và được thải ra môi trường nuôi cấy như một sản phẩm cuối cùng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng CSV86 không thể phát triển trên 1- và 2-naphthoic acid như nguồn carbon và năng lượng duy nhất, xác nhận con đường giải độc của nó (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). Trong 2-methylnaphthalene, nhóm methyl trải qua quá trình hydroxyl hóa bởi hydroxylase để tạo thành 2-hydroxymethylnaphthalene. Ngoài ra, vòng không thế của vòng naphthalene trải qua quá trình hydroxyl hóa vòng để tạo thành dihydrodiol, chất này được oxy hóa thành 4-hydroxymethylcatechol trong một loạt các phản ứng xúc tác bởi enzyme và đi vào con đường carbon trung tâm thông qua con đường phân cắt vòng meta. Tương tự, S. paucimobilis 2322 được báo cáo là sử dụng NDO để hydroxyl hóa 2-methylnaphthalene, chất này tiếp tục được oxy hóa để tạo thành methyl salicylate và methylcatechol (Dutta et al., 1998).
Axit naphthoic (có/không có nhóm thế) là sản phẩm phụ của quá trình giải độc/chuyển hóa sinh học được hình thành trong quá trình phân hủy methylnaphthalene, phenanthrene và anthracene và được giải phóng vào môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng. Người ta đã báo cáo rằng chủng vi khuẩn đất Stenotrophomonas maltophilia CSV89 có khả năng chuyển hóa axit 1-naphthoic làm nguồn carbon (Phale et al., 1995). Quá trình chuyển hóa bắt đầu bằng phản ứng dihydroxyl hóa vòng thơm để tạo thành 1,2-dihydroxy-8-carboxynaphthalene. Diol thu được được oxy hóa thành catechol thông qua 2-hydroxy-3-carboxybenzylidenepyruvate, axit 3-formylsalicylic, axit 2-hydroxyisophthalic và axit salicylic và đi vào con đường carbon trung tâm thông qua con đường phân cắt vòng meta (Hình 3).
Carbaryl là một loại thuốc trừ sâu naphthyl carbamate. Kể từ cuộc Cách mạng Xanh ở Ấn Độ vào những năm 1970, việc sử dụng phân bón hóa học và thuốc trừ sâu đã dẫn đến sự gia tăng phát thải hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) từ các nguồn phân tán trong nông nghiệp (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Ước tính 55% (85.722.000 ha) tổng diện tích đất canh tác ở Ấn Độ được xử lý bằng thuốc trừ sâu hóa học. Trong năm năm qua (2015–2020), ngành nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng trung bình từ 55.000 đến 60.000 tấn thuốc trừ sâu mỗi năm (Bộ Hợp tác xã và Phúc lợi Nông dân, Bộ Nông nghiệp, Chính phủ Ấn Độ, tháng 8 năm 2020). Ở các vùng đồng bằng sông Hằng phía bắc và trung tâm (các bang có dân số và mật độ dân số cao nhất), việc sử dụng thuốc trừ sâu trên cây trồng rất phổ biến, trong đó thuốc diệt côn trùng chiếm ưu thế. Carbaryl (1-naphthyl-N-methylcarbamate) là một loại thuốc trừ sâu carbamate phổ rộng, có độc tính từ trung bình đến cao, được sử dụng trong nông nghiệp Ấn Độ với lượng trung bình từ 100–110 tấn. Nó thường được bán dưới tên thương mại Sevin và được dùng để kiểm soát côn trùng (rệp, kiến ​​lửa, bọ chét, nhện đỏ, nhện và nhiều loại sâu hại ngoài trời khác) ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng (ngô, đậu nành, bông, trái cây và rau quả). Một số vi sinh vật như Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus và Arthrobacter cũng có thể được sử dụng để kiểm soát các loại sâu hại khác. Đã có báo cáo cho rằng RC100 có thể phân hủy carbaryl (Larkin và Day, 1986; Chapalamadugu và Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha và Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Con đường phân hủy carbaryl đã được nghiên cứu rộng rãi ở cấp độ sinh hóa, enzym và di truyền trong các chủng Pseudomonas sp. C4, C5 và C6 phân lập từ đất (Swetha và Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Hình 3). Con đường trao đổi chất bắt đầu bằng quá trình thủy phân liên kết este bởi carbaryl hydrolase (CH) để tạo thành 1-naphthol, methylamine và carbon dioxide. 1-naphthol sau đó được chuyển hóa thành 1,2-dihydroxynaphthalene bởi 1-naphthol hydroxylase (1-NH), chất này tiếp tục được chuyển hóa thông qua con đường carbon trung tâm qua salicylate và gentisate. Một số vi khuẩn phân hủy carbaryl được báo cáo là chuyển hóa nó thành axit salicylic thông qua sự phân cắt vòng ortho của catechol (Larkin và Day, 1986; Chapalamadugu và Chaudhry, 1991). Đáng chú ý, vi khuẩn phân hủy naphthalene chủ yếu chuyển hóa axit salicylic thông qua catechol, trong khi vi khuẩn phân hủy carbaryl lại thích chuyển hóa axit salicylic thông qua con đường gentisate.
Các dẫn xuất của axit naphthalenesulfonic/axit disulfonic và axit naphthylaminesulfonic có thể được sử dụng làm chất trung gian trong sản xuất thuốc nhuộm azo, chất làm ướt, chất phân tán, v.v. Mặc dù các hợp chất này có độc tính thấp đối với con người, nhưng các đánh giá độc tính tế bào đã chỉ ra rằng chúng gây chết cho cá, giáp xác Daphnia và tảo (Greim et al., 1994). Các đại diện của chi Pseudomonas (chủng A3, C22) được báo cáo là bắt đầu quá trình trao đổi chất bằng cách hydroxyl hóa kép vòng thơm chứa nhóm axit sulfonic để tạo thành dihydrodiol, chất này tiếp tục được chuyển đổi thành 1,2-dihydroxynaphthalene bằng cách phân cắt tự phát nhóm sulfite (Brilon et al., 1981). 1,2-dihydroxynaphthalene thu được được chuyển hóa thông qua con đường naphthalene cổ điển, tức là con đường catechol hoặc gentisate (Hình 4). Người ta đã chứng minh rằng axit aminonaphthalenesulfonic và axit hydroxynaphthalenesulfonic có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi quần thể vi khuẩn hỗn hợp với các con đường chuyển hóa bổ sung (Nortemann et al., 1986). Người ta cũng đã chứng minh rằng một thành viên trong quần thể sẽ khử lưu huỳnh axit aminonaphthalenesulfonic hoặc axit hydroxynaphthalenesulfonic bằng phản ứng 1,2-dioxygen hóa, trong khi aminosalicylate hoặc hydroxysalicylate được giải phóng vào môi trường nuôi cấy dưới dạng chất chuyển hóa không thể chuyển hóa tiếp và sau đó được các thành viên khác trong quần thể hấp thụ. Axit naphthalenedisulfonic tương đối phân cực nhưng khó phân hủy sinh học và do đó có thể được chuyển hóa thông qua các con đường khác nhau. Quá trình khử lưu huỳnh đầu tiên xảy ra trong quá trình dihydroxyl hóa chọn lọc vị trí của vòng thơm và nhóm axit sulfonic; Quá trình khử lưu huỳnh thứ hai xảy ra trong quá trình hydroxyl hóa axit 5-sulfosalicylic bởi axit salicylic 5-hydroxylase để tạo thành axit gentisic, chất này đi vào con đường carbon trung tâm (Brilon et al., 1981) (Hình 4). Các enzyme chịu trách nhiệm phân hủy naphthalene cũng chịu trách nhiệm chuyển hóa naphthalene sulfonate (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Hình 4. Các con đường trao đổi chất để phân hủy naphthalene sulfonate. Các số bên trong vòng tròn biểu thị các enzyme chịu trách nhiệm chuyển hóa naphthyl sulfonate, tương tự/giống hệt với các enzyme được mô tả trong Hình 3.
Các PAH có trọng lượng phân tử thấp (LMW-PAH) có thể khử được, kỵ nước và ít tan, do đó không dễ bị phân hủy/thối rữa tự nhiên. Tuy nhiên, các vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa chúng bằng cách hấp thụ oxy phân tử (O2). Các enzyme này chủ yếu thuộc nhóm oxidoreductase và có thể thực hiện nhiều phản ứng khác nhau như hydroxyl hóa vòng thơm (mono- hoặc dihydroxyl hóa), khử hydro và phân cắt vòng thơm. Các sản phẩm thu được từ các phản ứng này ở trạng thái oxy hóa cao hơn và dễ dàng được chuyển hóa hơn thông qua con đường carbon trung tâm (Phale et al., 2020). Các enzyme trong con đường phân hủy được báo cáo là có thể cảm ứng. Hoạt động của các enzyme này rất thấp hoặc không đáng kể khi tế bào được nuôi cấy trên các nguồn carbon đơn giản như glucose hoặc axit hữu cơ. Bảng 3 tóm tắt các enzyme khác nhau (oxygenase, hydrolase, dehydrogenase, oxidase, v.v.) tham gia vào quá trình chuyển hóa naphthalene và các dẫn xuất của nó.
Bảng 3. Đặc điểm sinh hóa của các enzyme chịu trách nhiệm phân hủy naphthalene và các dẫn xuất của nó.
Các nghiên cứu đồng vị phóng xạ (18O2) đã chỉ ra rằng việc kết hợp phân tử O2 vào vòng thơm bởi các enzyme oxy hóa là bước quan trọng nhất trong việc kích hoạt quá trình phân hủy sinh học tiếp theo của một hợp chất (Hayaishi và cộng sự, 1955; Mason và cộng sự, 1955). Sự kết hợp một nguyên tử oxy (O) từ oxy phân tử (O2) vào chất nền được bắt đầu bởi các monooxygenase nội sinh hoặc ngoại sinh (còn được gọi là hydroxylase). Một nguyên tử oxy khác được khử thành nước. Monooxygenase ngoại sinh khử flavin bằng NADH hoặc NADPH, trong khi ở monooxygenase nội sinh, flavin được khử bởi chất nền. Vị trí hydroxyl hóa dẫn đến sự đa dạng trong sự hình thành sản phẩm. Ví dụ, salicylate 1-hydroxylase hydroxyl hóa axit salicylic ở vị trí C1, tạo thành catechol. Mặt khác, salicylate 5-hydroxylase đa thành phần (chứa các tiểu đơn vị reductase, ferredoxin và oxygenase) hydroxyl hóa axit salicylic ở vị trí C5, tạo thành axit gentisic (Yamamoto và cộng sự, 1965).
Các enzyme dioxygenase kết hợp hai nguyên tử O2 vào chất nền. Tùy thuộc vào sản phẩm tạo thành, chúng được chia thành dioxygenase hydroxyl hóa vòng và dioxygenase phân cắt vòng. Dioxygenase hydroxyl hóa vòng chuyển đổi chất nền thơm thành cis-dihydrodiol (ví dụ: naphthalene) và phổ biến rộng rãi trong vi khuẩn. Cho đến nay, người ta đã chứng minh rằng các sinh vật chứa dioxygenase hydroxyl hóa vòng có khả năng phát triển trên nhiều nguồn carbon thơm khác nhau, và các enzyme này được phân loại là NDO (naphthalene), toluene dioxygenase (TDO, toluene) và biphenyl dioxygenase (BPDO, biphenyl). Cả NDO và BPDO đều có thể xúc tác quá trình oxy hóa kép và hydroxyl hóa chuỗi bên của nhiều hydrocarbon thơm đa vòng khác nhau (toluen, nitrotoluen, xylen, ethylbenzen, naphtalen, biphenyl, fluoren, indol, methylnaphthalen, naphtalensulfonat, phenanthren, anthracen, acetophenon, v.v.) (Boyd và Sheldrake, 1998; Phale và cộng sự, 2020). NDO là một hệ thống đa thành phần bao gồm một oxidoreductase, một ferredoxin và một thành phần oxygenase chứa vị trí hoạt động (Gibson và Subramanian, 1984; Resnick và cộng sự, 1996). Đơn vị xúc tác của NDO bao gồm một tiểu đơn vị α lớn và một tiểu đơn vị β nhỏ được sắp xếp theo cấu hình α3β3. NDO thuộc một họ lớn các enzyme oxy hóa và tiểu đơn vị α của nó chứa một vị trí Rieske [2Fe-2S] và một nguyên tử sắt không heme đơn nhân, quyết định tính đặc hiệu cơ chất của NDO (Parales et al., 1998). Thông thường, trong một chu kỳ xúc tác, hai electron từ quá trình khử nucleotide pyridine được chuyển đến ion Fe(II) trong vị trí hoạt động thông qua một reductase, một ferredoxin và một vị trí Rieske. Các chất khử này kích hoạt oxy phân tử, đây là điều kiện tiên quyết cho quá trình dihydroxyl hóa cơ chất (Ferraro et al., 2005). Cho đến nay, chỉ có một vài NDO được tinh chế và đặc trưng chi tiết từ các chủng khác nhau và sự kiểm soát di truyền của các con đường liên quan đến sự phân hủy naphthalene đã được nghiên cứu chi tiết (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Các dioxygenase phân cắt vòng (enzyme phân cắt vòng nội hoặc vòng ortho và enzyme phân cắt vòng exodiol hoặc vòng meta) tác động lên các hợp chất thơm hydroxyl hóa. Ví dụ, dioxygenase phân cắt vòng ortho là catechol-1,2-dioxygenase, trong khi dioxygenase phân cắt vòng meta là catechol-2,3-dioxygenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Bên cạnh các oxygenase khác nhau, còn có nhiều dehydrogenase chịu trách nhiệm khử hydro của các dihydrodiol thơm, rượu và aldehyd và sử dụng NAD+/NADP+ làm chất nhận electron, đây là một số enzyme quan trọng tham gia vào quá trình trao đổi chất (Gibson và Subramanian, 1984; Shaw và Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Các enzyme như hydrolase (esterase, amidase) là một nhóm enzyme quan trọng thứ hai sử dụng nước để phân cắt các liên kết cộng hóa trị và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất rộng. Carbaryl hydrolase và các hydrolase khác được coi là thành phần của màng ngoài tế bào (màng xuyên) ở các vi khuẩn Gram âm (Kamini et al., 2018). Carbaryl có cả liên kết amide và ester; do đó, nó có thể bị thủy phân bởi esterase hoặc amidase để tạo thành 1-naphthol. Carbaryl trong chủng Rhizobium rhizobium AC10023 và chủng Arthrobacter RC100 được báo cáo là hoạt động như một esterase và amidase tương ứng. Carbaryl trong chủng Arthrobacter RC100 cũng hoạt động như một amidase. RC100 đã được chứng minh là có khả năng thủy phân bốn loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm N-methylcarbamate như carbaryl, methomyl, mefenamic acid và XMC (Hayaatsu et al., 2001). Theo báo cáo, CH trong Pseudomonas sp. C5pp có thể tác dụng lên carbaryl (hoạt tính 100%) và 1-naphthyl acetate (hoạt tính 36%), nhưng không tác dụng lên 1-naphthylacetamide, cho thấy nó là một esterase (Trivedi et al., 2016).
Các nghiên cứu sinh hóa, mô hình điều hòa enzyme và phân tích di truyền đã chỉ ra rằng các gen phân giải naphthalene bao gồm hai đơn vị điều hòa cảm ứng hoặc “operon”: nah (con đường “thượng nguồn”, chuyển đổi naphthalene thành axit salicylic) và sal (con đường “hạ nguồn”, chuyển đổi axit salicylic thành con đường carbon trung tâm thông qua catechol). Axit salicylic và các chất tương tự của nó có thể hoạt động như chất cảm ứng (Shamsuzzaman và Barnsley, 1974). Khi có mặt glucose hoặc axit hữu cơ, operon bị ức chế. Hình 5 thể hiện cấu trúc di truyền hoàn chỉnh của quá trình phân giải naphthalene (dưới dạng operon). Một số biến thể/dạng được đặt tên của gen nah (ndo/pah/dox) đã được mô tả và được tìm thấy có độ tương đồng trình tự cao (90%) giữa tất cả các loài Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Các gen của con đường thượng nguồn naphthalene thường được sắp xếp theo thứ tự đồng thuận như thể hiện trong Hình 5A. Một gen khác, nahQ, cũng được báo cáo là có liên quan đến quá trình chuyển hóa naphthalene và thường nằm giữa nahC và nahE, nhưng chức năng thực sự của nó vẫn chưa được làm rõ. Tương tự, gen nahY, chịu trách nhiệm cho phản ứng hóa hướng nhạy cảm với naphthalene, được tìm thấy ở đầu xa của operon nah ở một số thành viên. Ở loài Ralstonia, gen U2 mã hóa glutathione S-transferase (gsh) được tìm thấy nằm giữa nahAa và nahAb nhưng không ảnh hưởng đến đặc điểm sử dụng naphthalene (Zylstra et al., 1997).
Hình 5. Tổ chức di truyền và sự đa dạng được quan sát trong quá trình phân hủy naphthalene giữa các loài vi khuẩn; (A) Con đường naphthalene trên, chuyển hóa naphthalene thành axit salicylic; (B) Con đường naphthalene dưới, axit salicylic thông qua catechol đến con đường carbon trung tâm; (C) axit salicylic thông qua gentisate đến con đường carbon trung tâm.
“Con đường chuyển hóa thấp hơn” (operon sal) thường bao gồm nahGTHINLMOKJ và chuyển đổi salicylate thành pyruvate và acetaldehyde thông qua con đường phân cắt metaring catechol. Gen nahG (mã hóa salicylate hydroxylase) được tìm thấy là được bảo tồn ở đầu gần của operon (Hình 5B). So với các chủng phân giải naphthalene khác, ở P. putida CSV86, các operon nah và sal nằm liền kề nhau và có mối quan hệ rất chặt chẽ (khoảng 7,5 kb). Ở một số vi khuẩn Gram âm, chẳng hạn như Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 và P. putida AK5, naphthalene được chuyển hóa như một chất chuyển hóa carbon trung tâm thông qua con đường gentisate (dưới dạng operon sgp/nag). Cụm gen thường được biểu diễn dưới dạng nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, trong đó nagR (mã hóa bộ điều hòa kiểu LysR) nằm ở đầu trên (Hình 5C).
Carbaryl đi vào chu trình carbon trung tâm thông qua quá trình chuyển hóa 1-naphthol, 1,2-dihydroxynaphthalene, axit salicylic và axit gentisic (Hình 3). Dựa trên các nghiên cứu di truyền và chuyển hóa, người ta đã đề xuất chia con đường này thành “thượng nguồn” (chuyển đổi carbaryl thành axit salicylic), “trung nguồn” (chuyển đổi axit salicylic thành axit gentisic) và “hạ nguồn” (chuyển đổi axit gentisic thành các chất trung gian của chu trình carbon trung tâm) (Singh et al., 2013). Phân tích bộ gen của C5pp (supercontig A, 76,3 kb) cho thấy gen mcbACBDEF tham gia vào quá trình chuyển đổi carbaryl thành axit salicylic, tiếp theo là mcbIJKL trong quá trình chuyển đổi axit salicylic thành axit gentisic, và mcbOQP trong quá trình chuyển đổi axit gentisic thành các chất trung gian của chu trình carbon trung tâm (fumarate và pyruvate, Trivedi et al., 2016) (Hình 6).
Đã có báo cáo cho rằng các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy hydrocarbon thơm (bao gồm naphthalene và axit salicylic) có thể được kích thích bởi các hợp chất tương ứng và bị ức chế bởi các nguồn carbon đơn giản như glucose hoặc axit hữu cơ (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Trong số các con đường chuyển hóa khác nhau của naphthalene và các dẫn xuất của nó, các đặc điểm điều hòa của naphthalene và carbaryl đã được nghiên cứu ở một mức độ nhất định. Đối với naphthalene, các gen trong cả con đường thượng nguồn và hạ nguồn đều được điều hòa bởi NahR, một chất điều hòa dương tác động xuyên suốt kiểu LysR. Nó cần thiết cho sự cảm ứng gen nah bởi axit salicylic và sự biểu hiện ở mức độ cao sau đó (Yen và Gunsalus, 1982). Hơn nữa, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố chủ thể tích hợp (IHF) và XylR (chất điều hòa phiên mã phụ thuộc sigma 54) cũng rất quan trọng đối với sự hoạt hóa phiên mã của các gen trong quá trình chuyển hóa naphthalene (Ramos et al., 1997). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các enzyme của con đường mở vòng meta của catechol, cụ thể là catechol 2,3-dioxygenase, được cảm ứng khi có mặt naphthalene và/hoặc axit salicylic (Basu et al., 2006). Các nghiên cứu cũng cho thấy các enzyme của con đường mở vòng ortho của catechol, cụ thể là catechol 1,2-dioxygenase, được cảm ứng khi có mặt axit benzoic và cis,cis-muconate (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Trong chủng C5pp, năm gen, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR và mcbS, mã hóa các chất điều hòa thuộc họ LysR/TetR của các chất điều hòa phiên mã chịu trách nhiệm kiểm soát sự phân hủy carbaryl. Gen tương đồng mcbG được tìm thấy có mối quan hệ gần nhất với chất điều hòa loại LysR PhnS (58% độ tương đồng axit amin) tham gia vào quá trình chuyển hóa phenanthrene trong Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Gen mcbH được tìm thấy tham gia vào con đường trung gian (chuyển đổi axit salicylic thành axit gentisic) và thuộc về chất điều hòa phiên mã loại LysR NagR/DntR/NahR trong Pseudomonas và Burkholderia. Các thành viên của họ này được báo cáo là nhận biết axit salicylic như một phân tử tác động đặc hiệu để cảm ứng các gen phân hủy. Mặt khác, ba gen mcbN, mcbR và mcbS, thuộc nhóm các chất điều hòa phiên mã loại LysR và TetR, đã được xác định trong chuỗi chuyển hóa hạ nguồn (gentisate - các chất chuyển hóa trong chuỗi carbon trung tâm).
Ở sinh vật nhân sơ, các quá trình chuyển gen ngang (thu nhận, trao đổi hoặc chuyển giao) thông qua plasmid, transposon, prophage, đảo gen và các yếu tố liên hợp tích hợp (ICE) là nguyên nhân chính gây ra tính dẻo dai trong bộ gen vi khuẩn, dẫn đến việc thu nhận hoặc mất đi các chức năng/đặc điểm cụ thể. Điều này cho phép vi khuẩn thích nghi nhanh chóng với các điều kiện môi trường khác nhau, mang lại lợi thế trao đổi chất thích ứng tiềm năng cho vật chủ, chẳng hạn như sự phân hủy các hợp chất thơm. Sự thay đổi trao đổi chất thường đạt được thông qua việc tinh chỉnh các operon phân hủy, cơ chế điều hòa của chúng và tính đặc hiệu của enzyme, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân hủy nhiều loại hợp chất thơm hơn (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Các cassette gen để phân hủy naphthalene đã được tìm thấy nằm trên nhiều yếu tố di động khác nhau như plasmid (liên hợp và không liên hợp), transposon, bộ gen, ICE và sự kết hợp của các loài vi khuẩn khác nhau (Hình 5). Trong Pseudomonas G7, các operon nah và sal của plasmid NAH7 được phiên mã theo cùng một hướng và là một phần của transposon khiếm khuyết cần transposase Tn4653 để di chuyển (Sota et al., 2006). Trong chủng Pseudomonas NCIB9816-4, gen này được tìm thấy trên plasmid tiếp hợp pDTG1 dưới dạng hai operon (cách nhau khoảng 15 kb) được phiên mã theo hướng ngược nhau (Dennis và Zylstra, 2004). Trong chủng Pseudomonas putida AK5, plasmid không tiếp hợp pAK5 mã hóa enzyme chịu trách nhiệm phân hủy naphthalene thông qua con đường gentisate (Izmalkova et al., 2013). Trong chủng Pseudomonas PMD-1, operon nah nằm trên nhiễm sắc thể, trong khi operon sal nằm trên plasmid tiếp hợp pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Tuy nhiên, ở Pseudomonas stutzeri AN10, tất cả các gen phân giải naphthalene (operon nah và sal) đều nằm trên nhiễm sắc thể và được cho là được tuyển chọn thông qua các sự kiện chuyển vị, tái tổ hợp và sắp xếp lại (Bosch et al., 2000). Ở Pseudomonas sp. CSV86, operon nah và sal nằm trong bộ gen dưới dạng ICE (ICECSV86). Cấu trúc này được bảo vệ bởi tRNAGly, tiếp theo là các trình tự lặp lại trực tiếp biểu thị các vị trí tái tổ hợp/gắn kết (attR và attL) và một integrase giống phage nằm ở cả hai đầu của tRNAGly, do đó về mặt cấu trúc tương tự như yếu tố ICEclc (ICEclcB13 trong Pseudomonas knackmusii đối với quá trình phân giải chlorocatechol). Người ta đã báo cáo rằng các gen trên ICE có thể được chuyển giao bằng cách tiếp hợp với tần suất chuyển giao cực thấp (10-8), do đó chuyển giao các đặc tính phân giải cho sinh vật nhận (Basu và Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Hầu hết các gen chịu trách nhiệm phân hủy carbaryl đều nằm trên plasmid. Vi khuẩn Arthrobacter sp. RC100 chứa ba plasmid (pRC1, pRC2 và pRC300), trong đó hai plasmid liên hợp, pRC1 và pRC2, mã hóa các enzyme chuyển đổi carbaryl thành gentisate. Mặt khác, các enzyme tham gia vào quá trình chuyển đổi gentisate thành các chất chuyển hóa carbon trung tâm nằm trên nhiễm sắc thể (Hayaatsu et al., 1999). Vi khuẩn thuộc chi Rhizobium, chủng AC100, được sử dụng để chuyển đổi carbaryl thành 1-naphthol, chứa plasmid pAC200, mang gen cehA mã hóa CH như một phần của transposon Tnceh được bao quanh bởi các trình tự giống như yếu tố chèn (istA và istB) (Hashimoto et al., 2002). Trong chủng Sphingomonas CF06, gen phân giải carbaryl được cho là nằm trong năm plasmid: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 và pCF05. Độ tương đồng DNA của các plasmid này rất cao, cho thấy sự tồn tại của một sự kiện nhân đôi gen (Feng et al., 1997). Trong một cộng sinh phân giải carbaryl gồm hai loài Pseudomonas, chủng 50581 chứa plasmid liên hợp pCD1 (50 kb) mã hóa gen thủy phân carbaryl mcd, trong khi plasmid liên hợp trong chủng 50552 mã hóa enzyme phân giải 1-naphthol (Chapalamadugu và Chaudhry, 1991). Trong chủng Achromobacter WM111, gen thủy phân furadan mcd nằm trên plasmid 100 kb (pPDL11). Gen này đã được chứng minh là có mặt trên các plasmid khác nhau (100, 105, 115 hoặc 124 kb) trong các vi khuẩn khác nhau từ các vùng địa lý khác nhau (Parekh et al., 1995). Trong Pseudomonas sp. C5pp, tất cả các gen chịu trách nhiệm phân hủy carbaryl đều nằm trong bộ gen trải dài 76,3 kb trình tự (Trivedi et al., 2016). Phân tích bộ gen (6,15 Mb) cho thấy sự hiện diện của 42 MGE và 36 GEI, trong đó 17 MGE nằm trong siêu trình tự A (76,3 kb) với hàm lượng G+C bất đối xứng trung bình (54–60 mol%), cho thấy các sự kiện chuyển gen ngang có thể xảy ra (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 thể hiện sự sắp xếp tương tự của các gen phân hủy carbaryl, nhưng các gen này nằm trên plasmid (Zhu et al., 2019).
Ngoài hiệu quả trao đổi chất ở cấp độ sinh hóa và gen, vi sinh vật còn thể hiện các đặc tính hoặc phản ứng khác như hóa hướng động, đặc tính biến đổi bề mặt tế bào, phân vùng, sử dụng ưu tiên, sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học, v.v., giúp chúng chuyển hóa các chất ô nhiễm thơm trong môi trường bị ô nhiễm hiệu quả hơn (Hình 7).
Hình 7. Các chiến lược phản ứng tế bào khác nhau của vi khuẩn phân hủy hydrocarbon thơm lý tưởng để phân hủy sinh học hiệu quả các hợp chất gây ô nhiễm ngoại lai.
Phản ứng hóa hướng được coi là yếu tố thúc đẩy sự phân hủy các chất ô nhiễm hữu cơ trong các hệ sinh thái bị ô nhiễm không đồng nhất. (2002) đã chứng minh rằng phản ứng hóa hướng của Pseudomonas sp. G7 đối với naphthalene làm tăng tốc độ phân hủy naphthalene trong hệ thống thủy sinh. Chủng hoang dại G7 phân hủy naphthalene nhanh hơn nhiều so với chủng đột biến thiếu hóa hướng. Protein NahY (538 axit amin với cấu trúc màng) được tìm thấy là được phiên mã đồng thời với các gen của con đường metacleavage trên plasmid NAH7, và giống như các bộ chuyển đổi hóa hướng, protein này dường như hoạt động như một thụ thể hóa học để phân hủy naphthalene (Grimm và Harwood 1997). Một nghiên cứu khác của Hansel et al. (2009) cho thấy protein này có tính chất hóa hướng, nhưng tốc độ phân hủy của nó cao. (2011) đã chứng minh phản ứng hóa hướng của vi khuẩn Pseudomonas (P. putida) đối với khí naphthalene, trong đó sự khuếch tán pha khí dẫn đến dòng chảy ổn định của naphthalene đến các tế bào, điều khiển phản ứng hóa hướng của tế bào. Các nhà nghiên cứu đã khai thác hành vi hóa hướng này để thiết kế vi sinh vật nhằm tăng tốc độ phân hủy. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các con đường cảm thụ hóa học cũng điều chỉnh các chức năng tế bào khác như phân chia tế bào, điều hòa chu kỳ tế bào và hình thành màng sinh học, do đó giúp kiểm soát tốc độ phân hủy. Tuy nhiên, việc khai thác đặc tính này (hóa hướng) để phân hủy hiệu quả bị cản trở bởi một số trở ngại. Những trở ngại chính là: (a) các thụ thể tương đồng khác nhau nhận biết cùng một hợp chất/ligand; (b) sự tồn tại của các thụ thể thay thế, tức là hướng năng lượng; (c) sự khác biệt đáng kể về trình tự trong các miền cảm giác của cùng một họ thụ thể; và (d) thiếu thông tin về các protein cảm biến chính của vi khuẩn (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Đôi khi, quá trình phân hủy sinh học các hydrocarbon thơm tạo ra nhiều chất chuyển hóa/chất trung gian, có thể thu hút một nhóm vi khuẩn nhưng lại đẩy lùi nhóm khác, làm phức tạp thêm quá trình này. Để xác định sự tương tác của các phối tử (hydrocarbon thơm) với các thụ thể hóa học, chúng tôi đã xây dựng các protein cảm biến lai (PcaY, McfR và NahY) bằng cách kết hợp các miền cảm biến và tín hiệu của Pseudomonas putida và Escherichia coli, nhắm mục tiêu vào các thụ thể dành cho axit thơm, chất trung gian TCA và naphthalene, tương ứng (Luu et al., 2019).
Dưới tác động của naphthalene và các hydrocarbon thơm đa vòng (PAH) khác, cấu trúc màng tế bào vi khuẩn và tính toàn vẹn của vi sinh vật trải qua những thay đổi đáng kể. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng naphthalene can thiệp vào sự tương tác của chuỗi acyl thông qua tương tác kỵ nước, do đó làm tăng sự trương nở và tính lưu động của màng tế bào (Sikkema và cộng sự, 1995). Để chống lại tác động bất lợi này, vi khuẩn điều chỉnh tính lưu động của màng bằng cách thay đổi tỷ lệ và thành phần axit béo giữa các axit béo mạch nhánh iso/anteiso và đồng phân hóa các axit béo không bão hòa cis thành các đồng phân trans tương ứng (Heipieper và de Bont, 1994). Ở Pseudomonas stutzeri được nuôi cấy trên môi trường xử lý naphthalene, tỷ lệ axit béo bão hòa so với axit béo không bão hòa tăng từ 1,1 lên 2,1, trong khi ở Pseudomonas JS150, tỷ lệ này tăng từ 7,5 lên 12,0 (Mrozik và cộng sự, 2004). Khi được nuôi cấy trên naphthalene, tế bào Achromobacter KAs 3–5 thể hiện sự kết tụ tế bào xung quanh các tinh thể naphthalene và sự giảm điện tích bề mặt tế bào (từ -22,5 xuống -2,5 mV) kèm theo sự ngưng tụ và hình thành không bào trong tế bào chất, cho thấy những thay đổi về cấu trúc tế bào và tính chất bề mặt tế bào (Mohapatra et al., 2019). Mặc dù những thay đổi về tế bào/bề mặt có liên quan trực tiếp đến khả năng hấp thụ tốt hơn các chất ô nhiễm thơm, nhưng các chiến lược kỹ thuật sinh học liên quan vẫn chưa được tối ưu hóa triệt để. Việc thao tác hình dạng tế bào hiếm khi được sử dụng để tối ưu hóa các quá trình sinh học (Volke và Nikel, 2018). Việc xóa bỏ các gen ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào gây ra những thay đổi về hình thái tế bào. Trong Bacillus subtilis, protein vách ngăn tế bào SepF đã được chứng minh là có liên quan đến sự hình thành vách ngăn và cần thiết cho các bước tiếp theo của sự phân chia tế bào, nhưng nó không phải là một gen thiết yếu. Việc xóa bỏ các gen mã hóa enzyme thủy phân peptide glycan trong Bacillus subtilis đã dẫn đến sự kéo dài tế bào, tăng tốc độ tăng trưởng riêng và cải thiện khả năng sản xuất enzyme (Cui et al., 2018).
Người ta đã đề xuất phân vùng con đường phân hủy carbaryl để đạt được hiệu quả phân hủy các chủng Pseudomonas C5pp và C7 (Kamini et al., 2018). Người ta cho rằng carbaryl được vận chuyển vào không gian quanh màng tế bào thông qua vách ngăn màng ngoài và/hoặc thông qua các kênh vận chuyển khuếch tán. CH là một enzyme quanh màng tế bào xúc tác quá trình thủy phân carbaryl thành 1-naphthol, chất này ổn định hơn, kỵ nước hơn và độc hại hơn. CH được định vị trong không gian quanh màng tế bào và có ái lực thấp với carbaryl, do đó kiểm soát sự hình thành 1-naphthol, ngăn ngừa sự tích tụ của nó trong tế bào và giảm độc tính đối với tế bào (Kamini et al., 2018). 1-naphthol tạo thành được vận chuyển vào tế bào chất qua màng trong bằng cách phân vùng và/hoặc khuếch tán, sau đó được hydroxyl hóa thành 1,2-dihydroxynaphthalene bởi enzyme có ái lực cao 1NH để tiếp tục chuyển hóa trong con đường carbon trung tâm.
Mặc dù vi sinh vật có khả năng di truyền và trao đổi chất để phân hủy các nguồn carbon ngoại lai, nhưng cấu trúc phân cấp trong việc sử dụng chúng (tức là ưu tiên sử dụng các nguồn carbon đơn giản hơn so với các nguồn carbon phức tạp) là một trở ngại lớn đối với quá trình phân hủy sinh học. Sự hiện diện và sử dụng các nguồn carbon đơn giản làm giảm hoạt động của các gen mã hóa enzyme phân hủy các nguồn carbon phức tạp/không được ưu tiên như PAH. Một ví dụ được nghiên cứu kỹ lưỡng là khi glucose và lactose được cung cấp đồng thời cho Escherichia coli, glucose được sử dụng hiệu quả hơn lactose (Jacob và Monod, 1965). Pseudomonas được báo cáo là có khả năng phân hủy nhiều loại PAH và các hợp chất ngoại lai làm nguồn carbon. Thứ tự ưu tiên sử dụng nguồn carbon ở Pseudomonas là axit hữu cơ > glucose > hợp chất thơm (Hylemon và Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Tuy nhiên, có một ngoại lệ. Điều thú vị là, Pseudomonas sp. CSV86 thể hiện cấu trúc phân cấp độc đáo, ưu tiên sử dụng các hydrocarbon thơm (axit benzoic, naphthalene, v.v.) hơn là glucose và đồng chuyển hóa các hydrocarbon thơm với các axit hữu cơ (Basu et al., 2006). Ở vi khuẩn này, các gen mã hóa quá trình phân hủy và vận chuyển hydrocarbon thơm không bị điều hòa giảm ngay cả khi có mặt nguồn carbon thứ hai như glucose hoặc axit hữu cơ. Khi nuôi cấy trong môi trường glucose và hydrocarbon thơm, người ta quan sát thấy các gen mã hóa quá trình vận chuyển và chuyển hóa glucose bị điều hòa giảm, hydrocarbon thơm được sử dụng trong pha logarit đầu tiên, và glucose được sử dụng trong pha logarit thứ hai (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Mặt khác, sự hiện diện của axit hữu cơ không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của quá trình chuyển hóa hydrocarbon thơm, vì vậy vi khuẩn này được kỳ vọng là một chủng tiềm năng cho các nghiên cứu về phân hủy sinh học (Phale et al., 2020).
Người ta biết rằng quá trình chuyển hóa sinh học hydrocarbon có thể gây ra stress oxy hóa và làm tăng hoạt động của các enzyme chống oxy hóa trong vi sinh vật. Sự phân hủy sinh học naphthalene không hiệu quả cả trong tế bào ở pha tĩnh và khi có mặt các hợp chất độc hại dẫn đến sự hình thành các gốc oxy phản ứng (ROS) (Kang và cộng sự, 2006). Vì các enzyme phân hủy naphthalene chứa các cụm sắt-lưu huỳnh, dưới tác động của stress oxy hóa, sắt trong heme và các protein sắt-lưu huỳnh sẽ bị oxy hóa, dẫn đến sự bất hoạt của protein. Ferredoxin-NADP+ reductase (Fpr), cùng với superoxide dismutase (SOD), làm trung gian cho phản ứng oxy hóa khử thuận nghịch giữa NADP+/NADPH và hai phân tử ferredoxin hoặc flavodoxin, do đó loại bỏ ROS và khôi phục trung tâm sắt-lưu huỳnh dưới tác động của stress oxy hóa (Li và cộng sự, 2006). Đã có báo cáo cho rằng cả Fpr và SodA (SOD) trong Pseudomonas đều có thể được kích hoạt bởi stress oxy hóa, và hoạt động SOD và catalase tăng lên đã được quan sát thấy ở bốn chủng Pseudomonas (O1, W1, As1 và G1) trong quá trình sinh trưởng dưới điều kiện bổ sung naphthalene (Kang et al., 2006). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung các chất chống oxy hóa như axit ascorbic hoặc sắt (Fe2+) có thể làm tăng tốc độ sinh trưởng của naphthalene. Khi Rhodococcus erythropolis phát triển trong môi trường naphthalene, quá trình phiên mã của các gen cytochrome P450 liên quan đến stress oxy hóa, bao gồm sodA (Fe/Mn superoxide dismutase), sodC (Cu/Zn superoxide dismutase) và recA, đã tăng lên (Sazykin et al., 2019). Phân tích định lượng protein so sánh của tế bào Pseudomonas được nuôi cấy trong naphthalene cho thấy rằng việc tăng cường biểu hiện của nhiều protein liên quan đến phản ứng stress oxy hóa là một chiến lược đối phó với stress (Herbst et al., 2013).
Các vi sinh vật được báo cáo là có khả năng sản sinh chất hoạt động bề mặt sinh học dưới tác động của các nguồn carbon kỵ nước. Các chất hoạt động bề mặt này là các hợp chất hoạt động bề mặt lưỡng tính có thể tạo thành các cụm tại giao diện dầu-nước hoặc không khí-nước. Điều này thúc đẩy quá trình hòa tan giả và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hấp phụ các hydrocarbon thơm, dẫn đến quá trình phân hủy sinh học hiệu quả (Rahman et al., 2002). Nhờ những đặc tính này, chất hoạt động bề mặt sinh học được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. Việc bổ sung chất hoạt động bề mặt hóa học hoặc chất hoạt động bề mặt sinh học vào nuôi cấy vi khuẩn có thể tăng cường hiệu quả và tốc độ phân hủy hydrocarbon. Trong số các chất hoạt động bề mặt sinh học, rhamnolipid do Pseudomonas aeruginosa sản sinh đã được nghiên cứu và đặc trưng hóa rộng rãi (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Ngoài ra, các loại chất hoạt động bề mặt sinh học khác bao gồm lipopeptide (mucin từ Pseudomonas fluorescens), chất nhũ hóa 378 (từ Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg và Ron, 1999), lipid disaccharide trehalose từ Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin từ Bacillus (Saraswathy và Hallberg, 2002), và chất hoạt động bề mặt từ Bacillus subtilis (Siegmund và Wagner, 1991) và Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Các chất hoạt động bề mặt mạnh này đã được chứng minh là làm giảm sức căng bề mặt từ 72 dynes/cm xuống dưới 30 dynes/cm, cho phép hấp thụ hydrocarbon tốt hơn. Đã có báo cáo cho rằng Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia và các loài vi khuẩn khác có thể sản xuất nhiều chất hoạt động bề mặt sinh học dựa trên rhamnolipid và glycolipid khi được nuôi cấy trong môi trường naphthalene và methylnaphthalene (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 có thể sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học ngoại bào Biosur-Pm khi được nuôi cấy trên các hợp chất thơm như axit naphthoic (Phale et al., 1995). Động học của sự hình thành Biosur-Pm cho thấy quá trình tổng hợp của nó phụ thuộc vào sự tăng trưởng và độ pH. Người ta nhận thấy rằng lượng Biosur-Pm được sản xuất bởi các tế bào ở pH trung tính cao hơn so với ở pH 8,5. Các tế bào được nuôi cấy ở pH 8,5 có tính kỵ nước cao hơn và có ái lực cao hơn đối với các hợp chất thơm và béo so với các tế bào được nuôi cấy ở pH 7,0. Ở Rhodococcus spp. Điều kiện tối ưu cho sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học ngoại bào là N6, tỷ lệ carbon/nitơ (C:N) cao hơn và thiếu sắt (Mutalik et al., 2008). Đã có những nỗ lực cải thiện quá trình sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (surfactin) bằng cách tối ưu hóa chủng vi sinh và quá trình lên men. Tuy nhiên, nồng độ chất hoạt động bề mặt trong môi trường nuôi cấy thấp (1,0 g/L), gây khó khăn cho sản xuất quy mô lớn (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Do đó, các phương pháp kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để cải thiện quá trình sinh tổng hợp. Tuy nhiên, việc sửa đổi kỹ thuật này rất khó khăn do kích thước lớn của operon (khoảng 25 kb) và sự điều hòa sinh tổng hợp phức tạp của hệ thống cảm ứng mật độ quần thể (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Một số sửa đổi kỹ thuật di truyền đã được thực hiện trên vi khuẩn Bacillus, chủ yếu nhằm mục đích tăng sản lượng surfactin bằng cách thay thế promoter (operon srfA), biểu hiện quá mức protein xuất khẩu surfactin YerP và các yếu tố điều hòa ComX và PhrC (Jiao et al., 2017). Tuy nhiên, các phương pháp kỹ thuật di truyền này chỉ đạt được một hoặc một vài sửa đổi di truyền và chưa đạt đến sản xuất thương mại. Do đó, cần nghiên cứu thêm các phương pháp tối ưu hóa dựa trên kiến ​​thức.
Các nghiên cứu về phân hủy sinh học PAH chủ yếu được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn. Tuy nhiên, tại các địa điểm bị ô nhiễm hoặc trong môi trường bị ô nhiễm, nhiều yếu tố vô sinh và hữu sinh (nhiệt độ, pH, oxy, lượng chất dinh dưỡng, khả năng sinh học của chất nền, các chất ngoại lai khác, sự ức chế sản phẩm cuối cùng, v.v.) đã được chứng minh là làm thay đổi và ảnh hưởng đến khả năng phân hủy của vi sinh vật.
Nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình phân hủy sinh học PAH. Khi nhiệt độ tăng, nồng độ oxy hòa tan giảm, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật hiếu khí, vì chúng cần oxy phân tử làm một trong những chất nền cho các enzyme oxy hóa thực hiện các phản ứng hydroxyl hóa hoặc phân cắt vòng. Người ta thường nhận thấy rằng nhiệt độ cao chuyển đổi các PAH ban đầu thành các hợp chất độc hại hơn, do đó ức chế quá trình phân hủy sinh học (Muller và cộng sự, 1998).
Người ta nhận thấy rằng nhiều khu vực bị ô nhiễm PAH có giá trị pH cực đoan, chẳng hạn như các khu vực bị ô nhiễm do nước thải mỏ axit (pH 1–4) và các khu vực khí hóa khí tự nhiên/than đá bị ô nhiễm do nước rỉ kiềm (pH 8–12). Những điều kiện này có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình phân hủy sinh học. Do đó, trước khi sử dụng vi sinh vật để xử lý sinh học, nên điều chỉnh pH bằng cách thêm các hóa chất thích hợp (có thế oxy hóa khử từ trung bình đến rất thấp) như amoni sulfat hoặc amoni nitrat đối với đất kiềm hoặc bón vôi bằng canxi cacbonat hoặc magie cacbonat đối với các khu vực có tính axit (Bowlen và cộng sự 1995; Gupta và Sar 2020).
Việc cung cấp oxy cho khu vực bị ảnh hưởng là yếu tố hạn chế tốc độ phân hủy sinh học PAH. Do điều kiện oxy hóa khử của môi trường, các quá trình xử lý sinh học tại chỗ thường yêu cầu cung cấp oxy từ các nguồn bên ngoài (cày xới, sục khí và bổ sung hóa chất) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) đã chứng minh rằng việc bổ sung magie peroxit (một hợp chất giải phóng oxy) vào tầng chứa nước bị ô nhiễm có thể xử lý sinh học hiệu quả các hợp chất BTEX. Một nghiên cứu khác đã điều tra sự phân hủy tại chỗ của phenol và BTEX trong tầng chứa nước bị ô nhiễm bằng cách tiêm natri nitrat và xây dựng các giếng khai thác để đạt được hiệu quả xử lý sinh học (Bewley và Webb, 2001).