Địa chỉ hiện tại: Cologne 50931, Đức, Trung tâm Nghiên cứu Xuất sắc Cologne về Phản ứng Căng thẳng Tế bào trong các Bệnh liên quan đến Lão hóa (CECAD).
Sự thoái hóa thần kinh do bệnh lý ty thể được coi là không thể đảo ngược vì khả năng thích ứng chuyển hóa của tế bào thần kinh bị hạn chế, nhưng tác động của rối loạn chức năng ty thể lên tính tự chủ của quá trình chuyển hóa thần kinh trong cơ thể vẫn chưa được hiểu rõ. Ở đây, chúng tôi giới thiệu hệ protein đặc hiệu của tế bào thần kinh Purkinje với sự thiếu hụt OXPHOS tiến triển do động lực hợp nhất ty thể bị gián đoạn. Chúng tôi nhận thấy rằng rối loạn chức năng ty thể đã gây ra một sự thay đổi sâu sắc trong lĩnh vực proteomics, cuối cùng dẫn đến sự kích hoạt tuần tự các chương trình chuyển hóa chính xác trước khi tế bào chết. Thật bất ngờ, chúng tôi đã xác định được sự cảm ứng rõ rệt của pyruvate carboxylase (PCx) và các enzyme chống lão hóa khác bổ sung các chất trung gian của chu trình TCA. Ức chế PCx làm trầm trọng thêm stress oxy hóa và thoái hóa thần kinh, cho thấy rằng xơ vữa động mạch có tác dụng bảo vệ đối với các tế bào thần kinh thiếu OXPHOS. Việc phục hồi sự hợp nhất ty thể trong các tế bào thần kinh bị thoái hóa giai đoạn cuối hoàn toàn đảo ngược các đặc điểm chuyển hóa này, do đó ngăn ngừa tế bào chết. Những phát hiện của chúng tôi xác định các con đường chưa được biết đến trước đây giúp tăng khả năng phục hồi trước rối loạn chức năng ty thể và cho thấy rằng thoái hóa thần kinh có thể được đảo ngược ngay cả ở giai đoạn muộn của bệnh.
Vai trò trung tâm của ty thể trong việc duy trì quá trình chuyển hóa năng lượng thần kinh được nhấn mạnh bởi các triệu chứng thần kinh rộng rãi liên quan đến các bệnh ty thể ở người. Hầu hết các bệnh này đều do đột biến gen điều chỉnh biểu hiện gen ty thể (1, 2) hoặc phá hủy gen liên quan đến động lực học ty thể, ảnh hưởng gián tiếp đến sự ổn định của DNA ty thể (mtDNA) (3, 4). Nghiên cứu trên mô hình động vật đã chỉ ra rằng, để đáp ứng với rối loạn chức năng ty thể trong các mô xung quanh, các con đường chuyển hóa bảo tồn (5-7) có thể được kích hoạt, cung cấp thông tin quan trọng để hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh của những bệnh phức tạp này. Ngược lại, sự hiểu biết của chúng ta về những thay đổi chuyển hóa của các loại tế bào cụ thể do sự thất bại chung của quá trình sản xuất adenosine triphosphate (ATP) ty thể não là rất quan trọng (8), nhấn mạnh sự cần thiết phải xác định các mục tiêu điều trị có thể được sử dụng để ngăn ngừa hoặc phòng tránh bệnh thoái hóa thần kinh (9). Sự thiếu thông tin nằm ở chỗ các tế bào thần kinh được cho là có tính linh hoạt chuyển hóa rất hạn chế so với các loại tế bào của các mô xung quanh (10). Do các tế bào này đóng vai trò trung tâm trong việc điều phối nguồn cung cấp chất chuyển hóa cho tế bào thần kinh để thúc đẩy quá trình truyền dẫn synap và phản ứng với các tình trạng tổn thương và bệnh tật, khả năng thích ứng quá trình trao đổi chất của tế bào với các điều kiện đầy thách thức của mô não hầu như chỉ giới hạn ở các tế bào thần kinh đệm (11-14). Ngoài ra, tính không đồng nhất tế bào vốn có của mô não phần lớn cản trở việc nghiên cứu các thay đổi chuyển hóa xảy ra trong các nhóm tế bào thần kinh cụ thể. Kết quả là, người ta biết rất ít về hậu quả tế bào và chuyển hóa chính xác của rối loạn chức năng ty thể trong tế bào thần kinh.
Để hiểu rõ hậu quả chuyển hóa của rối loạn chức năng ty thể, chúng tôi đã phân lập các tế bào thần kinh Purkinje (PN) ở các giai đoạn thoái hóa thần kinh khác nhau do sự phá hủy hợp nhất màng ngoài ty thể (Mfn2). Mặc dù đột biến Mfn2 ở người có liên quan đến một dạng bệnh thần kinh vận động cảm giác di truyền được gọi là bệnh Charcot-Marie-Tooth loại 2A (15), nhưng việc phá hủy có điều kiện Mfn2 ở chuột là một phương pháp gây rối loạn chức năng oxy hóa-phosphoryl hóa (OXPHOS) được công nhận rộng rãi. Các phân nhóm tế bào thần kinh khác nhau (16-19) và kiểu hình thoái hóa thần kinh do đó đi kèm với các triệu chứng thần kinh tiến triển, chẳng hạn như rối loạn vận động (18, 19) hoặc mất điều hòa tiểu não (16). Bằng cách sử dụng kết hợp các phương pháp proteomics định lượng không nhãn (LFQ), metabolomics, hình ảnh và virus học, chúng tôi chứng minh rằng thoái hóa thần kinh tiến triển mạnh mẽ kích thích sự biểu hiện của pyruvate carboxylase (PCx) và các yếu tố khác liên quan đến xơ cứng động mạch của tế bào thần kinh ngoại biên (PN) trong cơ thể sống. Để xác minh tính phù hợp của phát hiện này, chúng tôi đã đặc biệt làm giảm biểu hiện của PCx trong các tế bào PN thiếu Mfn2 và nhận thấy rằng thao tác này làm trầm trọng thêm stress oxy hóa và đẩy nhanh quá trình thoái hóa thần kinh, do đó chứng minh rằng vô sinh nam mang lại khả năng thích nghi chuyển hóa dẫn đến chết tế bào. Sự biểu hiện mạnh mẽ của MFN2 có thể cứu sống hoàn toàn các tế bào PN thoái hóa giai đoạn cuối với sự thiếu hụt OXPHOS nghiêm trọng, tiêu thụ lượng lớn DNA ty thể và mạng lưới ty thể bị phá vỡ rõ ràng, điều này càng nhấn mạnh rằng dạng thoái hóa thần kinh này thậm chí có thể phục hồi ở giai đoạn bệnh tiến triển trước khi tế bào chết.
Để hình dung ty thể trong PN bị loại bỏ Mfn2, chúng tôi đã sử dụng một dòng chuột cho phép ty thể phụ thuộc Cre nhắm mục tiêu biểu hiện Cre protein huỳnh quang màu vàng (YFP) (mtYFP) (20) và kiểm tra hình thái ty thể in vivo. Chúng tôi nhận thấy rằng sự phá hủy gen Mfn2 trong PN sẽ dẫn đến sự phân chia dần dần của mạng lưới ty thể (Hình S1A), và sự thay đổi sớm nhất được tìm thấy ở 3 tuần tuổi. Ngược lại, sự thoái hóa đáng kể của lớp tế bào PN, được chứng minh bằng sự mất đi khả năng nhuộm miễn dịch Calbindin, không bắt đầu cho đến 12 tuần tuổi (Hình 1, A và B). Sự không khớp về thời gian giữa những thay đổi sớm nhất về hình thái ty thể và sự khởi phát rõ ràng của cái chết tế bào thần kinh đã thúc đẩy chúng tôi điều tra những thay đổi chuyển hóa do rối loạn chức năng ty thể gây ra trước khi tế bào chết. Chúng tôi đã phát triển một chiến lược dựa trên phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang (FACS) để phân lập các tế bào thần kinh PN biểu hiện YFP (YFP+) (Hình 1C), và ở chuột đối chứng (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), sau đây được gọi là CTRL (Hình S1B). Việc tối ưu hóa chiến lược phân vùng dựa trên cường độ tương đối của tín hiệu YFP cho phép chúng tôi tinh lọc phần thân YFP+ (YFPhigh) của các tế bào PN khỏi các tế bào không phải PN (YFPneg) (Hình S1B) hoặc các mảnh sợi trục/sợi nhánh huỳnh quang giả định (YFPlow; Hình S1D, bên trái), được xác nhận bằng kính hiển vi confocal (Hình S1D, bên phải). Để xác minh danh tính của quần thể được phân loại, chúng tôi đã tiến hành phân tích protein LFQ và sau đó là phân tích thành phần chính, và nhận thấy rằng có sự phân tách rõ ràng giữa các tế bào YFPhigh và YFPneg (Hình S1C). Các tế bào YFPhigh cho thấy sự làm giàu ròng của các dấu hiệu PN đã biết (ví dụ: Calb1, Pcp2, Grid2 và Itpr3) (21, 22), nhưng không có sự làm giàu của các protein thường được biểu hiện trong tế bào thần kinh hoặc các loại tế bào khác (Hình 1D)). So sánh giữa các mẫu trong các tế bào YFPhigh được phân loại thu thập trong các thí nghiệm độc lập cho thấy hệ số tương quan > 0,9, chứng tỏ khả năng tái tạo tốt giữa các bản sao sinh học (Hình S1E). Tóm lại, những dữ liệu này đã xác nhận kế hoạch của chúng tôi về việc phân lập PN khả thi một cách cấp tính và cụ thể. Vì hệ thống điều khiển L7-cre được sử dụng gây ra sự tái tổ hợp khảm trong tuần đầu tiên sau khi sinh (23), chúng tôi bắt đầu loại bỏ chuột từ nhóm CTRL và nhóm có điều kiện (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) để thu thập tế bào thần kinh. Sau khi quá trình tái tổ hợp hoàn tất, chúng được gọi là Mfn2cKO ở 4 tuần tuổi. Là điểm kết thúc, chúng tôi chọn 8 tuần tuổi khi lớp PN còn nguyên vẹn mặc dù có sự phân mảnh ty thể rõ ràng (Hình 1B và Hình S1A). Tổng cộng, chúng tôi đã định lượng 3013 protein, trong đó khoảng 22% dựa trên chú thích MitoCarta 2.0 dựa trên proteome ty thể là ty thể (Hình 1E) (Hình 1E) (24). Phân tích biểu hiện gen khác biệt được thực hiện ở tuần thứ 8 cho thấy chỉ có 10,5% tổng số protein có sự thay đổi đáng kể (Hình 1F và Hình S1F), trong đó 195 protein bị giảm biểu hiện và 120 protein được tăng biểu hiện (Hình 1F). Điều đáng chú ý là “phân tích con đường đổi mới” của tập dữ liệu này cho thấy các gen biểu hiện khác biệt chủ yếu thuộc về một tập hợp hạn chế các con đường trao đổi chất cụ thể (Hình 1G). Điều thú vị là, mặc dù sự giảm hoạt động của các con đường liên quan đến OXPHOS và tín hiệu canxi xác nhận sự gây ra rối loạn chức năng ty thể trong các tế bào thần kinh đệm thiếu sự hợp nhất, nhưng các nhóm khác chủ yếu liên quan đến chuyển hóa axit amin lại được tăng cường đáng kể, điều này phù hợp với quá trình chuyển hóa xảy ra trong các tế bào thần kinh đệm ty thể. Sự tái cấu trúc này nhất quán với rối loạn chức năng.
(A) Hình ảnh hiển vi confocal đại diện của các lát cắt tiểu não của chuột CTRL và Mfn2cKO cho thấy sự mất dần các tế bào thần kinh Purkinje (PN) (calbindin, màu xám); nhân tế bào được nhuộm đối chứng bằng DAPI. (B) Định lượng của (A) (phân tích phương sai một chiều, ***P<0,001; n = 4 đến 6 vòng tròn từ ba con chuột). (C) Quy trình thí nghiệm. (D) Bản đồ nhiệt phân bố các dấu ấn đặc hiệu cho tế bào Purkinje (trên cùng) và các loại tế bào khác (giữa). (E) Biểu đồ Venn cho thấy số lượng protein ty thể được xác định trong PN đã được phân loại. (F) Biểu đồ núi lửa của các protein biểu hiện khác biệt trong tế bào thần kinh Mfn2cKO ở 8 tuần tuổi (giá trị ngưỡng ý nghĩa là 1,3). (G) Phân tích con đường sáng tạo cho thấy năm con đường điều hòa tăng (màu đỏ) và điều hòa giảm (màu xanh) quan trọng nhất trong PN Mfn2cKO được phân loại ở 8 tuần tuổi. Mức độ biểu hiện trung bình của mỗi protein được phát hiện được hiển thị. Bản đồ nhiệt thang độ xám: giá trị P đã điều chỉnh. ns, không quan trọng.
Dữ liệu proteomics cho thấy biểu hiện protein của các phức hợp I, III và IV giảm dần. Các phức hợp I, III và IV đều chứa các tiểu đơn vị mã hóa mtDNA thiết yếu, trong khi phức hợp II, chỉ được mã hóa bởi nhân, về cơ bản không bị ảnh hưởng (Hình 2A và Hình S2A). Phù hợp với kết quả proteomics, phương pháp nhuộm mô miễn dịch trên các lát cắt mô tiểu não cho thấy mức độ tiểu đơn vị MTCO1 (tiểu đơn vị 1 của cytochrome C oxidase ty thể) của phức hợp IV trong PN giảm dần (Hình 2B). Tiểu đơn vị mã hóa mtDNA Mtatp8 giảm đáng kể (Hình S2A), trong khi mức độ ổn định của tiểu đơn vị ATP synthase mã hóa bởi nhân vẫn không thay đổi, phù hợp với phức hợp F1 của cụm phụ ATP synthase ổn định đã biết khi biểu hiện mtDNA ổn định. Sự hình thành phù hợp. Gián đoạn (7). Đánh giá mức độ mtDNA trong các tế bào thần kinh Mfn2cKO đã được phân loại bằng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR) đã xác nhận sự giảm dần số lượng bản sao mtDNA. So với nhóm đối chứng, ở 8 tuần tuổi, chỉ còn khoảng 20% ​​mức độ mtDNA được giữ lại (Hình 2C). Phù hợp với các kết quả này, phương pháp nhuộm hiển vi confocal trên các tế bào thần kinh Mfn2cKO được sử dụng để phát hiện DNA, cho thấy sự tiêu thụ nucleotide ty thể theo thời gian (Hình 2D). Chúng tôi nhận thấy rằng chỉ một số ứng viên liên quan đến sự thoái hóa protein ty thể và phản ứng stress được điều chỉnh tăng lên, bao gồm Lonp1, Afg3l2 và Clpx, và các yếu tố lắp ráp phức hợp OXPHOS. Không phát hiện thấy sự thay đổi đáng kể nào về mức độ protein liên quan đến quá trình apoptosis (Hình S2B). Tương tự, chúng tôi nhận thấy rằng ty thể và các kênh lưới nội chất liên quan đến vận chuyển canxi chỉ có những thay đổi nhỏ (Hình S2C). Ngoài ra, việc đánh giá các protein liên quan đến quá trình tự thực bào không phát hiện thấy sự thay đổi đáng kể nào, điều này phù hợp với sự hình thành các thể tự thực bào có thể quan sát được trên cơ thể sống bằng phương pháp hóa mô miễn dịch và kính hiển vi điện tử (Hình S3). Tuy nhiên, sự rối loạn chức năng OXPHOS tiến triển ở tế bào thần kinh đệm (PN) đi kèm với những thay đổi rõ rệt về cấu trúc siêu hiển vi của ty thể. Có thể thấy các cụm ty thể trong thân tế bào và nhánh tế bào thần kinh của tế bào thần kinh đệm Mfn2cKO ở độ tuổi 5 và 8 tuần, và cấu trúc màng trong đã trải qua những thay đổi sâu sắc (Hình S4, A và B). Phù hợp với những thay đổi về cấu trúc siêu hiển vi này và sự giảm đáng kể lượng mtDNA, phân tích các lát cắt tiểu não cấp tính bằng tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) cho thấy điện thế màng ty thể ở tế bào thần kinh đệm Mfn2cKO đã giảm đáng kể (Hình S4C).
(A) Phân tích diễn biến theo thời gian của mức độ biểu hiện phức hợp OXPHOS. Chỉ xem xét các protein có P<0,05 ở tuần thứ 8 (phân tích phương sai hai chiều). Đường chấm chấm: Không điều chỉnh so với nhóm đối chứng (CTRL). (B) Bên trái: Ví dụ về một lát cắt tiểu não được nhuộm bằng kháng thể anti-MTCO1 (thang đo, 20 μm). Vùng chứa các thể tế bào Purkinje được tô màu vàng. Bên phải: Định lượng mức độ MTCO1 (phân tích phương sai một chiều; n = 7 đến 20 tế bào được phân tích từ ba con chuột). (C) Phân tích qPCR về số lượng bản sao mtDNA trong PN đã được phân loại (phân tích phương sai một chiều; n = 3 đến 7 con chuột). (D) Bên trái: Ví dụ về một lát cắt tiểu não được nhuộm bằng kháng thể anti-DNA (thang đo, 20 μm). Vùng chứa các thể tế bào Purkinje được tô màu vàng. Bên phải: Định lượng tổn thương mtDNA (phân tích phương sai một chiều; n = 5 đến 9 tế bào từ ba con chuột). (E) Ví dụ về một lát cắt tiểu não cấp tính cho thấy các tế bào Purkinje mitoYFP + (mũi tên) trong bản ghi điện thế màng tế bào toàn phần. (F) Định lượng đường cong IV. (G) Bản ghi đại diện của dòng điện khử cực được tiêm vào các tế bào Purkinje CTRL và Mfn2cKO. Đường cong trên: Xung đầu tiên kích hoạt AP. Đường cong dưới: Tần số AP tối đa. (H) Định lượng các đầu vào tự phát hậu synap (sPSPs). Đường ghi đại diện và tỷ lệ phóng to của nó được hiển thị trong (I). Phân tích phương sai một chiều được thực hiện trên n = 5 đến 20 tế bào từ ba con chuột. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Các đường biểu diễn đại diện của AP tự phát được ghi lại bằng chế độ kẹp màng tế bào thủng. Đường cong trên: Tần số AP tối đa. Đường cong dưới: phóng to một AP đơn lẻ. (K) Định lượng tần số AP trung bình và tối đa theo (J). Kiểm định Mann-Whitney; n = 5 tế bào được phân tích từ bốn con chuột. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn; không quan trọng.
Tổn thương OXPHOS rõ ràng đã được phát hiện ở tế bào thần kinh Mfn2cKO 8 tuần tuổi, cho thấy chức năng sinh lý của tế bào thần kinh bị bất thường nghiêm trọng. Do đó, chúng tôi đã phân tích các đặc tính điện thụ động của các tế bào thần kinh thiếu OXPHOS ở độ tuổi 4 đến 5 tuần và 7 đến 8 tuần bằng cách thực hiện ghi điện thế màng tế bào toàn phần trên các lát cắt tiểu não cấp tính (Hình 2E). Thật bất ngờ, điện thế màng nghỉ trung bình và điện trở đầu vào của các tế bào thần kinh Mfn2cKO tương tự như nhóm đối chứng, mặc dù có những khác biệt nhỏ giữa các tế bào (Bảng 1). Tương tự, ở độ tuổi 4 đến 5 tuần, không tìm thấy sự thay đổi đáng kể nào trong mối quan hệ dòng điện-điện áp (đường cong IV) (Hình 2F). Tuy nhiên, không có tế bào thần kinh Mfn2cKO nào ở độ tuổi 7 đến 8 tuần sống sót sau chế độ IV (bước siêu phân cực), cho thấy có sự nhạy cảm rõ ràng với điện thế siêu phân cực ở giai đoạn muộn này. Ngược lại, ở các tế bào thần kinh Mfn2cKO, dòng điện khử cực gây ra sự phóng điện thế hoạt động (AP) lặp đi lặp lại được dung nạp tốt, cho thấy rằng mô hình phóng điện tổng thể của chúng không khác biệt đáng kể so với các tế bào thần kinh đối chứng 8 tuần tuổi (Bảng 1 và Hình 2G). Tương tự, tần số và biên độ của dòng điện hậu synap tự phát (sPSC) tương đương với nhóm đối chứng, và tần số các sự kiện tăng lên từ 4 tuần đến 5 tuần đến 7 tuần đến 8 tuần với mức tăng tương tự (Hình 2, H và I). Giai đoạn trưởng thành synap ở PN (25). Kết quả tương tự đã được thu được sau khi vá PN bị thủng. Cấu hình này ngăn chặn sự bù trừ có thể xảy ra của các khiếm khuyết ATP tế bào, như có thể xảy ra trong ghi điện thế màng tế bào toàn phần. Đặc biệt, điện thế màng nghỉ và tần số phóng điện tự phát của các tế bào thần kinh Mfn2cKO không bị ảnh hưởng (Hình 2, J và K). Tóm lại, những kết quả này cho thấy các tế bào thần kinh (PN) có rối loạn chức năng OXPHOS rõ rệt vẫn có thể xử lý tốt các kiểu phóng điện tần số cao, cho thấy có một cơ chế bù trừ cho phép chúng duy trì các phản ứng điện sinh lý gần như bình thường.
Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (phân tích phương sai một chiều, kiểm định so sánh đa cặp Holm-Sidak; *P<0,05). Số thứ tự đơn vị được ghi trong ngoặc đơn.
Chúng tôi bắt đầu điều tra xem liệu bất kỳ danh mục nào trong tập dữ liệu proteomics (Hình 1G) có bao gồm các con đường có thể chống lại sự thiếu hụt OXPHOS nghiêm trọng hay không, từ đó giải thích tại sao PN bị ảnh hưởng có thể duy trì điện sinh lý gần như bình thường (Hình 2, E đến K). Phân tích proteomics cho thấy các enzyme tham gia vào quá trình dị hóa axit amin chuỗi nhánh (BCAA) được điều chỉnh tăng đáng kể (Hình 3A và Hình S5A), và sản phẩm cuối cùng là acetyl-CoA (CoA) hoặc succinyl CoA có thể bổ sung tricarboxylat trong chu trình axit béo (TCA). Chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng BCAA transaminase 1 (BCAT1) và BCAT2 đều tăng lên. Chúng xúc tác bước đầu tiên của quá trình dị hóa BCAA bằng cách tạo ra glutamate từ α-ketoglutarate (26). Tất cả các tiểu đơn vị cấu thành nên phức hợp dehydrogenase axit keto chuỗi nhánh (BCKD) đều được điều chỉnh tăng (phức hợp này xúc tác quá trình khử carboxyl không thể đảo ngược của khung carbon BCAA tạo thành) (Hình 3A và Hình S5A). Tuy nhiên, không tìm thấy sự thay đổi rõ rệt nào trong chính BCAA ở PN đã được phân loại, điều này có thể là do sự hấp thụ tế bào tăng lên của các axit amin thiết yếu này hoặc do sử dụng các nguồn khác (glucose hoặc axit lactic) để bổ sung cho chu trình TCA (Hình S5B). PN thiếu OXPHOS cũng cho thấy hoạt động phân hủy glutamine và chuyển hóa amin tăng lên ở 8 tuần tuổi, điều này có thể được phản ánh bằng sự điều chỉnh tăng của các enzyme ty thể glutaminase (GLS) và glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Hình 3, A và C). Điều đáng chú ý là sự điều hòa tăng của GLS bị giới hạn ở dạng đồng phân ghép nối glutaminase C (GLS-GAC) (sự thay đổi của Mfn2cKO/CTRL xấp xỉ 4,5 lần, P = 0,05) và sự điều hòa tăng cụ thể của nó trong mô ung thư có thể hỗ trợ năng lượng sinh học ty thể. (27).
(A) Bản đồ nhiệt thể hiện sự thay đổi gấp bội về mức độ protein theo lộ trình cụ thể sau 8 tuần. (B) Ví dụ về một lát cắt tiểu não được đánh dấu bằng kháng thể anti-PCx (thang đo, 20 μm). Mũi tên màu vàng chỉ vào thân tế bào Purkinje. (C) Phân tích diễn biến theo thời gian của biểu hiện protein được xác định là ứng cử viên quan trọng cho bệnh xơ vữa động mạch (kiểm định t đa biến, *FDR <5%; n = 3-5 chuột). (D) Phía trên: Sơ đồ minh họa các cách khác nhau để carbon được đánh dấu có trong chất đánh dấu [1-13C]pyruvate đi vào (tức là thông qua PDH hoặc đường xuyên động mạch). Phía dưới: Biểu đồ hình vĩ cầm thể hiện tỷ lệ phần trăm carbon được đánh dấu đơn (M1) được chuyển đổi thành axit aspartic, axit citric và axit malic sau khi đánh dấu các lát cắt tiểu não cấp tính bằng [1-13C]pyruvate (kiểm định t ghép cặp; ** P <0,01). (E) Phân tích toàn diện diễn biến theo thời gian của con đường được chỉ định. Chỉ xem xét các protein có P<0,05 ở tuần thứ 8. Đường nét đứt: không có giá trị điều chỉnh (phân tích phương sai hai chiều; * P <0,05; *** P <0,001). Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM).
Trong phân tích của chúng tôi, quá trình dị hóa BCAA đã trở thành một trong những con đường điều chỉnh tăng quan trọng. Thực tế này cho thấy rõ ràng rằng thể tích thông khí đi vào chu trình TCA có thể bị thay đổi ở PN thiếu OXPHOS. Điều này có thể đại diện cho một hình thức tái cấu trúc chuyển hóa thần kinh chính, có thể tác động trực tiếp đến sinh lý và sự sống còn của thần kinh trong quá trình duy trì rối loạn chức năng OXPHOS nghiêm trọng. Phù hợp với giả thuyết này, chúng tôi nhận thấy rằng enzyme chống xơ vữa động mạch chính PCx được điều chỉnh tăng (Mfn2cKO/CTRL thay đổi khoảng 1,5 lần; Hình 3A), enzyme này xúc tác quá trình chuyển đổi pyruvate thành oxaloacetate (28), được cho là có biểu hiện giới hạn ở tế bào hình sao trong mô não (29, 30). Phù hợp với kết quả phân tích protein, kính hiển vi confocal cho thấy biểu hiện PCx tăng lên một cách đặc hiệu và đáng kể ở các tế bào thần kinh đệm (PN) thiếu OXPHOS, trong khi phản ứng PCx chủ yếu bị hạn chế ở các tế bào thần kinh đệm Bergmann liền kề của nhóm đối chứng (Hình 3B). Để kiểm tra chức năng của sự tăng biểu hiện PCx đã quan sát được, chúng tôi đã xử lý các lát cắt tiểu não cấp tính bằng chất đánh dấu [1-13C]pyruvate. Khi pyruvate bị oxy hóa bởi pyruvate dehydrogenase (PDH), nhãn đồng vị của nó biến mất, nhưng được kết hợp vào các chất trung gian của chu trình TCA khi pyruvate được chuyển hóa bởi các phản ứng mạch máu (Hình 3D). Để hỗ trợ dữ liệu phân tích protein của chúng tôi, chúng tôi đã quan sát thấy một lượng lớn các dấu hiệu từ chất đánh dấu này trong axit aspartic của các lát cắt Mfn2cKO, trong khi axit citric và axit malic cũng có xu hướng vừa phải, mặc dù không đáng kể (Hình 3D).
Trong các tế bào thần kinh dopamine của chuột MitoPark bị rối loạn chức năng ty thể do các tế bào thần kinh dopamine phá hủy gen yếu tố phiên mã ty thể A (Tfam) (Hình S6B), biểu hiện PCx cũng được điều chỉnh tăng đáng kể (31), cho thấy bệnh xơ vữa động mạch do axit axeton được điều chỉnh trong quá trình rối loạn chức năng OXPHOS thần kinh trong cơ thể. Điều đáng chú ý là người ta đã phát hiện ra rằng các enzyme độc ​​đáo (32-34) có thể được biểu hiện trong các tế bào thần kinh có thể liên quan đến xơ vữa động mạch được điều chỉnh tăng đáng kể trong các tế bào thần kinh thiếu OXPHOS, chẳng hạn như propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA chuyển đổi propionyl-CoA thành succinyl-CoA và enzyme malic ty thể 3 (ME3), có vai trò chính là thu hồi pyruvate từ malate (Hình 3, A và C) (33, 35). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy sự gia tăng đáng kể của enzyme Pdk3, enzyme này phosphoryl hóa và do đó làm bất hoạt PDH (36), trong khi không phát hiện thấy sự thay đổi nào ở enzyme Pdp1, enzyme này kích hoạt PDH hoặc chính phức hợp enzyme PDH (Hình 3A). Nhất quán với điều này, ở các tế bào thần kinh Mern2cKO, quá trình phosphoryl hóa tiểu đơn vị α1 (PDHE1α) của thành phần E1 dehydrogenase pyruvate thuộc phức hợp PDH tại Ser293 (được biết là ức chế hoạt động enzyme của PDH) đã được tăng cường (Hình S6C). Pyruvate không có đường vào mạch máu.
Cuối cùng, chúng tôi nhận thấy rằng con đường siêu tổng hợp serine và glycine, chu trình folate ty thể liên quan (1C) và quá trình tổng hợp proline (Hình 1G và Hình S5C) đều được điều chỉnh tăng đáng kể, theo các báo cáo, trong quá trình kích hoạt. Các mô xung quanh được kích hoạt với rối loạn chức năng ty thể (5-7). Phân tích kính hiển vi confocal hỗ trợ dữ liệu proteomics này cho thấy rằng ở PN với OXPHOS bị thiếu, các lát cắt tiểu não của chuột 8 tuần tuổi đã được xử lý bằng serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), một enzyme quan trọng của chu trình folate ty thể. Phản ứng miễn dịch đáng kể (Hình S5D). Trong các lát cắt tiểu não cấp tính được ủ với 13 CU-glucose, các thí nghiệm theo dõi chuyển hóa đã xác nhận thêm sự điều chỉnh tăng của quá trình tổng hợp serine và proline, cho thấy rằng dòng chảy của các đồng phân carbon vào serine và proline tăng lên (Hình S5E). Vì các phản ứng được xúc tác bởi GLS và GPT2 chịu trách nhiệm tổng hợp glutamate từ glutamine và phản ứng chuyển amin giữa glutamate và α-ketoglutarate, sự tăng cường hoạt động của chúng cho thấy các tế bào thần kinh thiếu OXPHOS có nhu cầu glutamate tăng cao. Điều này có thể nhằm mục đích duy trì quá trình sinh tổng hợp proline tăng lên (Hình S5C). Ngược lại với những thay đổi này, phân tích proteomic của tế bào hình sao tiểu não từ chuột Mfn2cKO đặc hiệu PN cho thấy các con đường này (bao gồm tất cả các chất chống peroxidase) không thay đổi đáng kể về biểu hiện, do đó chứng minh sự chuyển hướng trao đổi chất này có tính chọn lọc đối với PN bị thoái hóa (Hình S6, D đến G).
Tóm lại, các phân tích này đã tiết lộ các mô hình kích hoạt theo thời gian khác nhau đáng kể của các con đường trao đổi chất cụ thể trong tế bào thần kinh. Mặc dù chức năng ty thể thần kinh bất thường có thể dẫn đến xơ vữa động mạch sớm và tái cấu trúc 1C (Hình 3E và Hình S5C), và thậm chí là những thay đổi có thể dự đoán được trong biểu hiện của phức hợp I và IV, nhưng những thay đổi trong quá trình tổng hợp serine de novo chỉ trở nên rõ ràng ở giai đoạn muộn. Rối loạn chức năng OXPHOS (Hình 3E và Hình S5C). Những phát hiện này xác định một quá trình tuần tự trong đó phản ứng của ty thể (chu trình 1C) và tế bào chất (tổng hợp serine) do căng thẳng gây ra phối hợp với sự gia tăng xơ vữa động mạch trong chu trình TCA để định hình lại quá trình trao đổi chất của tế bào thần kinh.
Các tế bào thần kinh PN thiếu OXPHOS 8 tuần tuổi có thể duy trì hoạt động kích thích tần số cao và trải qua quá trình tái kết nối chuyển hóa đáng kể để bù đắp cho rối loạn chức năng ty thể. Phát hiện này đặt ra một khả năng thú vị rằng ngay cả ở giai đoạn này, những tế bào này cũng có thể nhận được sự can thiệp điều trị để trì hoãn hoặc ngăn ngừa thoái hóa thần kinh. Chúng tôi đã giải quyết khả năng này thông qua hai can thiệp độc lập. Trong phương pháp đầu tiên, chúng tôi đã thiết kế một vectơ virus adeno-associated (AAV) phụ thuộc Cre để MFN2 có thể được biểu hiện chọn lọc trong các tế bào thần kinh PN thiếu OXPHOS in vivo (Hình S7A). AAV mã hóa MFN2 và gen báo cáo huỳnh quang mCherry (Mfn2-AAV) đã được xác minh trong nuôi cấy tế bào thần kinh sơ cấp in vitro, khiến MFN2 được biểu hiện theo cách phụ thuộc Cre và phục hồi hình thái ty thể, do đó ngăn ngừa đột biến thần kinh ở các tế bào thần kinh Mfn2cKO (Hình S7, B, D và E). Tiếp theo, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm in vivo để đưa Mfn2-AAV 8 tuần tuổi vào vỏ não tiểu não của chuột Mfn2cKO và chuột đối chứng bằng phương pháp định vị không gian, và phân tích chuột 12 tuần tuổi (Hình 4A). Chuột Mfn2cKO được điều trị đã chết (Hình 1, A và B) (16). Sự truyền virus in vivo dẫn đến biểu hiện chọn lọc của PN trong một số vòng tiểu não (Hình S7, G và H). Việc tiêm AAV đối chứng chỉ biểu hiện mCherry (Ctrl-AAV) không có tác dụng đáng kể đến mức độ thoái hóa thần kinh ở động vật Mfn2cKO. Ngược lại, phân tích chuột Mfn2cKO được truyền Mfn2-AAV cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể của lớp tế bào PN (Hình 4, B và C). Đặc biệt, mật độ tế bào thần kinh dường như gần như không thể phân biệt được với động vật đối chứng (Hình 4, B và C, và Hình S7, H và I). Sự biểu hiện của MFN1 chứ không phải MFN2 có hiệu quả tương đương trong việc ngăn ngừa chết tế bào thần kinh (Hình 4C và Hình S7, C và F), điều này cho thấy sự biểu hiện của MFN1 lạc chỗ có thể bổ sung hiệu quả sự thiếu hụt MFN2. Phân tích sâu hơn ở cấp độ tế bào thần kinh đơn lẻ cho thấy Mfn2-AAV đã phục hồi phần lớn cấu trúc siêu hiển vi của ty thể, bình thường hóa mức độ mtDNA và đảo ngược sự biểu hiện cao của dấu ấn chống tạo mạch PCx (Hình 4, C đến E). Quan sát trực quan những con chuột Mfn2cKO được cứu sống ở trạng thái nghỉ ngơi cho thấy tư thế và các triệu chứng vận động của chúng (chuyển động S1 đến S3) đã được cải thiện. Tóm lại, những thí nghiệm này cho thấy việc tái đưa MFN2 vào các tế bào thần kinh bị thiếu hụt nghiêm trọng OXPHOS là đủ để đảo ngược sự tiêu thụ mtDNA và gây xơ vữa động mạch, từ đó ngăn ngừa thoái hóa sợi trục và chết tế bào thần kinh in vivo.
(A) Sơ đồ thể hiện lịch trình thí nghiệm tiêm AAV mã hóa MFN2 khi con đường trao đổi chất được chỉ định được kích hoạt. (B) Hình ảnh hiển vi confocal đại diện của các lát cắt tiểu não 12 tuần tuổi được chuyển gen ở tuần thứ 8 trên chuột Mfn2cKO và được đánh dấu bằng kháng thể chống Calbindin. Bên phải: Tỷ lệ phóng to của các sợi trục thần kinh. Tỷ lệ phóng to của sợi trục là 450 và 75 μm. (C) Bên trái: Định lượng mật độ tế bào Purkinje trong vòng chuyển gen AAV (AAV+) (phân tích phương sai một chiều; n = 3 chuột). Bên phải: Phân tích tiêu điểm mtDNA trong PN được chuyển gen ở tuần thứ 12 (kiểm định t không ghép cặp; n = 6 tế bào từ ba con chuột). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua đại diện của PN trong các lát cắt tiểu não Mfn2cKO được chuyển gen bằng các vectơ virus được chỉ định. Mặt nạ màu hồng minh họa khu vực do các nhánh thần kinh chiếm giữ, và hình vuông chấm vàng minh họa hình phóng to được cung cấp ở bên phải; n đại diện cho nhân tế bào. Thanh tỷ lệ, 1μm. (E) cho thấy một ví dụ về nhuộm PCx trong PN được chuyển gen ở tuần thứ 12. Thanh tỷ lệ, 20μm. OE, biểu hiện quá mức; FC, thay đổi gấp bội.
Cuối cùng, chúng tôi đã nghiên cứu tầm quan trọng của sự sống sót tế bào do peroxidase gây ra ở các tế bào thần kinh tiểu não (PN) bị rối loạn chức năng OXPHOS. Chúng tôi đã tạo ra mCherry mã hóa AAV-shRNA (RNA kẹp tóc ngắn) nhắm mục tiêu cụ thể vào mRNA PCx của chuột (AAV-shPCx), và tiêm virus hoặc RNA kiểm soát ngẫu nhiên (AAV-scr) vào tiểu não của chuột Mfn2cKO. Việc tiêm được thực hiện vào tuần thứ tư tuổi (Hình 5A) để đạt được hiệu quả ức chế PCx trong giai đoạn biểu hiện PCx tăng lên (Hình 3C) và lớp tế bào PN vẫn còn nguyên vẹn (Hình 1A). Điều đáng chú ý là việc ức chế PCx (Hình S8A) dẫn đến sự gia tăng đáng kể tỷ lệ chết của tế bào PN, chỉ giới hạn ở vòng bị nhiễm bệnh (Hình 5, B và C). Để hiểu cơ chế tác động chuyển hóa do sự điều hòa tăng PCx gây ra, chúng tôi đã nghiên cứu trạng thái oxy hóa khử của PN sau khi loại bỏ PCx và đồng thời biểu hiện cảm biến sinh học quang học Grx1-roGFP2 qua trung gian AAV (Hình S8, B đến D) để đánh giá sự thay đổi tương đối của glutathione và tiềm năng oxy hóa khử của peptide (38). Sau đó, chúng tôi đã thực hiện kính hiển vi hình ảnh thời gian sống huỳnh quang hai photon (FLIM) trên các lát cắt não cấp tính của chuột Mfn2cKO 7 tuần tuổi hoặc chuột đối chứng cùng lứa để phát hiện những thay đổi tiềm năng trong trạng thái oxy hóa khử tế bào chất sau khi xác minh các điều kiện FLIM (Hình S8, E đến G). Phân tích cho thấy sự gia tăng đáng kể trạng thái oxy hóa của một PN Mfn2cKO đơn lẻ thiếu biểu hiện PCx, khác với các tế bào thần kinh đối chứng hoặc PN Mfn2cKO chỉ biểu hiện shRNA ngẫu nhiên (Hình 5, D và E). Khi biểu hiện PCx bị giảm, tỷ lệ PN Mfn2cKO thể hiện trạng thái oxy hóa cao tăng hơn ba lần (Hình 5E), cho thấy sự điều chỉnh tăng PCx duy trì khả năng oxy hóa khử của các tế bào thần kinh bị thoái hóa.
(A) Sơ đồ thể hiện lịch trình thí nghiệm tiêm AAV mã hóa shPCx khi con đường trao đổi chất được chỉ định được kích hoạt. (B) Ảnh hiển vi confocal tiêu biểu của các lát cắt tiểu não 8 tuần tuổi ở chuột Mfn2cKO được chuyển gen và đánh dấu bằng kháng thể chống calcineurin ở tuần thứ 4. Thanh tỷ lệ, 450μm. (C) Định lượng mật độ tế bào Purkinje trong các vòng được chuyển gen bằng AAV (phân tích phương sai một chiều; n = 3 đến 4 chuột). Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn; ***P<0,001. (D) Hình ảnh FLIM tiêu biểu cho thấy tuổi thọ trung bình của tế bào thần kinh Purkinje 7 tuần tuổi biểu hiện cảm biến oxy hóa khử glutathione Grx1-roGFP2 trong các điều kiện thí nghiệm cụ thể. Tỷ lệ LUT (bảng tra cứu): khoảng thời gian sống sót (tính bằng picogiây). Thanh tỷ lệ, 25μm. (E) Biểu đồ cột thể hiện sự phân bố các giá trị thời gian sống Grx1-roGFP2 từ (D) (n=158 đến 368 tế bào ở hai con chuột trong mỗi điều kiện). Biểu đồ hình tròn phía trên mỗi biểu đồ cột: thể hiện số lượng tế bào có giá trị thời gian sống dài hơn đáng kể (màu đỏ, bị oxy hóa) hoặc ngắn hơn (màu xanh lam, bị khử), vượt quá 1 độ lệch chuẩn so với giá trị thời gian sống trung bình trong nhóm CTRL-AAV-scr. (F) Mô hình đề xuất cho thấy tác dụng bảo vệ của việc tăng cường biểu hiện PCx thần kinh.
Tóm lại, dữ liệu chúng tôi cung cấp ở đây cho thấy việc tái biểu hiện MFN2 có thể hoàn toàn cứu vãn bệnh PN giai đoạn nặng với tình trạng thiếu hụt OXPHOS nghiêm trọng, suy giảm mtDNA nghiêm trọng và hình thái giống ista cực kỳ bất thường, nhờ đó mang lại sự tiến triển liên tục ngay cả trong các trường hợp bệnh nặng. Thoái hóa thần kinh cung cấp bằng chứng có thể đảo ngược về giai đoạn trước khi tế bào chết. Mức độ linh hoạt chuyển hóa này càng được nhấn mạnh bởi khả năng của tế bào thần kinh gây ra xơ vữa động mạch (tái cấu trúc chu trình TCA), ức chế biểu hiện PCx trong các tế bào PN thiếu OXPHOS và tăng cường sự chết tế bào, do đó đóng vai trò bảo vệ (Hình 5F).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã cung cấp bằng chứng cho thấy phản ứng của tế bào thần kinh (PN) đối với rối loạn chức năng OXPHOS là dần dần hội tụ về xơ vữa động mạch chu trình TCA thông qua con đường hoạt hóa khác biệt được kích hoạt bởi các chương trình chuyển hóa. Chúng tôi đã xác nhận phân tích proteomics bằng nhiều phương pháp bổ sung và tiết lộ rằng khi bị thách thức bởi rối loạn chức năng ty thể nghiêm trọng, các tế bào thần kinh có một dạng đàn hồi chuyển hóa chưa từng được biết đến trước đây. Điều đáng ngạc nhiên là toàn bộ quá trình tái cấu trúc không nhất thiết đánh dấu trạng thái chuyển hóa cuối cùng đi kèm với thoái hóa thần kinh dần dần và không thể đảo ngược, mà dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng nó có thể cấu thành một cơ chế bù trừ chức năng duy trì tế bào thần kinh ngay cả ở giai đoạn trước khi tế bào chết. Phát hiện này cho thấy các tế bào thần kinh có mức độ dẻo dai chuyển hóa đáng kể trong cơ thể. Thực tế này chứng minh rằng việc tái đưa MFN2 vào sau đó có thể đảo ngược sự biểu hiện của các dấu ấn chuyển hóa chính và ngăn ngừa thoái hóa PN. Ngược lại, nó ức chế xơ vữa động mạch và đẩy nhanh quá trình chuyển đổi thần kinh.
Một trong những phát hiện hấp dẫn nhất trong nghiên cứu của chúng tôi là các tế bào thần kinh (PN) thiếu OXPHOS có thể sửa đổi quá trình chuyển hóa chu trình TCA bằng cách điều chỉnh tăng cường các enzyme kích thích xơ vữa động mạch. Sự sắp xếp lại chuyển hóa là một đặc điểm phổ biến của các tế bào ung thư, một số trong đó dựa vào glutamine để bổ sung các chất trung gian của chu trình TCA nhằm tạo ra các chất khử tương đương, thúc đẩy chuỗi hô hấp và duy trì sản xuất tiền chất sinh tổng hợp lipid và nucleotide (39, 40). Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng ở các mô ngoại vi bị rối loạn chức năng OXPHOS, sự kết nối lại của quá trình chuyển hóa glutamine/glutamate cũng là một đặc điểm nổi bật (5, 41), trong đó hướng đi của glutamine vào chu trình TCA phụ thuộc vào mức độ nghiêm trọng của tổn thương OXPHOS (41). Tuy nhiên, vẫn thiếu bằng chứng rõ ràng về bất kỳ sự tương đồng nào giữa tính dẻo dai chuyển hóa thần kinh trong cơ thể và sự liên quan có thể có của nó trong bối cảnh bệnh tật. Trong một nghiên cứu trong ống nghiệm gần đây, các tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát đã được chứng minh là huy động các bể glutamate để dẫn truyền thần kinh, do đó thúc đẩy quá trình chuyển hóa oxy hóa và xơ vữa động mạch trong điều kiện căng thẳng chuyển hóa (42). Điều đáng chú ý là dưới sự ức chế dược lý của enzyme succinate dehydrogenase trong chu trình TCA, quá trình carboxyl hóa pyruvate được cho là duy trì sự tổng hợp oxaloacetate trong các tế bào thần kinh hạt tiểu não nuôi cấy (34). Tuy nhiên, sự liên quan về mặt sinh lý của các cơ chế này đến mô não (nơi xơ vữa động mạch được cho là chủ yếu giới hạn ở các tế bào hình sao) vẫn có ý nghĩa sinh lý quan trọng (43). Trong trường hợp này, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng các PN bị tổn thương do OXPHOS trong cơ thể có thể chuyển sang quá trình phân hủy BCAA và carboxyl hóa pyruvate, đây là hai nguồn bổ sung chính cho các chất trung gian của bể TCA. Mặc dù sự đóng góp được cho là của quá trình dị hóa BCAA đối với quá trình chuyển hóa năng lượng thần kinh đã được đề xuất, ngoài vai trò của glutamate và GABA đối với dẫn truyền thần kinh (44), nhưng vẫn chưa có bằng chứng nào cho các cơ chế này trong cơ thể sống. Do đó, rất dễ suy đoán rằng các PN bị rối loạn chức năng có thể tự động bù đắp cho việc tiêu thụ các chất trung gian TCA do quá trình đồng hóa gây ra bằng cách làm tăng xơ vữa động mạch. Đặc biệt, việc điều hòa tăng PCx có thể cần thiết để duy trì nhu cầu axit aspartic tăng cao, điều này được gợi ý trong các tế bào tăng sinh bị rối loạn chức năng ty thể (45). Tuy nhiên, phân tích chuyển hóa của chúng tôi không cho thấy bất kỳ thay đổi đáng kể nào về mức độ ổn định của axit aspartic trong PN Mfn2cKO (Hình S6A), điều này có lẽ phản ánh sự sử dụng chuyển hóa axit aspartic khác nhau giữa các tế bào tăng sinh và các tế bào thần kinh sau phân bào. Mặc dù cơ chế chính xác của việc điều hòa tăng PCx trong các tế bào thần kinh bị rối loạn chức năng in vivo vẫn chưa được xác định rõ, chúng tôi đã chứng minh rằng phản ứng sớm này đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái oxy hóa khử của tế bào thần kinh, điều này đã được chứng minh trong các thí nghiệm FLIM trên các lát cắt tiểu não. Đặc biệt, việc ngăn PN điều hòa tăng PCx có thể dẫn đến trạng thái oxy hóa cao hơn và đẩy nhanh quá trình chết tế bào. Sự hoạt hóa của quá trình phân hủy BCAA và quá trình cacboxyl hóa pyruvate không phải là cách để xác định đặc điểm của các mô ngoại vi bị rối loạn chức năng ty thể (7). Do đó, chúng dường như là một đặc điểm ưu tiên của các tế bào thần kinh thiếu OXPHOS, ngay cả khi không phải là đặc điểm duy nhất, và điều này rất quan trọng đối với quá trình thoái hóa thần kinh.
Bệnh tiểu não là một loại bệnh thoái hóa thần kinh không đồng nhất, thường biểu hiện dưới dạng mất điều hòa vận động và thường làm tổn thương các tế bào thần kinh tiểu não (PN) (46). Quần thể tế bào thần kinh này đặc biệt dễ bị rối loạn chức năng ty thể vì sự thoái hóa chọn lọc của chúng ở chuột đủ để tái tạo nhiều triệu chứng vận động đặc trưng cho bệnh mất điều hòa tiểu não ở người (16, 47, 48). Theo các báo cáo, mô hình chuột chuyển gen với gen đột biến có liên quan đến bệnh mất điều hòa tiểu não ở người và bị rối loạn chức năng ty thể (49, 50), nhấn mạnh tầm quan trọng của việc nghiên cứu hậu quả của sự thiếu hụt OXPHOS trong PNPH. Do đó, việc phân lập và nghiên cứu quần thể tế bào thần kinh độc đáo này một cách hiệu quả là đặc biệt phù hợp. Tuy nhiên, do các tế bào thần kinh tiểu não rất nhạy cảm với áp lực và chiếm tỷ lệ thấp trong toàn bộ quần thể tế bào tiểu não, nên đối với nhiều nghiên cứu dựa trên omics, việc tách chúng một cách chọn lọc dưới dạng tế bào nguyên vẹn vẫn là một khía cạnh đầy thách thức. Mặc dù gần như không thể đạt được sự hoàn toàn không bị nhiễm bẩn bởi các loại tế bào khác (đặc biệt là các mô trưởng thành), chúng tôi đã kết hợp bước phân tách hiệu quả với FACS để thu được số lượng tế bào thần kinh khả thi đủ cho phân tích proteomics tiếp theo và có độ phủ protein khá cao (khoảng 3000 protein) so với bộ dữ liệu hiện có của toàn bộ tiểu não (51). Bằng cách bảo tồn khả năng sống của toàn bộ tế bào, phương pháp mà chúng tôi cung cấp ở đây cho phép chúng tôi không chỉ kiểm tra những thay đổi trong các con đường trao đổi chất trong ty thể mà còn kiểm tra những thay đổi trong các phần tương ứng của tế bào chất, bổ sung cho việc sử dụng thẻ màng ty thể để làm giàu loại tế bào. Phương pháp mới để tăng số lượng ty thể trong các mô phức tạp (52, 53). Phương pháp mà chúng tôi mô tả không chỉ liên quan đến nghiên cứu tế bào Purkinje mà còn có thể dễ dàng áp dụng cho bất kỳ loại tế bào nào để giải quyết những thay đổi trao đổi chất trong não bị bệnh, bao gồm cả các mô hình rối loạn chức năng ty thể khác.
Cuối cùng, chúng tôi đã xác định được một khoảng thời gian điều trị hiệu quả trong quá trình tái cấu trúc chuyển hóa này, có thể đảo ngược hoàn toàn các dấu hiệu chính của stress tế bào và ngăn ngừa thoái hóa thần kinh. Do đó, việc hiểu rõ ý nghĩa chức năng của quá trình tái cấu trúc được mô tả ở đây có thể cung cấp những hiểu biết cơ bản về các phương pháp điều trị khả thi để duy trì sự sống của tế bào thần kinh trong quá trình rối loạn chức năng ty thể. Cần có thêm nghiên cứu trong tương lai nhằm phân tích những thay đổi trong chuyển hóa năng lượng ở các loại tế bào não khác để làm rõ đầy đủ khả năng áp dụng nguyên tắc này cho các bệnh thần kinh khác.
Chuột MitoPark đã được mô tả trước đây (31). Chuột C57BL/6N với loxP bao quanh gen Mfn2 đã được mô tả trước đây (18) và được lai với chuột L7-Cre (23). Con lai dị hợp tử kép thu được sau đó được lai với chuột đồng hợp tử Mfn2loxP/Mfn2loxP để tạo ra các gen bị loại bỏ đặc hiệu Purkinje cho Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Trong một tập hợp con của quá trình lai tạo, alen Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) đã được đưa vào thông qua các phép lai bổ sung (20). Tất cả các quy trình trên động vật đều được thực hiện theo hướng dẫn của Châu Âu, quốc gia và tổ chức và được LandesamtfürNatur về Môi trường và Bảo vệ Người tiêu dùng, Bắc Rhine-Westphalia, Đức phê duyệt. Công việc trên động vật cũng tuân theo hướng dẫn của Liên đoàn các Hiệp hội Khoa học Động vật Thí nghiệm Châu Âu.
Sau khi gây mê và cắt bỏ cổ tử cung của chuột cái mang thai, phôi chuột được tách ra (E13). Vỏ não được tách ra trong dung dịch muối cân bằng Hanks (HBSS) bổ sung 10 mM Hepes và nuôi cấy trên môi trường Dulbecco's Modified Eagle's Medium chứa papain (20 U/ml) và cysteine ​​(1 μg/ml). Ủ mô trong DMEM và phân tách bằng phương pháp tiêu hóa enzyme. Ủ ở 37°C trong 20 phút, sau đó nghiền cơ học trong DMEM bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò. Các tế bào được gieo trên lam kính phủ polylysine với mật độ 2×10⁶ tế bào/đĩa nuôi cấy 6 cm hoặc với mật độ 0,5×10⁵ tế bào/cm² để phân tích hình ảnh. Sau 4 giờ, môi trường được thay thế bằng môi trường Neurobasal không chứa huyết thanh, có bổ sung 1% B27 và 0,5 mM GlutaMax. Các tế bào thần kinh sau đó được duy trì ở nhiệt độ 37°C và nồng độ CO2 5% trong suốt thí nghiệm và được cho ăn một lần mỗi tuần. Để gây ra sự tái tổ hợp trong ống nghiệm, 3μl (đĩa nuôi cấy 24 giếng) hoặc 0,5μl (đĩa 24 giếng) của vectơ virus AAV9 sau đây đã được sử dụng để xử lý các tế bào thần kinh vào ngày thứ hai trong ống nghiệm: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, mã số 105530-AAV9) và AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, mã số 105545-AAV9).
ADN bổ sung của chuột Mfn1 và Mfn2 (thu được từ plasmid Addgene #23212 và #23213 tương ứng) được đánh dấu bằng trình tự V5 (GKPIPNPLLGLDST) ở đầu C và được nối với mCherry theo khung thông qua trình tự T2A. Grx1-roGFP2 là quà tặng từ Heidelberg TP Dick DFKZ (Trung tâm Nghiên cứu Ung thư Đức). Bằng cách thay thế cassette tdTomato bằng các phương pháp nhân bản thông thường, cassette này được nhân bản phụ vào khung pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (số tham chiếu Addgene 28306) để tạo ra các vector pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 và pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Một chiến lược tương tự đã được sử dụng để tạo ra vector kiểm soát pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Để tạo ra cấu trúc AAV-shPCx, cần có một vector plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), chứa trình tự DNA mã hóa shRNA nhắm mục tiêu vào PCx của chuột (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Dưới sự kiểm soát của promoter U6, mCherry được sử dụng dưới sự kiểm soát của promoter CMV. Việc sản xuất các vector AAV phụ trợ được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Cell Biolabs). Tóm lại, sử dụng plasmid chuyển mang gen mã hóa mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) để chuyển nạp tạm thời vào tế bào 293AAV, cũng như gen mã hóa protein vỏ capsid AAV1 và protein phụ trợ. Plasmid đóng gói được sử dụng phương pháp canxi photphat. Dịch nổi virus thô được thu nhận bằng các chu kỳ đông lạnh-tan chảy trong bể đá khô/ethanol và tế bào được ly giải trong dung dịch đệm photphat (PBS). Vector AAV được tinh chế bằng phương pháp ly tâm siêu tốc gradient iodixanol không liên tục (24 giờ ở 32.000 vòng/phút và 4°C) và được cô đặc bằng bộ lọc ly tâm Amicon ultra-15. Nồng độ gen của AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 bản sao gen (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX được mô tả như trước đây (54), được đo bằng PCR định lượng thời gian thực (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) và AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Các tế bào thần kinh sơ cấp được cạo ra trong dung dịch PBS 1x lạnh, ly tâm tạo thành khối, sau đó được đồng nhất hóa trong dung dịch đệm ly giải PBS chứa 0,5% Triton X-100 / 0,5% natri deoxycholate/PBS có chứa chất ức chế phosphatase và protease (Roche). Định lượng protein được thực hiện bằng phương pháp xét nghiệm axit bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Sau đó, các protein được tách bằng điện di gel polyacrylamide SDS, rồi được thấm lên màng polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). Chặn các vị trí không đặc hiệu và ủ với kháng thể chính (xem Bảng S1 để biết chi tiết) trong dung dịch sữa 5% trong TBST (dung dịch muối đệm Tris với Tween), các bước rửa và ủ với kháng thể thứ cấp trong TBST. Ủ với kháng thể chính qua đêm ở +4°C. Sau khi rửa, thêm kháng thể thứ cấp trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, bằng cách ủ cùng một màng thấm với kháng thể chống β-actin, lượng protein được tải lên tương tự đã được xác nhận. Phát hiện bằng cách chuyển đổi sang trạng thái phát quang hóa học và tăng cường phát quang hóa học (GE Healthcare).
Các tế bào thần kinh đã được cấy trên lam kính được cố định bằng dung dịch paraformaldehyde (PFA) 4%/PBS tại thời điểm xác định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Lam kính được ngâm tẩm với dung dịch Triton X-100 0,1%/PBS trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ngâm trong dung dịch đệm chặn [albumin huyết thanh bò (BSA) 3%/PBS]. Vào ngày thứ hai, lam kính được rửa bằng dung dịch đệm chặn và ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp huỳnh quang thích hợp trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng; cuối cùng, các mẫu được rửa kỹ bằng PBS, nhuộm đối chứng bằng 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) và sau đó cố định trên lam kính hiển vi bằng Aqua-Poly/Mount.
Chuột (cả đực và cái) được gây mê bằng cách tiêm ketamine (130 mg/kg) và xylazine (10 mg/kg) vào khoang bụng, đồng thời tiêm dưới da thuốc giảm đau carprofen (5 mg/kg). Sau đó, chuột được đặt vào dụng cụ định vị não (Kopf) có gắn đệm ấm. Bộc lộ hộp sọ và dùng mũi khoan nha khoa để làm mỏng phần vỏ não tiểu não tương ứng với xương giữa (từ lambda: đuôi 1.8, bên 1, tương ứng với thùy IV và V). Dùng kim tiêm cong cẩn thận tạo một lỗ nhỏ trên hộp sọ để tránh làm tổn thương hệ mạch máu bên dưới. Sau đó, ống mao dẫn thủy tinh mỏng được từ từ đưa vào lỗ nhỏ (từ -1,3 đến -1 ở mặt bụng của màng cứng), và 200 đến 300 nl AAV được tiêm vào ống tiêm siêu nhỏ (Narishige) bằng ống tiêm thủ công (Narishige) nhiều lần ở áp suất thấp trong khoảng thời gian từ 10 đến 20 phút. Sau khi truyền dịch, giữ nguyên ống mao dẫn thêm 10 phút để virus lan tỏa hoàn toàn. Sau khi rút ống mao dẫn, da được khâu cẩn thận để giảm thiểu viêm vết thương và cho phép động vật hồi phục. Các động vật được điều trị bằng thuốc giảm đau (caspofen) trong vài ngày sau phẫu thuật, trong thời gian đó tình trạng thể chất của chúng được theo dõi cẩn thận và sau đó chúng được gây chết nhân đạo vào thời điểm đã định. Tất cả các thủ tục được thực hiện theo hướng dẫn của Châu Âu, quốc gia và tổ chức và được phê duyệt bởi LandesamtfürNatur về Môi trường và Bảo vệ Người tiêu dùng, Bắc Rhine-Westphalia, Đức.
Các động vật được gây mê bằng ketamine (100 mg/kg) và xylazine (10 mg/kg), và tim được truyền dịch bằng PBS 0,1 M trước, sau đó bằng PFA 4% trong PBS. Mô được mổ xẻ và cố định trong PFA 4%/PBS qua đêm ở 4°C. Dao rung (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Áo) được sử dụng để chuẩn bị các lát cắt dọc (dày 50 μm) từ não đã cố định trong PBS. Trừ khi có quy định khác, việc nhuộm các lát cắt trôi nổi tự do được thực hiện như mô tả ở trên (13) ở nhiệt độ phòng và khuấy. Tóm lại, trước tiên, các lát cắt thu được được thấm bằng Triton X-100 0,5%/PBS trong 15 phút ở nhiệt độ phòng; đối với một số epitope (Pcx và Shmt2), bằng cách làm nóng các lát cắt trong dung dịch đệm tris-EDTA ở 80°C (pH 9) trong 25 phút thay vì bước này. Tiếp theo, các lát cắt được ủ với kháng thể chính (xem Bảng S1) trong dung dịch đệm chặn (3% BSA/PBS) ở 4°C qua đêm với khuấy đều. Ngày hôm sau, các lát cắt được rửa bằng dung dịch đệm chặn và ủ với kháng thể phụ liên hợp huỳnh quang thích hợp trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng; cuối cùng, các lát cắt được rửa kỹ bằng PBS, nhuộm đối chứng bằng DAPI, và sau đó cố định bằng AquaPolymount trên lam kính hiển vi.
Kính hiển vi quét laser confocal (TCS SP8-X hoặc TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) được trang bị laser ánh sáng trắng và laser diode tia cực tím 405 nm được sử dụng để chụp ảnh mẫu. Bằng cách kích thích chất huỳnh quang và thu tín hiệu bằng đầu dò lai (HyDs), phần mềm LAS-X được sử dụng để thu thập các hình ảnh xếp chồng phù hợp với lấy mẫu Nyquist ở chế độ tuần tự: đối với các bảng không định lượng, đó là các tín hiệu động cao (ví dụ, trong tế bào soma và nhánh thần kinh) mtYFP) Sử dụng HyD để phát hiện số lượng PN ở chế độ BrightR). Việc lọc tín hiệu từ 0,3 đến 6 ns được áp dụng để giảm nhiễu nền.
Hình ảnh thời gian thực của các tế bào đã được phân loại. Sau khi phân loại trong môi trường Neurobasal-A chứa 1% chất bổ sung B27 và 0,5 mM GlutaMax, các tế bào được gieo ngay lập tức lên các lam kính phủ poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, mã số 80826), và sau đó giữ ở 37°C và 5% CO2 trong 1 giờ để các tế bào ổn định. Hình ảnh thời gian thực được thực hiện trên kính hiển vi quét laser confocal Leica SP8 được trang bị laser trắng, thấu kính vật kính dầu HyD 63× [khẩu độ số (NA) 1,4] và bàn gia nhiệt.
Chuột được gây mê nhanh chóng bằng khí carbon dioxide và chặt đầu, não được nhanh chóng lấy ra khỏi hộp sọ và cắt thành các lát cắt dọc dày 200μm (đối với thí nghiệm đánh dấu 13C) hoặc 275μm (đối với thí nghiệm hai photon) chứa đầy các vật liệu sau: Kem (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Đức) chứa 125 mM dung dịch NaCl bão hòa carbon lạnh (95% O2 và 5% CO2) có hàm lượng Ca2+ thấp + dịch não tủy nhân tạo (ACSF), 2,5 mM KCl, 1,25 mM dung dịch đệm natri photphat, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0,5 mM CaCl2 và 3,5 mM MgCl2 (áp suất thẩm thấu từ 310 đến 330 mmol). Chuyển các lát cắt não thu được vào buồng tiền ủ chứa dung dịch ACSF có nồng độ Ca2+ cao hơn (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM dung dịch đệm natri photphat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 và 2,0 mM MgCl2) (môi trường) pH 7,4 và 310 đến 320 mmol.
Trong quá trình chụp ảnh, các lát cắt được chuyển vào phòng chụp ảnh chuyên dụng, và thí nghiệm được thực hiện dưới sự tưới liên tục dung dịch ACSF ở nhiệt độ không đổi từ 32° đến 33°C. Kính hiển vi quét laser đa photon (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) được trang bị ống kính vật kính Leica 25x (NA 0.95, nước), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) được sử dụng để chụp ảnh lát cắt. Mô-đun FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM của Grx1-roGFP2. Sự thay đổi trạng thái oxy hóa khử trong tế bào chất của các tế bào thần kinh (PN) được đo bằng FLIM hai photon trên các lát cắt não theo mặt phẳng dọc, trong đó cảm biến sinh học Grx1-roGFP2 nhắm mục tiêu vào các PN. Trong lớp PN, trường thu nhận được chọn ở độ sâu khoảng 50 đến 80 μm bên dưới bề mặt lát cắt để đảm bảo có PN khả thi (nghĩa là không có cấu trúc dạng hạt hoặc thay đổi hình thái thần kinh dọc theo các nhánh dendrite) và cảm biến roGFP2 dương tính kép cùng với AAV mã hóa shRNA PCx hoặc trình tự kiểm soát của nó (mỗi loại đều đồng biểu hiện mCherry). Thu thập hình ảnh đơn lớp với độ phóng đại kỹ thuật số 2x [bước sóng kích thích: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Phát hiện: HyD nội bộ, nhóm lọc fluorescein isothiocyanate (FITC)] và trung bình hóa hình ảnh trong vòng 2 đến 3 phút được sử dụng để đảm bảo thu thập đủ photon (tổng cộng 1000 photon) cho việc khớp đường cong. Độ nhạy của đầu dò Grx1-roGFP2 và việc xác minh các điều kiện FLIM được thực hiện bằng cách theo dõi giá trị tuổi thọ của roGFP2 khi thêm 10 mM H2O2 ngoại sinh vào dung dịch ACSF (để tối đa hóa quá trình oxy hóa, dẫn đến tăng tuổi thọ), và sau đó thêm 2 mM dithiothreitol (giảm thiểu mức độ khử, dẫn đến giảm tuổi thọ) (Hình S8, D đến G). Sử dụng phần mềm FLIMfit 5.1.1 để phân tích các kết quả thu được, khớp đường cong suy giảm hàm mũ đơn của toàn bộ hình ảnh với IRF (hàm đáp ứng của thiết bị) đo được, và χ2 xấp xỉ 1. Để tính toán tuổi thọ của một PN đơn lẻ, mặt nạ xung quanh thân dây thần kinh được vẽ thủ công, và tuổi thọ trung bình trong mỗi mặt nạ được sử dụng để định lượng.
Phân tích điện thế ty thể. Sau khi mẫu mô cấp tính được ủ với 100 nM TMRM được thêm trực tiếp vào dung dịch ACSF trong 30 phút, sự thay đổi điện thế ty thể của tế bào thần kinh Purkinje (PN) được đo bằng kính hiển vi hai photon. Hình ảnh TMRM được thực hiện bằng cách kích thích đầu dò ở bước sóng 920 nm và sử dụng HyD nội bào (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) để thu tín hiệu; bằng cách sử dụng cùng bước sóng kích thích nhưng sử dụng HyD nội bào khác (FITC: 525/50) để chụp ảnh mtYFP. Sử dụng plugin Image Calculator của ImageJ để đánh giá điện thế ty thể ở cấp độ tế bào đơn. Tóm lại, phương trình plugin: tín hiệu = min (mtYFP, TMRM) được sử dụng để xác định vùng ty thể hiển thị tín hiệu TMRM trong tế bào Purkinje Somali trong hình ảnh confocal đơn lớp của kênh tương ứng. Sau đó, diện tích pixel trong mặt nạ thu được sẽ được định lượng và chuẩn hóa trên ảnh đơn lớp ngưỡng tương ứng của kênh mtYFP để thu được phần ty thể thể hiện điện thế ty thể.
Hình ảnh được khử nhiễu bằng phần mềm Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Đối với các hình ảnh quét của gạch, việc ghép ảnh một viên gạch được thực hiện bằng thuật toán ghép tự động do phần mềm LAS-X cung cấp. Sau khi hiệu chỉnh hình ảnh, sử dụng ImageJ và Adobe Photoshop để xử lý hình ảnh thêm và điều chỉnh độ sáng và độ tương phản đồng đều. Sử dụng Adobe Illustrator để chuẩn bị đồ họa.
Phân tích tiêu điểm mtDNA. Số lượng tổn thương mtDNA được định lượng trên các lát cắt tiểu não được đánh dấu bằng kháng thể chống DNA bằng kính hiển vi confocal. Mỗi vùng mục tiêu được tạo ra cho thân tế bào và nhân của mỗi tế bào, và diện tích tương ứng được tính toán bằng cách sử dụng plugin Multi Measure (phần mềm ImageJ). Trừ diện tích nhân khỏi diện tích thân tế bào để thu được diện tích tế bào chất. Cuối cùng, plugin Analyze Particles (phần mềm ImageJ) được sử dụng để tự động định lượng các điểm DNA tế bào chất biểu thị mtDNA trên ảnh ngưỡng, và các kết quả thu được được chuẩn hóa theo giá trị trung bình PN của chuột CTRL. Kết quả được biểu thị dưới dạng số lượng nucleoside trung bình trên mỗi tế bào.
Phân tích biểu hiện protein. Sử dụng plugin Image Calculator của ImageJ để đánh giá biểu hiện protein trong PN ở cấp độ tế bào đơn. Nói tóm lại, trong ảnh confocal đơn lớp của kênh tương ứng, thông qua phương trình: tín hiệu = min (mtYFP, kháng thể), vùng ty thể thể hiện phản ứng miễn dịch với một kháng thể nhất định trong Purkinje được xác định. Sau đó, diện tích pixel trong mặt nạ thu được được định lượng, và sau đó được chuẩn hóa trên ảnh đơn lớp ngưỡng tương ứng của kênh mtYFP để thu được phần ty thể của protein được hiển thị.
Phân tích mật độ tế bào Purkinje. Phần mềm Cell Counter của ImageJ được sử dụng để đánh giá mật độ tế bào Purkinje bằng cách chia số lượng tế bào Purkinje đếm được cho chiều dài vòng tiểu não mà các tế bào đó chiếm giữ.
Chuẩn bị và thu thập mẫu. Não của nhóm đối chứng và chuột Mfn2cKO được cố định trong dung dịch 2% PFA/2,5% glutaraldehyde trong dung dịch đệm phosphate 0,1 M (PB), sau đó cắt lát ngang bằng kính hiển vi (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Áo) (độ dày 50 đến 60 μm). Tiếp theo, cố định trong dung dịch đệm PB với 1% os tetraoxide và 1,5% kali ferrocyanide ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Các lát cắt được rửa ba lần bằng nước cất, sau đó nhuộm bằng ethanol 70% chứa 1% uranyl acetate trong 20 phút. Sau đó, các lát cắt được khử nước bằng cồn theo nồng độ tăng dần và nhúng trong nhựa epoxy Durcupan ACM (nhựa đúc Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, mã số 14040) giữa các lam kính phủ silicon, và cuối cùng được trùng hợp trong lò ở 60°C trong 48 giờ. Vùng vỏ não tiểu não được chọn và các lát cắt siêu mỏng 50 nm được cắt bằng máy Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Áo) và được đặt trên lưới đồng có khe hở 2×1 mm phủ màng polystyrene. Các lát cắt được nhuộm bằng dung dịch uranyl acetate 4% trong nước trong 10 phút, rửa nhiều lần bằng nước, sau đó nhuộm bằng dung dịch chì citrate Reynolds trong nước trong 10 phút, và sau đó rửa lại nhiều lần bằng nước. Ảnh hiển vi được chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ) sử dụng camera kỹ thuật số TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Đức).
Đối với chuột bị nhiễm AAV, não được tách ra và cắt thành lát mỏng 1 mm theo mặt phẳng dọc, sau đó tiểu não được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang để xác định vòng bị nhiễm AAV (tức là biểu hiện mCherry). Chỉ những thí nghiệm mà việc tiêm AAV mang lại hiệu quả chuyển gen rất cao ở lớp tế bào Purkinje (tức là gần như toàn bộ lớp) trong ít nhất hai vòng tiểu não liên tiếp mới được sử dụng. Vòng tiểu não được chuyển gen bằng AAV được vi phẫu để cố định qua đêm (4% PFA và 2,5% glutaraldehyde trong dung dịch đệm cocoate 0,1 M) và xử lý tiếp. Để nhúng EPON, mô đã cố định được rửa bằng dung dịch đệm sodium cocoate 0,1 M (Applichem), và ủ với 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) trong dung dịch đệm sodium cocoate 0,1 M (Applichem) trong 4 giờ, sau đó rửa trong 2 giờ. Lặp lại 3 lần với dung dịch đệm cocamide 0,1 M. Tiếp theo, sử dụng dung dịch ethanol có nồng độ tăng dần để ủ từng dung dịch ở 4°C trong 15 phút nhằm khử nước mô. Mô được chuyển sang propylene oxide và ủ qua đêm trong EPON (Sigma-Aldrich) ở 4°C. Đặt mô vào EPON mới ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, sau đó nhúng vào dung dịch ở 62°C trong 72 giờ. Sử dụng máy cắt siêu nhỏ (Leica Microsystems, UC6) và dao kim cương (Diatome, Biel, Thụy Sĩ) để cắt các lát siêu mỏng 70 nm, nhuộm bằng dung dịch uranyl acetate 1,5% trong 15 phút ở 37°C, và nhuộm bằng dung dịch chì citrate trong 4 phút. Ảnh hiển vi điện tử được chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua JEM-2100 Plus (JEOL) được trang bị Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) và phần mềm DigitalMicrograph (Gatan). Để phục vụ cho việc phân tích, ảnh hiển vi điện tử được chụp với độ phóng đại kỹ thuật số 5000× hoặc 10.000×.
Phân tích hình thái học của ty thể. Đối với tất cả các phân tích, đường viền của từng ty thể được vẽ thủ công trên ảnh kỹ thuật số bằng phần mềm ImageJ. Các thông số hình thái khác nhau được phân tích. Mật độ ty thể được biểu thị bằng phần trăm thu được bằng cách chia tổng diện tích ty thể của mỗi tế bào cho diện tích tế bào chất (diện tích tế bào chất = diện tích tế bào - diện tích nhân tế bào) × 100. Độ tròn của ty thể được tính bằng công thức [4π∙(diện tích/chu vi²)]. Hình thái ista của ty thể được phân tích và chia thành hai loại (“hình ống” và “hình phồng”) theo hình dạng chính của chúng.
Phân tích số lượng và mật độ thể tự thực/lysosome. Sử dụng phần mềm ImageJ để vẽ thủ công đường viền của từng thể tự thực/lysosome trong ảnh kỹ thuật số. Diện tích thể tự thực/lysosome được biểu thị bằng phần trăm, tính bằng cách chia tổng diện tích cấu trúc thể tự thực/lysosome của mỗi tế bào cho diện tích tế bào chất (diện tích tế bào chất = diện tích tế bào - diện tích nhân) × 100. Mật độ thể tự thực/lysosome được tính bằng cách chia tổng số lượng cho số lượng cấu trúc thể tự thực/lysosome trên mỗi tế bào (tính theo diện tích tế bào chất) (diện tích tế bào chất = diện tích tế bào - diện tích nhân).
Quy trình gắn nhãn cho việc cắt lát mô não cấp tính và chuẩn bị mẫu. Đối với các thí nghiệm yêu cầu gắn nhãn glucose, hãy chuyển các lát mô não cấp tính vào buồng ủ sơ bộ, chứa carbon bão hòa (95% O2 và 5% CO2), Ca2+ ACSF nồng độ cao (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM dung dịch đệm natri photphat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 và 2,0 mM MgCl2, điều chỉnh đến pH 7,4 và 310 đến 320 mOsm), trong đó glucose được thay thế bằng 13C6-Glucose (Eurisotop, mã số CLM-1396). Đối với các thí nghiệm yêu cầu gắn nhãn pyruvate, chuyển các lát cắt não cấp tính sang dung dịch ACSF có nồng độ Ca2+ cao hơn (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM dung dịch đệm natri photphat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 và thêm 2,0 mM MgCl2, điều chỉnh pH đến 7,4 và độ thẩm thấu từ 310 đến 320 mOsm), và thêm 1 mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, mã số CLM-1082). Ủ các lát cắt trong 90 phút ở 37°C. Sau khi kết thúc thí nghiệm, các lát cắt được rửa nhanh bằng dung dịch nước (pH 7,4) chứa 75 mM amoni cacbonat, sau đó được đồng nhất hóa trong hỗn hợp 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: nước. Sau khi các lát cắt được ủ trên đá trong 30 phút, các mẫu được ly tâm ở 21.000 g trong 10 phút ở 4°C, và phần dịch trong suốt được làm khô bằng máy cô đặc SpeedVac. Phần cặn chuyển hóa khô thu được được bảo quản ở -80°C cho đến khi phân tích.
Phân tích sắc ký lỏng-khối phổ của các axit amin được đánh dấu bằng 13C. Để phân tích sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS), cặn chất chuyển hóa được hòa tan lại trong 75μl nước tinh khiết dùng cho LC-MS (Honeywell). Sau khi ly tâm ở 21.000 g trong 5 phút ở 4°C, 20 μl dịch nổi đã được làm trong được sử dụng để phân tích dòng axit amin, trong khi phần còn lại của dịch chiết được sử dụng ngay lập tức để phân tích anion (xem bên dưới). Phân tích axit amin được thực hiện bằng cách sử dụng quy trình dẫn xuất benzoyl clorua đã được mô tả trước đây (55, 56). Trong bước đầu tiên, 10μl natri cacbonat 100 mM (Sigma-Aldrich) được thêm vào 20μl dịch chiết chất chuyển hóa, sau đó 10μl benzoyl clorua 2% (Sigma-Aldrich) được thêm vào ACN tinh khiết dùng cho LC. Mẫu được lắc đều trong thời gian ngắn rồi ly tâm ở 21.000 g trong 5 phút ở 20°C. Chuyển phần dịch nổi đã được làm trong vào lọ lấy mẫu tự động 2 ml có ống lót thủy tinh hình nón (thể tích 200 μl). Các mẫu được phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cực cao Acquity iClass (Waters) kết nối với máy quang phổ khối chính xác độ phân giải cao Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Để phân tích, 2 μl mẫu đã được dẫn xuất được tiêm vào cột silica T3 cường độ cao 100×1,0 mm (Waters) chứa các hạt 1,8 μm. Tốc độ dòng chảy là 100 μl/phút, và hệ đệm bao gồm đệm A (10 mM amoni formate và 0,15% axit formic trong nước) và đệm B (ACN). Gradient như sau: 0%B ở 0 phút; 0%B. 0 đến 15% B trong khoảng thời gian từ 0 đến 0,1 phút; 15 đến 17% B trong khoảng thời gian từ 0,1 đến 0,5 phút; B ở mức 17 đến 55% trong khoảng thời gian từ 0,5 đến 14 phút; B ở mức 55 đến 70% trong khoảng thời gian từ 14 đến 14,5 phút; ở mức 14,5 đến 70 đến 100% B trong khoảng thời gian 18 phút; 100% B trong khoảng thời gian từ 18 đến 19 phút; 100 đến 0% B trong khoảng thời gian từ 19 đến 19,1 phút; 0% B trong khoảng thời gian từ 19,1 đến 28 phút (55, 56). Máy quang phổ khối QE-HF hoạt động ở chế độ ion hóa dương với dải khối lượng m/z (tỷ lệ khối lượng/điện tích) từ 50 đến 750. Độ phân giải được áp dụng là 60.000, và mục tiêu ion điều khiển khuếch đại (AGC) thu được là 3×10⁶, và thời gian ion tối đa là 100 mili giây. Nguồn ion hóa phun điện (ESI) được gia nhiệt hoạt động ở điện áp phun 3,5 kV, nhiệt độ mao dẫn 250°C, lưu lượng khí bao phủ 60 AU (đơn vị tùy ý) và lưu lượng khí phụ trợ 20 AU. 250°C. Thấu kính S được đặt ở 60 AU.
Phân tích sắc ký anion-MS của các axit hữu cơ được đánh dấu bằng 13C. Kết tủa chất chuyển hóa còn lại (55μl) được phân tích bằng hệ thống sắc ký ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) kết nối với máy quang phổ khối QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Tóm lại, 5μl dịch chiết chất chuyển hóa được tiêm vào cột Dionex IonPac AS11-HC được trang bị HPLC (2 mm×250 mm, kích thước hạt 4μm, Thermo Fisher Scientific) ở chế độ vòng lặp một phần đẩy vào với tỷ lệ nạp là 1. Cột bảo vệ Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Nhiệt độ cột được duy trì ở 30°C, và bộ lấy mẫu tự động được đặt ở 6°C. Sử dụng hộp chứa kali hydroxit kèm nước khử ion để tạo gradient kali hydroxit thông qua bộ tạo dung dịch rửa giải. Quá trình tách các chất chuyển hóa được thực hiện ở tốc độ dòng chảy 380 μl/phút, áp dụng gradient như sau: 0 đến 3 phút, 10 mM KOH; 3 đến 12 phút, 10 đến 50 mM KOH; 12 đến 19 phút, 50 đến 100 mM KOH; 19 đến 21 phút, 100 mM KOH; 21 đến 21,5 phút, 100 đến 10 mM KOH. Cột được cân bằng lại dưới dung dịch 10 mM KOH trong 8,5 phút.
Các chất chuyển hóa được tách chiết được kết hợp với dòng bổ sung isopropanol 150μl/min sau cột sắc ký và sau đó được dẫn đến máy quang phổ khối độ phân giải cao hoạt động ở chế độ ion hóa âm. Máy quang phổ khối theo dõi dải khối lượng từ m/z 50 đến 750 với độ phân giải 60.000. Chế độ AGC được đặt là 1×10⁶, và thời gian ion tối đa được giữ ở mức 100 ms. Nguồn ion hóa điện tử gia nhiệt (ESI) được vận hành ở điện áp phun 3,5 kV. Các cài đặt khác của nguồn ion như sau: nhiệt độ mao dẫn 275°C; lưu lượng khí bao phủ, 60 AU; lưu lượng khí phụ trợ, 20 AU ở 300°C, và cài đặt thấu kính S là 60 AU.
Phân tích dữ liệu của các chất chuyển hóa được đánh dấu bằng 13C. Sử dụng phần mềm TraceFinder (phiên bản 4.2, Thermo Fisher Scientific) để phân tích dữ liệu tỷ lệ đồng vị. Danh tính của mỗi hợp chất được xác minh bằng một hợp chất tham chiếu đáng tin cậy và được phân tích độc lập. Để thực hiện phân tích làm giàu đồng vị, diện tích của sắc ký đồ ion được trích xuất (XIC) của mỗi đồng vị 13C (Mn) được trích xuất từ ​​[M + H] +, trong đó n là số carbon của hợp chất mục tiêu, được sử dụng để phân tích axit amin hoặc [ MH] + được sử dụng để phân tích anion. Độ chính xác khối lượng của XIC nhỏ hơn năm phần triệu và độ chính xác của RT là 0,05 phút. Phân tích làm giàu được thực hiện bằng cách tính tỷ lệ của mỗi đồng vị được phát hiện so với tổng tất cả các đồng vị của hợp chất tương ứng. Các tỷ lệ này được đưa ra dưới dạng giá trị phần trăm cho mỗi đồng vị và kết quả được biểu thị dưới dạng phần trăm làm giàu mol (MPE), như đã mô tả trước đây (42).
Khối tế bào thần kinh đông lạnh được đồng nhất hóa trong methanol 80% lạnh (v/v), khuấy đều và ủ ở -20°C trong 30 phút. Khuấy đều mẫu một lần nữa và khuấy ở +4°C trong 30 phút. Mẫu được ly tâm ở 21.000 g trong 5 phút ở 4°C, sau đó dịch nổi thu được được thu thập và làm khô bằng máy cô đặc SpeedVac ở 25°C để phân tích tiếp theo. Như đã mô tả ở trên, phân tích LC-MS được thực hiện trên các axit amin của các tế bào đã được phân loại. Sử dụng TraceFinder (phiên bản 4.2, Thermo Fisher Scientific), phân tích dữ liệu được thực hiện bằng cách sử dụng khối lượng đồng vị đơn của mỗi hợp chất. Chuẩn hóa định lượng dữ liệu chất chuyển hóa được thực hiện bằng cách sử dụng gói phần mềm preprocessCore (57).
Chuẩn bị lát cắt. Chuột được gây mê nhanh chóng bằng khí carbon dioxide và chặt đầu, não được nhanh chóng lấy ra khỏi hộp sọ, và dao rung chứa đá (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Đức) được sử dụng để cắt thành các lát cắt dọc dày 300 đến 375 μm. Khí hóa carbon lạnh (95% O2 và 5% CO2). Nồng độ Ca2+ thấp + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM dung dịch đệm natri photphat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 và 6,0 mM MgCl2). Điều chỉnh đến pH 7,4 và 310 đến 330 mOsm. Chuyển các lát cắt não thu được vào buồng chứa dung dịch ACSF có nồng độ Ca2+ cao hơn (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM dung dịch đệm natri photphat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 4,0 mM CaCl2 và 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 và 310 đến 320 mOsm). Lưu trữ các lát cắt trong 20 đến 30 phút để chúng có thể phục hồi trước khi ghi điện não đồ.
Ghi điện thế. Tất cả các lần ghi đều sử dụng bàn kính hiển vi được trang bị buồng ghi cố định và thấu kính vật kính ngâm nước 20x (Scientifica). Các tế bào Purkinje giả định được xác định bằng (i) kích thước cơ thể, (ii) vị trí giải phẫu của tiểu não và (iii) biểu hiện của gen báo cáo huỳnh quang mtYFP. Ống hút điện cực có điện trở đầu tip từ 5 đến 11 megohm được kéo ra bằng mao quản thủy tinh borosilicate (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Đức) và pipette ngang (P-1000, Sutter, Novato, CA). Tất cả các lần ghi được thực hiện bằng bộ khuếch đại kẹp điện cực ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Đức), được điều khiển bởi phần mềm Signal (phiên bản 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Anh). Thí nghiệm được ghi lại ở tốc độ lấy mẫu 12,5 kHz. Tín hiệu được lọc bằng hai bộ lọc Bessel thông ngắn với tần số cắt lần lượt là 1,3 và 10 kHz. Điện dung của màng và pipet được bù trừ bằng mạch bù sử dụng bộ khuếch đại. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện dưới sự điều khiển của camera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Đức), được điều khiển bởi phần mềm Hokawo (phiên bản 2.8, Hamamatsu, Gerden, Đức).
Cấu hình và phân tích tế bào toàn thể thông thường. Ngay trước khi ghi, đổ đầy pipet bằng dung dịch nội bào chứa các chất sau: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kali gluconat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosin triphosphat (GTP) (Na) và 10,0 mM creatinin phosphat được điều chỉnh đến pH 7,25, và áp suất thẩm thấu là 290 mOsm (sucrose). Ngay sau khi tác dụng lực 0 pA để phá vỡ màng, điện thế màng nghỉ được đo. Điện trở đầu vào được đo bằng cách áp dụng dòng điện phân cực âm -40, -30, -20 và -10 pA. Đo biên độ đáp ứng điện áp và sử dụng định luật Ohm để tính toán điện trở đầu vào. Hoạt động tự phát được ghi lại trong chế độ kẹp điện áp trong 5 phút, và sPSC được xác định và đo bằng phần mềm Igor Pro (phiên bản 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) sử dụng kịch bản nhận dạng bán tự động. Đường cong IV và dòng điện trạng thái ổn định được đo bằng cách kẹp pin ở các điện thế khác nhau (bắt đầu từ -110 mV) và tăng điện áp theo từng bước 5 mV. Việc tạo ra AP được kiểm tra bằng cách áp dụng dòng điện khử cực. Kẹp tế bào ở -70 mV trong khi áp dụng xung dòng điện khử cực. Điều chỉnh kích thước bước của từng đơn vị ghi riêng biệt (từ 10 đến 60 pA). Tính toán tần số AP tối đa bằng cách đếm thủ công các xung điện gây ra tần số AP cao nhất. Ngưỡng AP được phân tích bằng cách sử dụng đạo hàm bậc hai của xung khử cực kích hoạt một hoặc nhiều AP đầu tiên.
Cấu hình và phân tích vá màng tế bào có lỗ thủng. Thực hiện ghi điện thế vá màng tế bào có lỗ thủng bằng các giao thức tiêu chuẩn. Sử dụng pipet không chứa ATP và GTP, không chứa các thành phần sau: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA và 2 mM MgCl2, và điều chỉnh pH đến 7,2 (sử dụng KOH). ATP và GTP được loại bỏ khỏi dung dịch nội bào để ngăn ngừa sự thẩm thấu không kiểm soát của màng tế bào. Pipet vá màng tế bào được đổ đầy dung dịch nội bào chứa amphotericin (khoảng 200 đến 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) để thu được bản ghi điện thế vá màng tế bào có lỗ thủng. Amphotericin được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (nồng độ cuối cùng: 0,1 đến 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Nồng độ DMSO được sử dụng không có ảnh hưởng đáng kể đến các tế bào thần kinh được nghiên cứu. Trong quá trình đục lỗ, điện trở kênh (Ra) được theo dõi liên tục, và thí nghiệm được bắt đầu sau khi biên độ của Ra và AP ổn định (20-40 phút). Hoạt động tự phát được đo trong chế độ kẹp điện áp và/hoặc dòng điện trong 2 đến 5 phút. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng Igor Pro (phiên bản 7.05.2, WaveMetrics, Hoa Kỳ), Excel (phiên bản 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Hoa Kỳ) và GraphPad Prism (phiên bản 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Hoa Kỳ). Để xác định các AP tự phát, phần mềm bổ trợ NeuroMatic v3.0c của IgorPro được sử dụng. Phần mềm tự động xác định AP bằng cách sử dụng ngưỡng nhất định, được điều chỉnh riêng cho từng bản ghi. Sử dụng khoảng thời gian giữa các xung, xác định tần số xung với tần số xung tức thời tối đa và tần số xung trung bình.
Phân lập PN. Bằng cách điều chỉnh theo quy trình đã được công bố trước đó, PN được tinh chế từ tiểu não chuột ở giai đoạn xác định (58). Tóm lại, tiểu não được mổ xẻ và băm nhỏ trong môi trường phân tách lạnh [không có HBSS Ca2+ và Mg2+, bổ sung 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) và streptomycin (0,05 mg/ml)], sau đó tiêu hóa môi trường trong papain [HBSS, bổ sung 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) và deoxyribonuclease I (DNase I; 0,1 mg/ml)] Xử lý trong 30 phút ở 30°C. Đầu tiên, rửa mô trong môi trường HBSS chứa chất nhầy trứng (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) và DNase (0,1 mg/ml) ở nhiệt độ phòng để ngăn ngừa sự phân giải enzyme, sau đó nghiền nhẹ trong môi trường HBSS chứa 20 mM glucose. Tách các tế bào đơn lẻ trong HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0,05 mg/ml) và DNase (0,1 mg/ml). Dịch huyền phù tế bào thu được được lọc qua màng lọc tế bào 70μm, sau đó các tế bào được lắng bằng ly tâm (1110 vòng/phút, 5 phút, 4°C) và huyền phù lại trong môi trường phân loại [HBSS, bổ sung 20 mM glucose, 20% huyết thanh bào thai bò, penicillin (50 U/ml) và streptomycin (0,05 mg/ml)]; đánh giá khả năng sống của tế bào bằng propidium iodide và điều chỉnh mật độ tế bào đến 1×10⁶ đến 2×10⁶ tế bào/ml. Trước khi phân tích bằng máy đo tế bào dòng chảy, dịch huyền phù được lọc qua màng lọc tế bào 50 μm.
Máy đo lưu lượng tế bào. Phân loại tế bào được thực hiện ở 4°C bằng máy FACSAria III (BD Biosciences) và phần mềm FACSDiva (BD Biosciences, phiên bản 8.0.1). Dịch huyền phù tế bào được phân loại bằng vòi phun 100 μm dưới áp suất 20 psi với tốc độ ~2800 sự kiện/giây. Vì các tiêu chí phân loại truyền thống (kích thước tế bào, phân biệt hai đỉnh và đặc điểm tán xạ) không thể đảm bảo sự phân lập chính xác PN khỏi các loại tế bào khác, nên chiến lược phân loại được thiết lập dựa trên sự so sánh trực tiếp cường độ YFP và huỳnh quang tự nhiên ở chuột mitoYFP+ ​​​​và chuột đối chứng mitoYFP −. YFP được kích thích bằng cách chiếu xạ mẫu bằng tia laser 488 nm, và tín hiệu được phát hiện bằng bộ lọc thông dải 530/30 nm. Ở chuột mitoYFP+ ​​​​, cường độ tương đối của gen báo cáo Rosa26-mitoYFP cũng được sử dụng để phân biệt thân tế bào thần kinh và các mảnh sợi trục. 7-AAD được kích thích bằng tia laser vàng 561 nm và được phát hiện bằng bộ lọc dải tần 675/20 nm để loại trừ các tế bào chết. Để tách riêng các tế bào hình sao cùng lúc, huyền dịch tế bào được nhuộm bằng ACSA-2-APC, sau đó mẫu được chiếu xạ bằng tia laser 640 nm, và bộ lọc dải tần 660/20 nm được sử dụng để phát hiện tín hiệu.
Các tế bào thu thập được được lắng bằng phương pháp ly tâm (1110 vòng/phút, 5 phút, 4°C) và bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng. Chuột Mfn2cKO và chuột con cùng lứa được phân loại trong cùng một ngày để giảm thiểu sự biến đổi trong quy trình. Việc trình bày và phân tích dữ liệu FACS được thực hiện bằng phần mềm FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Hoa Kỳ).
Như đã đề cập ở trên (59), PCR thời gian thực được sử dụng để phân lập DNA từ các tế bào thần kinh đã được phân loại để định lượng mtDNA sau đó. Độ tuyến tính và độ nhạy ngưỡng ban đầu được kiểm tra bằng cách chạy qPCR trên số lượng tế bào khác nhau. Tóm lại, thu thập 300 PN trong dung dịch đệm ly giải gồm 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 và proteinase K (200 ng/ml) và ủ ở 55°C trong 120 phút. Các tế bào tiếp tục được ủ ở 95°C trong 10 phút để đảm bảo proteinase K bị bất hoạt hoàn toàn. Sử dụng đầu dò TaqMan (Thermo Fisher) đặc hiệu với mt-Nd1, mtDNA được đo bằng PCR bán định lượng trong hệ thống PCR thời gian thực 7900HT (Thermo Fisher Scientific). các gen mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, mã số Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, mã số AIVI3E8) và 18S (Thermo Fisher Scientific, mã số Hs99999901_s1).
Chuẩn bị mẫu proteome. Bằng cách đun nóng dung dịch ở 95°C trong 10 phút và siêu âm, trong dung dịch đệm ly giải [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide và 100 mM tris- Lyse các viên tế bào thần kinh đông lạnh trong HCl]. Trên máy Bioruptor (Diagenode) trong 10 phút (xung 30 giây / thời gian tạm dừng 30 giây). Mẫu được pha loãng 1:10 trong 20 mM tris-HCl (pH 8.0), trộn với 300 ng trypsin gold (Promega), và ủ qua đêm ở 37°C để đạt được sự tiêu hóa hoàn toàn. Vào ngày thứ hai, mẫu được ly tâm ở 20.000 g trong 20 phút. Phần dịch nổi được pha loãng với 0,1% axit formic, và dung dịch được khử muối bằng StageTips tự chế. Mẫu được sấy khô trong thiết bị SpeedVac (máy cô đặc Eppendorf plus 5305) ở 45°C, sau đó peptide được hòa tan trong axit formic 0,1%. Tất cả các mẫu được chuẩn bị đồng thời bởi cùng một người. Để phân tích mẫu tế bào hình sao, 4 μg peptide đã khử muối được gắn nhãn bằng thẻ khối lượng song song (TMT10plex, mã số 90110, Thermo Fisher Scientific) với tỷ lệ peptide so với thuốc thử TMT là 1:20. Để gắn nhãn TMT, 0,8 mg thuốc thử TMT được hòa tan lại trong 70 μl ACN khan, và peptide đã sấy khô được hòa tan lại trong 9 μl TEAB (triethylammonium bicarbonate) 0,1 M, sau đó thêm 7 μl thuốc thử TMT trong ACN. Nồng độ là 43,75%. Sau 60 phút ủ, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 2 μl hydroxylamine 5%. Các peptide được đánh dấu được thu thập, làm khô, hòa tan lại trong 200 μl axit formic (FA) 0,1%, chia làm hai phần, sau đó khử muối bằng StageTips tự chế. Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cực cao UltiMate 3000, một trong hai phần được phân tách trên cột sắc ký Acquity 1mm x 150mm chứa các hạt C18 130Å x 1,7 μm (Waters, mã số SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Tách các peptide ở tốc độ dòng chảy 30μl/phút, tách từ 1% đến 50% dung dịch đệm B trong 85 phút với gradient từng bước trong 96 phút, từ 50% đến 95% dung dịch đệm B trong 3 phút, sau đó 8 phút với 95% dung dịch đệm B; Dung dịch đệm A là 5% ACN và 10 mM amoni bicacbonat (ABC), và dung dịch đệm B là 80% ACN và 10 mM ABC. Thu thập các phân đoạn sau mỗi 3 phút và kết hợp chúng thành hai nhóm (1 + 17, 2 + 18, v.v.) và làm khô chúng trong máy ly tâm chân không.
Phân tích LC-MS/MS. Đối với phép đo khối phổ, các peptide (số r119.aq) được tách trên cột phân tích PicoFrit dài 25 cm, đường kính trong 75 μm (thấu kính mục tiêu mới, mã số PF7508250) được trang bị môi trường ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), sử dụng EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Đức). Cột được duy trì ở 50°C. Dung dịch đệm A và B lần lượt là axit formic 0,1% trong nước và axit formic 0,1% trong ACN 80%. Các peptide được tách từ 6% đến 31% dung dịch đệm B trong 65 phút và từ 31% đến 50% dung dịch đệm B trong 5 phút với tốc độ dòng 200 nl/min. Các peptide được tách chiết được phân tích trên máy quang phổ khối Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Phép đo m/z của tiền chất peptide được thực hiện với độ phân giải 120.000 trong phạm vi 350 đến 1500 m/z. Sử dụng năng lượng va chạm chuẩn hóa 27%, tiền chất mạnh nhất với trạng thái điện tích từ 2 đến 6 được chọn để phân cắt bằng bẫy C năng lượng cao (HCD). Thời gian chu kỳ được đặt là 1 giây. Giá trị m/z của mảnh peptide được đo trong bẫy ion bằng cách sử dụng mục tiêu AGC nhỏ nhất là 5×104 và thời gian tiêm tối đa là 86 ms. Sau khi phân mảnh, tiền chất được đưa vào danh sách loại trừ động trong 45 giây. Các peptide được gắn nhãn TMT được tách trên cột Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, mã số 164942), và phổ di chuyển được phân tích trên máy quang phổ khối Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) được trang bị thiết bị ion dạng sóng bất đối xứng trường cao (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) hoạt động ở hai điện áp bù -50 và -70 V. MS3 được chọn dựa trên tiền chất đồng bộ hóa được sử dụng để đo tín hiệu ion báo cáo TMT. Quá trình tách peptide được thực hiện trên EASY-nLC 1200, sử dụng phương pháp rửa giải gradient tuyến tính 90%, với nồng độ dung dịch đệm từ 6% đến 31%; dung dịch đệm A là 0,1% FA, và dung dịch đệm B là 0,1% FA và 80% ACN. Cột phân tích được vận hành ở 50°C. Sử dụng FreeStyle (phiên bản 1.6, Thermo Fisher Scientific) để tách tệp gốc theo điện áp bù FAIMS.
Nhận dạng và định lượng protein. Sử dụng công cụ tìm kiếm Andromeda tích hợp, dữ liệu gốc được phân tích bằng MaxQuant phiên bản 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ngoài trình tự Cre recombinase và YFP thu được từ Aequorea victoria, phổ mảnh peptide được tìm kiếm trình tự chuẩn và trình tự đồng phân của proteome tham chiếu chuột (ID Proteome UP000000589, tải xuống từ UniProt vào tháng 5 năm 2017). Quá trình oxy hóa methionine và acetyl hóa đầu N của protein được thiết lập là các biến đổi có thể thay đổi; quá trình methyl hóa carbamoyl cysteine ​​được thiết lập là các biến đổi cố định. Các thông số tiêu hóa được đặt là “đặc hiệu” và “trypsin/P”. Số lượng tối thiểu các peptide và peptide razor được sử dụng để nhận dạng protein là 1; số lượng tối thiểu các peptide duy nhất là 0. Trong điều kiện khớp bản đồ peptide, tỷ lệ nhận dạng protein là 0,01. Tùy chọn “Peptide thứ hai” được bật. Sử dụng tùy chọn “khớp giữa các lần chạy” để chuyển các nhận dạng thành công giữa các tệp gốc khác nhau. Sử dụng tỷ lệ đếm tối thiểu LFQ là 1 cho định lượng không nhãn (LFQ) (60). Cường độ LFQ được lọc cho ít nhất hai giá trị hợp lệ trong ít nhất một nhóm kiểu gen tại mỗi thời điểm và được ngoại suy từ phân phối chuẩn với độ rộng là 0,3 và di chuyển xuống 1,8. Sử dụng nền tảng tính toán Perseus (https://maxquant.net/perseus/) và R (https://r-project.org/) để phân tích kết quả LFQ. Một bài kiểm tra t trung bình hai chiều từ gói phần mềm limma đã được sử dụng để phân tích biểu hiện khác biệt (61). Phân tích dữ liệu thăm dò được thực hiện bằng cách sử dụng ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally và pheatmap. Dữ liệu proteomics dựa trên TMT được phân tích bằng MaxQuant phiên bản 1.6.10.43. Tìm kiếm dữ liệu proteomics thô từ cơ sở dữ liệu proteomics người của UniProt, được tải xuống vào tháng 9 năm 2018. Phân tích bao gồm hệ số hiệu chỉnh độ tinh khiết đồng vị do nhà sản xuất cung cấp. Sử dụng limma trong R để phân tích biểu hiện khác biệt. Dữ liệu gốc, kết quả tìm kiếm cơ sở dữ liệu và quy trình phân tích dữ liệu cũng như kết quả đều được lưu trữ trong liên minh ProteomeXchange thông qua kho lưu trữ đối tác PRIDE với mã định danh tập dữ liệu PXD019690.
Các chú thích chức năng làm phong phú thêm phân tích. Công cụ Phân tích Đường dẫn Ingenuity (QIAGEN) được sử dụng để xác định độ phong phú của các thuật ngữ chú thích chức năng của tập dữ liệu ở tuần thứ 8 (Hình 1). Tóm lại, danh sách protein định lượng thu được từ phân tích dữ liệu LC-MS/MS (phổ khối lượng song song) được sử dụng với các tiêu chí lọc sau: Mus musculus được chọn làm loài và nền, và danh mục hiển thị giá trị P được điều chỉnh bởi Benjamini để làm giàu, 0,05 hoặc thấp hơn được coi là có ý nghĩa. Đối với biểu đồ này, năm danh mục dư thừa hàng đầu trong mỗi cụm dựa trên giá trị P được điều chỉnh được hiển thị. Sử dụng kiểm định t đa biến, sử dụng chương trình tăng cường tuyến tính hai giai đoạn của Benjamini, Krieger và Yekutieli (Q = 5%), phân tích biểu hiện protein theo thời gian được thực hiện trên các ứng viên quan trọng được xác định trong mỗi danh mục, và mỗi hàng được phân tích riêng biệt. Không cần phải áp dụng độ lệch chuẩn nhất quán.
Để so sánh kết quả của nghiên cứu này với các cơ sở dữ liệu đã công bố và tạo biểu đồ Venn trong Hình 1, chúng tôi đã kết hợp danh sách protein định lượng với chú thích MitoCarta 2.0 (24). Sử dụng công cụ trực tuyến Vẽ biểu đồ Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) để tạo biểu đồ.
Để biết thông tin chi tiết về các quy trình thống kê được sử dụng trong phân tích proteomics, vui lòng tham khảo phần tương ứng trong mục Vật liệu và Phương pháp. Đối với tất cả các thí nghiệm khác, thông tin chi tiết có thể được tìm thấy trong phần chú thích tương ứng. Trừ khi có quy định khác, tất cả dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM), và tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism 8.1.2.
Để xem tài liệu bổ sung cho bài viết này, vui lòng truy cập http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Đây là bài báo được truy cập mở, phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Creative Commons Ghi công phi thương mại, cho phép sử dụng, phân phối và sao chép trên mọi phương tiện, miễn là mục đích sử dụng cuối cùng không nhằm mục đích thương mại và giả định rằng tác phẩm gốc là chính xác. Tài liệu tham khảo.
Lưu ý: Chúng tôi chỉ yêu cầu bạn cung cấp địa chỉ email để người mà bạn giới thiệu đến trang này biết rằng bạn muốn họ xem email đó và đó không phải là thư rác. Chúng tôi sẽ không thu thập bất kỳ địa chỉ email nào.
Câu hỏi này được sử dụng để kiểm tra xem bạn có phải là khách truy cập hay không và ngăn chặn việc gửi thư rác tự động.
Bởi E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Phân tích proteomics của các tế bào thần kinh bị rối loạn chức năng cho thấy các chương trình chuyển hóa được kích hoạt để chống lại sự thoái hóa thần kinh.
Bởi E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Phân tích proteomics của các tế bào thần kinh bị rối loạn chức năng cho thấy các chương trình chuyển hóa được kích hoạt để chống lại sự thoái hóa thần kinh.
©2020 Hiệp hội vì sự tiến bộ của khoa học Hoa Kỳ. mọi quyền được bảo lưu. AAAS là đối tác của HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef và COUNTER. Khoa học nâng cao ISSN 2375-2548.