Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có kết quả tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản trình duyệt mới hơn (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi đang hiển thị trang web mà không có kiểu dáng hoặc JavaScript.
Axit propionic (PPA) được sử dụng để nghiên cứu vai trò của rối loạn chức năng ty thể trong các rối loạn phát triển thần kinh như rối loạn phổ tự kỷ. PPA được biết là làm gián đoạn quá trình sinh tổng hợp, chuyển hóa và luân chuyển ty thể. Tuy nhiên, tác động của PPA lên động lực học, phân chia và hợp nhất ty thể vẫn còn nhiều vấn đề chưa được làm rõ do tính chất phức tạp về mặt thời gian của các cơ chế này. Ở đây, chúng tôi sử dụng các kỹ thuật hình ảnh định lượng bổ sung để nghiên cứu cách PPA ảnh hưởng đến cấu trúc siêu vi, hình thái và động lực học của ty thể trong tế bào SH-SY5Y giống tế bào thần kinh. PPA (5 mM) gây ra sự giảm đáng kể diện tích ty thể (p < 0,01), đường kính và chu vi Feret (p < 0,05) và diện tích 2 (p < 0,01). Phân tích định vị sự kiện ty thể cho thấy sự gia tăng đáng kể (p < 0,05) trong các sự kiện phân chia và hợp nhất, do đó duy trì tính toàn vẹn của mạng lưới ty thể trong điều kiện căng thẳng. Ngoài ra, biểu hiện mRNA của cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) và OPA1 (p < 0,05) đã giảm đáng kể. Điều này minh họa cho sự tái cấu trúc hình thái, sinh tổng hợp và động lực của ty thể để duy trì chức năng trong điều kiện căng thẳng. Dữ liệu của chúng tôi cung cấp cái nhìn mới về tác động của PPA lên động lực của ty thể và làm nổi bật tính hữu ích của các kỹ thuật hình ảnh trong việc nghiên cứu các cơ chế điều chỉnh phức tạp liên quan đến phản ứng căng thẳng của ty thể.
Ty thể là thành phần không thể thiếu trong nhiều chức năng tế bào ngoài vai trò điển hình của chúng trong sản xuất năng lượng và sinh tổng hợp. Quá trình chuyển hóa ty thể là yếu tố điều hòa quan trọng của tín hiệu canxi, cân bằng chuyển hóa và oxy hóa khử, tín hiệu viêm, biến đổi biểu sinh, tăng sinh tế bào, biệt hóa và chết tế bào theo chương trình¹. Đặc biệt, quá trình chuyển hóa ty thể rất quan trọng đối với sự phát triển, tồn tại và chức năng của tế bào thần kinh và có liên quan rộng rãi đến nhiều biểu hiện của bệnh lý thần kinh^2,3,4.
Trong thập kỷ qua, trạng thái chuyển hóa đã nổi lên như một yếu tố điều hòa trung tâm của quá trình hình thành, biệt hóa, trưởng thành và tính dẻo dai của tế bào thần kinh5,6. Gần đây, hình thái và động lực của ty thể đã trở thành những thành phần đặc biệt quan trọng của quá trình phân bào, một quá trình năng động duy trì một lượng ty thể khỏe mạnh trong tế bào. Động lực của ty thể được điều chỉnh bởi các con đường phức tạp phụ thuộc lẫn nhau, từ quá trình sinh tổng hợp và sinh năng lượng của ty thể đến sự phân chia, hợp nhất, vận chuyển và loại bỏ ty thể7,8. Sự gián đoạn của bất kỳ cơ chế tích hợp nào trong số này đều làm suy yếu việc duy trì mạng lưới ty thể khỏe mạnh và có những hậu quả chức năng sâu sắc đối với sự phát triển thần kinh9,10. Thật vậy, sự rối loạn điều hòa động lực của ty thể được quan sát thấy ở nhiều rối loạn tâm thần, thoái hóa thần kinh và phát triển thần kinh, bao gồm cả rối loạn phổ tự kỷ (ASD)11,12.
Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một rối loạn phát triển thần kinh không đồng nhất với cấu trúc di truyền và biểu sinh phức tạp. Tính di truyền của ASD là không thể phủ nhận, nhưng nguyên nhân phân tử cơ bản vẫn chưa được hiểu rõ. Dữ liệu tích lũy từ các mô hình tiền lâm sàng, nghiên cứu lâm sàng và bộ dữ liệu phân tử đaomics cung cấp bằng chứng ngày càng tăng về rối loạn chức năng ty thể trong ASD13,14. Trước đây, chúng tôi đã thực hiện sàng lọc methyl hóa DNA trên toàn bộ hệ gen ở một nhóm bệnh nhân mắc ASD và xác định các gen được methyl hóa khác biệt được nhóm lại dọc theo các con đường chuyển hóa ty thể15. Sau đó, chúng tôi đã báo cáo sự methyl hóa khác biệt của các chất điều hòa trung tâm của quá trình sinh tổng hợp và động lực học ty thể, có liên quan đến số lượng bản sao mtDNA tăng lên và hồ sơ chuyển hóa nước tiểu bị thay đổi ở ASD16. Dữ liệu của chúng tôi cung cấp bằng chứng ngày càng tăng cho thấy động lực học và cân bằng nội môi của ty thể đóng vai trò trung tâm trong sinh lý bệnh của ASD. Do đó, việc cải thiện sự hiểu biết về cơ chế của mối quan hệ giữa động lực học, hình thái và chức năng của ty thể là mục tiêu chính của nghiên cứu đang diễn ra về các bệnh thần kinh đặc trưng bởi rối loạn chức năng ty thể thứ phát.
Các kỹ thuật phân tử thường được sử dụng để nghiên cứu vai trò của các gen cụ thể trong phản ứng căng thẳng của ty thể. Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị hạn chế bởi bản chất đa diện và theo thời gian của các cơ chế kiểm soát nguyên phân. Hơn nữa, sự biểu hiện khác biệt của các gen ty thể là một chỉ báo gián tiếp về những thay đổi chức năng, đặc biệt là vì thông thường chỉ có một số lượng gen hạn chế được phân tích. Do đó, các phương pháp trực tiếp hơn để nghiên cứu chức năng và năng lượng sinh học của ty thể đã được đề xuất¹⁷. Hình thái ty thể có liên quan chặt chẽ đến động lực học của ty thể. Hình dạng, khả năng kết nối và cấu trúc của ty thể rất quan trọng đối với quá trình sản xuất năng lượng và sự sống còn của ty thể và tế bào^5,18. Hơn nữa, các thành phần khác nhau của nguyên phân tập trung vào những thay đổi về hình thái ty thể, có thể đóng vai trò là điểm cuối hữu ích của rối loạn chức năng ty thể và cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu cơ chế tiếp theo.
Hình thái ty thể có thể được quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), cho phép nghiên cứu chi tiết cấu trúc siêu tế bào. TEM trực tiếp hiển thị hình thái, hình dạng và cấu trúc của màng trong ty thể ở độ phân giải của từng ty thể riêng lẻ, thay vì chỉ dựa vào sự phiên mã gen, biểu hiện protein hoặc các thông số chức năng ty thể trong quần thể tế bào17,19,20. Ngoài ra, TEM tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu sự tương tác giữa ty thể và các bào quan khác, chẳng hạn như lưới nội chất và thể tự thực, đóng vai trò quan trọng trong chức năng và cân bằng nội môi của ty thể21,22. Do đó, điều này làm cho TEM trở thành điểm khởi đầu tốt để nghiên cứu rối loạn chức năng ty thể trước khi tập trung vào các con đường hoặc gen cụ thể. Khi chức năng ty thể ngày càng trở nên quan trọng đối với bệnh lý thần kinh, rõ ràng cần phải có khả năng nghiên cứu trực tiếp và định lượng hình thái và động lực học của ty thể trong các mô hình thần kinh in vitro.
Trong bài viết này, chúng tôi xem xét động lực học ty thể trong mô hình thần kinh về rối loạn chức năng ty thể trong chứng rối loạn phổ tự kỷ. Trước đây, chúng tôi đã báo cáo về sự methyl hóa khác biệt của propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) trong ASD15, một tiểu đơn vị của enzyme propionyl-CoA carboxylase ty thể PCC. Sự rối loạn điều hòa của PCC được biết là gây ra sự tích tụ độc hại của các dẫn xuất propionyl, bao gồm axit propionic (PPA)23,24,25. PPA đã được chứng minh là làm gián đoạn quá trình chuyển hóa thần kinh và làm thay đổi hành vi in ​​vivo và là một mô hình động vật được thiết lập để nghiên cứu các cơ chế phát triển thần kinh liên quan đến ASD26,27,28. Ngoài ra, PPA đã được báo cáo là làm gián đoạn điện thế màng ty thể, quá trình sinh tổng hợp và hô hấp in vitro và đã được sử dụng rộng rãi để mô hình hóa rối loạn chức năng ty thể trong tế bào thần kinh29,30. Tuy nhiên, tác động của rối loạn chức năng ty thể do PPA gây ra đối với hình thái và động lực học ty thể vẫn chưa được hiểu rõ.
Nghiên cứu này sử dụng các kỹ thuật hình ảnh bổ sung để định lượng tác động của PPA lên hình thái, động lực và chức năng của ty thể trong tế bào SH-SY5Y. Đầu tiên, chúng tôi đã phát triển một phương pháp TEM để hình dung những thay đổi về hình thái và cấu trúc siêu nhỏ của ty thể17,31,32. Do tính chất động của ty thể33, chúng tôi cũng đã sử dụng phân tích định vị sự kiện ty thể (MEL) để định lượng những thay đổi trong sự cân bằng giữa các sự kiện phân chia và hợp nhất, số lượng và thể tích ty thể dưới tác động của stress PPA. Cuối cùng, chúng tôi đã kiểm tra xem hình thái và động lực của ty thể có liên quan đến những thay đổi trong biểu hiện của các gen liên quan đến sinh tổng hợp, phân chia và hợp nhất hay không. Nhìn chung, dữ liệu của chúng tôi minh họa thách thức trong việc làm sáng tỏ sự phức tạp của các cơ chế điều chỉnh động lực của ty thể. Chúng tôi nhấn mạnh tính hữu ích của TEM trong việc nghiên cứu hình thái ty thể như một điểm cuối hội tụ có thể đo được của quá trình phân bào trong tế bào SH-SY5Y. Ngoài ra, chúng tôi nhấn mạnh rằng dữ liệu TEM cung cấp thông tin phong phú nhất khi được kết hợp với các kỹ thuật hình ảnh cũng ghi lại các sự kiện động để đáp ứng với stress chuyển hóa. Việc nghiên cứu sâu hơn các cơ chế điều hòa phân tử hỗ trợ quá trình phân chia tế bào thần kinh có thể cung cấp những hiểu biết quan trọng về vai trò của ty thể trong hệ thần kinh và các bệnh thoái hóa thần kinh.
Để gây ra stress ty thể, tế bào SH-SY5Y được xử lý bằng PPA sử dụng natri propionat (NaP) ở nồng độ 3 mM và 5 mM. Trước khi phân tích bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), các mẫu được chuẩn bị bằng phương pháp đông lạnh áp suất cao và đông lạnh thông thường (Hình 1a). Chúng tôi đã phát triển một quy trình phân tích hình ảnh ty thể tự động để đo tám thông số hình thái của quần thể ty thể trên ba mẫu sinh học. Chúng tôi nhận thấy rằng việc xử lý bằng PPA đã làm thay đổi đáng kể bốn thông số: diện tích 2, diện tích, chu vi và đường kính Feret (Hình 1b–e). Diện tích 2 giảm đáng kể với cả hai phương pháp xử lý PPA 3 mM và 5 mM (lần lượt p = 0,0183 và p = 0,002) (Hình 1b), trong khi diện tích (p = 0,003), chu vi (p = 0,0106) và đường kính Feret đều giảm đáng kể. Có sự giảm đáng kể (p = 0,0172) ở nhóm xử lý 5 mM so với nhóm đối chứng (Hình 1c–e). Sự giảm đáng kể về diện tích và chu vi cho thấy các tế bào được xử lý bằng 5 mM PPA có ty thể nhỏ hơn, tròn hơn và ít thuôn dài hơn so với các tế bào đối chứng. Điều này cũng phù hợp với sự giảm đáng kể đường kính Feret, một thông số độc lập cho thấy sự giảm khoảng cách lớn nhất giữa các cạnh hạt. Quan sát thấy những thay đổi trong cấu trúc siêu hiển vi của màng trong ty thể: màng trong ty thể trở nên ít rõ rệt hơn dưới tác động của stress PPA (Hình 1a, bảng B). Tuy nhiên, không phải tất cả các hình ảnh đều phản ánh rõ ràng cấu trúc siêu hiển vi của màng trong ty thể, vì vậy phân tích định lượng về những thay đổi này không được thực hiện. Dữ liệu TEM này có thể phản ánh ba kịch bản có thể xảy ra: (1) PPA tăng cường sự phân chia hoặc ức chế sự hợp nhất, khiến các ty thể hiện có bị co lại; (2) quá trình sinh tổng hợp tăng cường tạo ra các ty thể mới, nhỏ hơn hoặc (3) gây ra cả hai cơ chế đồng thời. Mặc dù các điều kiện này không thể phân biệt được bằng TEM, nhưng những thay đổi hình thái đáng kể cho thấy những thay đổi trong cân bằng nội môi và động lực của ty thể dưới stress PPA. Sau đó, chúng tôi đã khám phá thêm các thông số để mô tả chi tiết hơn về động lực này và các cơ chế tiềm ẩn của chúng.
Axit propionic (PPA) làm thay đổi hình thái ty thể. (a) Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tiêu biểu cho thấy kích thước ty thể giảm và trở nên nhỏ hơn, tròn hơn khi tăng nồng độ PPA; lần lượt là 0 mM (không xử lý), 3 mM và 5 mM. Mũi tên màu đỏ chỉ vào ty thể. (b–e) Các tế bào SH-SY5Y được xử lý bằng PPA trong 24 giờ được chuẩn bị để chụp TEM và kết quả được phân tích bằng Fiji/ImageJ. Bốn trong tám thông số cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa nhóm đối chứng (không xử lý, 0 mM PPA) và nhóm được xử lý (3 mM và 5 mM PPA). (b) Vùng 2, (c) Diện tích, (d) Chu vi, (e) Đường kính Feret. Phân tích phương sai một chiều (đối chứng so với nhóm xử lý) và phép thử so sánh đa bội Dunnett được sử dụng để xác định sự khác biệt đáng kể (p < 0,05). Các điểm dữ liệu biểu thị giá trị ty thể trung bình cho mỗi tế bào riêng lẻ, và các thanh lỗi biểu thị giá trị trung bình ± SEM. Dữ liệu được hiển thị đại diện cho n = 3, ít nhất 24 tế bào trên mỗi lần lặp lại; tổng cộng 266 hình ảnh đã được phân tích; * biểu thị p < 0,05, ** biểu thị p < 0,01.
Để mô tả rõ hơn cách động lực học ty thể phản ứng với PPA, chúng tôi đã nhuộm ty thể bằng tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) và sử dụng kính hiển vi quay phim tua nhanh thời gian và phân tích MEL để định vị và định lượng ty thể sau 24 giờ ở nồng độ PPA 3 và 5 mM. Xử lý các sự kiện phân chia và hợp nhất. (Hình 2a). Sau khi phân tích MEL, ty thể được phân tích thêm để định lượng số lượng cấu trúc ty thể và thể tích trung bình của chúng. Chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng nhỏ nhưng đáng kể về số lượng các sự kiện phân chia xảy ra ở nồng độ 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] so với phân chia [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] và hợp nhất [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] và hợp nhất [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] tăng đáng kể ở nồng độ 5 mM so với nhóm đối chứng (Hình 3b). Số lượng ty thể tăng đáng kể ở cả 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] và 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Hình 3c), trong khi thể tích trung bình của mỗi cấu trúc ty thể vẫn không thay đổi (Hình 3c). 3d). Tóm lại, điều này cho thấy sự tái cấu trúc động lực học ty thể đóng vai trò là phản ứng bù trừ giúp duy trì thành công tính toàn vẹn của mạng lưới ty thể. Sự gia tăng số lượng các sự kiện phân chia ở nồng độ PPA 3 mM cho thấy sự gia tăng số lượng ty thể một phần là do sự phân chia ty thể, nhưng vì thể tích ty thể trung bình về cơ bản vẫn không thay đổi, nên không thể loại trừ khả năng sinh tổng hợp là một phản ứng bù trừ bổ sung. Tuy nhiên, những dữ liệu này phù hợp với cấu trúc ty thể nhỏ hơn, tròn hơn được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và cũng chứng minh những thay đổi đáng kể trong động lực học ty thể do PPA gây ra.
Axit propionic (PPA) gây ra sự tái cấu trúc động học của ty thể để duy trì tính toàn vẹn của mạng lưới. Các tế bào SH-SY5Y được nuôi cấy, xử lý với PPA ở nồng độ 3 và 5 mM trong 24 giờ và nhuộm bằng TMRE và Hoechst 33342, sau đó phân tích bằng MEL. (a) Hình ảnh hiển vi theo thời gian đại diện mô tả màu sắc và hình chiếu cường độ tối đa nhị phân hóa tại thời điểm 2 (t2) cho mỗi điều kiện. Các vùng được chọn được chỉ ra trong mỗi hình ảnh nhị phân được tăng cường và hiển thị ở dạng 3D tại ba khung thời gian khác nhau (t1-t3) để minh họa động lực theo thời gian; các sự kiện hợp nhất được tô sáng màu xanh lục; các sự kiện phân chia được tô sáng màu xanh lục. Hiển thị màu đỏ. (b) Số lượng trung bình các sự kiện động học trên mỗi điều kiện. (c) Số lượng trung bình các cấu trúc ty thể trên mỗi tế bào. (d) Thể tích trung bình (µm3) của mỗi cấu trúc ty thể trên mỗi tế bào. Dữ liệu được hiển thị là đại diện cho n = 15 tế bào trên mỗi nhóm điều trị. Các vạch sai số hiển thị thể hiện giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM), thang đo = 10 μm, * p < 0,05.
Axit propionic (PPA) gây ức chế phiên mã các gen liên quan đến động lực học ty thể. Tế bào SH-SY5Y được xử lý với PPA ở nồng độ 3 và 5 mM trong 24 giờ. Định lượng gen tương đối được thực hiện bằng RT-qPCR và chuẩn hóa theo B2M. Các gen sinh tổng hợp ty thể: (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 và (d) NFE2L2. Các gen hợp nhất và phân chia ty thể: (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 và (i) DRP1. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) được kiểm tra bằng phân tích phương sai một chiều (đối chứng so với điều trị) và phép thử so sánh đa bội Dunnett: * biểu thị p < 0,05, ** biểu thị p < 0,01 và **** biểu thị p < 0,0001. Các cột biểu thị giá trị biểu hiện trung bình ± sai số chuẩn (SEM). Dữ liệu được hiển thị đại diện cho n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) và n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) mẫu sinh học.
Dữ liệu từ phân tích TEM và MEL cho thấy PPA làm thay đổi hình thái và động lực học của ty thể. Tuy nhiên, các kỹ thuật hình ảnh này không cung cấp thông tin chi tiết về các cơ chế cơ bản thúc đẩy các quá trình này. Do đó, chúng tôi đã kiểm tra biểu hiện mRNA của chín yếu tố điều hòa chính của động lực học, sinh tổng hợp và phân bào ty thể khi được xử lý bằng PPA. Chúng tôi đã định lượng gen gây ung thư tế bào tủy (cMYC), yếu tố hô hấp hạt nhân (NRF1), yếu tố phiên mã ty thể 1 (TFAM), yếu tố phiên mã giống NFE2 BZIP (NFE2L2), protein giống gastrin 2 (STOML2), teo dây thần kinh thị giác 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) và protein liên quan đến dynamin 1 (DRP1) sau 24 giờ điều trị với PPA ở nồng độ 3 mM và 5 mM. Chúng tôi quan sát thấy sự giảm biểu hiện mRNA khi điều trị bằng PPA ở nồng độ 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 và p < 0,0001, tương ứng) và 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Hình 3a–c). Sự giảm biểu hiện mRNA phụ thuộc vào liều lượng: biểu hiện của cMYC, NRF1 và TFAM giảm lần lượt 5,7, 2,6 và 1,9 lần ở nồng độ 3 mM, và giảm lần lượt 11,2, 3 và 2,2 lần ở nồng độ 5 mM. Ngược lại, gen sinh tổng hợp oxy hóa khử trung tâm NFE2L2 không bị thay đổi ở bất kỳ nồng độ PPA nào, mặc dù quan sát thấy xu hướng giảm biểu hiện tương tự phụ thuộc vào liều lượng (Hình 3d).
Chúng tôi cũng đã kiểm tra sự biểu hiện của các gen kinh điển liên quan đến việc điều hòa phân chia và hợp nhất. STOML2 được cho là có liên quan đến sự hợp nhất, quá trình tự thực bào ty thể và sinh tổng hợp, và sự biểu hiện của nó đã giảm đáng kể (p < 0,0001) khi tiếp xúc với 3 mM (giảm 2,4 lần) và 5 mM (giảm 2,8 lần) PPA (Hình 1). 3d). Tương tự, sự biểu hiện của gen hợp nhất OPA1 cũng giảm ở nồng độ 3 mM (giảm 1,6 lần) và 5 mM (giảm 1,9 lần) PPA (lần lượt p = 0,006 và p = 0,0024) (Hình 3f). Tuy nhiên, chúng tôi không tìm thấy sự khác biệt đáng kể trong sự biểu hiện của các gen hợp nhất MFN1, MFN2 hoặc gen phân chia DRP1 dưới tác động của stress PPA trong 24 giờ (Hình 3g–i). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ của bốn protein hợp nhất và phân chia (OPA1, MFN1, MFN2 và DRP1) không thay đổi trong cùng điều kiện (Hình 4a–d). Điều quan trọng cần lưu ý là những dữ liệu này phản ánh một thời điểm nhất định và có thể không phản ánh những thay đổi về biểu hiện protein hoặc mức độ hoạt động trong giai đoạn đầu của stress PPA. Tuy nhiên, sự giảm đáng kể trong biểu hiện của cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 và OPA1 cho thấy sự rối loạn điều hòa phiên mã đáng kể của quá trình chuyển hóa, sinh tổng hợp và động lực học ty thể. Thêm vào đó, những dữ liệu này nhấn mạnh tính hữu ích của các kỹ thuật hình ảnh để nghiên cứu trực tiếp những thay đổi trạng thái cuối cùng trong chức năng ty thể.
Nồng độ protein yếu tố hợp nhất và phân tách không thay đổi sau khi xử lý bằng axit propionic (PPA). Tế bào SH-SY5Y được xử lý với PPA ở nồng độ 3 và 5 mM trong 24 giờ. Nồng độ protein được định lượng bằng phân tích Western blot, và mức độ biểu hiện được chuẩn hóa theo tổng lượng protein. Mức độ biểu hiện protein trung bình và các ảnh Western blot đại diện của protein mục tiêu và tổng lượng protein được hiển thị. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Các cột biểu thị giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM), và dữ liệu được hiển thị là đại diện cho n = 3 mẫu sinh học. So sánh đa cặp (p < 0,05) được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều và kiểm định Dunnett. Hình ảnh gel và blot gốc được hiển thị trong Hình S1.
Rối loạn chức năng ty thể có liên quan đến nhiều bệnh hệ thống, từ các bệnh chuyển hóa, tim mạch và cơ bắp đến các bệnh thần kinh1,10. Nhiều bệnh thoái hóa thần kinh và bệnh lý thần kinh có liên quan đến rối loạn chức năng ty thể, làm nổi bật tầm quan trọng của các bào quan này trong suốt vòng đời của não bộ. Những bệnh này bao gồm bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và rối loạn phổ tự kỷ (ASD)3,4,18. Tuy nhiên, việc tiếp cận mô não để nghiên cứu các bệnh này rất khó khăn, đặc biệt là ở cấp độ cơ chế, khiến các hệ thống mô hình tế bào trở thành một giải pháp thay thế cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng một hệ thống mô hình tế bào sử dụng tế bào SH-SY5Y được xử lý bằng PPA để tái tạo lại rối loạn chức năng ty thể được quan sát thấy trong các bệnh thần kinh, đặc biệt là rối loạn phổ tự kỷ. Việc sử dụng mô hình PPA này để nghiên cứu động lực học ty thể trong tế bào thần kinh có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về nguyên nhân gây ra ASD.
Chúng tôi đã khám phá khả năng sử dụng TEM để quan sát những thay đổi về hình thái ty thể. Điều quan trọng cần lưu ý là TEM phải được sử dụng đúng cách để tối đa hóa hiệu quả của nó. Việc chuẩn bị mẫu đông lạnh cho phép bảo tồn tốt hơn các cấu trúc thần kinh bằng cách đồng thời cố định các thành phần tế bào và giảm sự hình thành các hiện tượng giả tạo34. Phù hợp với điều này, chúng tôi quan sát thấy các tế bào SH-SY5Y giống tế bào thần kinh có các bào quan dưới tế bào còn nguyên vẹn và ty thể kéo dài (Hình 1a). Điều này làm nổi bật tính hữu ích của các kỹ thuật chuẩn bị đông lạnh để nghiên cứu hình thái ty thể trong các mô hình tế bào thần kinh. Mặc dù các phép đo định lượng rất quan trọng đối với việc phân tích khách quan dữ liệu TEM, nhưng vẫn chưa có sự đồng thuận về những thông số cụ thể nào nên được đo để xác nhận những thay đổi hình thái ty thể. Dựa trên một số lượng lớn các nghiên cứu đã kiểm tra định lượng hình thái ty thể17,31,32, chúng tôi đã phát triển một quy trình phân tích hình ảnh ty thể tự động đo tám thông số hình thái, cụ thể là: diện tích, diện tích2, tỷ lệ khung hình, chu vi, độ tròn, độ lệch tâm, đường kính Feret và độ tròn.
Trong số đó, PPA làm giảm đáng kể diện tích 2, diện tích, chu vi và đường kính Feret (Hình 1b–e). Điều này cho thấy ty thể trở nên nhỏ hơn và tròn hơn, phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy sự giảm diện tích ty thể sau 72 giờ gây stress ty thể bằng PPA30. Những đặc điểm hình thái này có thể cho thấy sự phân chia ty thể, một quá trình cần thiết để cô lập các thành phần bị hư hỏng khỏi mạng lưới ty thể nhằm thúc đẩy sự thoái hóa của chúng thông qua quá trình tự thực bào ty thể35,36,37. Mặt khác, sự giảm kích thước ty thể trung bình có thể liên quan đến sự gia tăng sinh tổng hợp, dẫn đến sự hình thành các ty thể non nhỏ. Sự gia tăng phân chia hoặc sinh tổng hợp đại diện cho một phản ứng bù trừ để duy trì quá trình phân bào chống lại stress ty thể. Tuy nhiên, không thể loại trừ khả năng giảm tăng trưởng ty thể, suy giảm sự hợp nhất hoặc các điều kiện khác.
Mặc dù hình ảnh độ phân giải cao được tạo ra bởi TEM cho phép xác định các đặc điểm hình thái ở cấp độ từng ty thể riêng lẻ, phương pháp này chỉ tạo ra các ảnh chụp hai chiều tại một thời điểm duy nhất. Để nghiên cứu các phản ứng động đối với stress chuyển hóa, chúng tôi đã nhuộm ty thể bằng TMRE và sử dụng kính hiển vi chụp ảnh theo thời gian với phân tích MEL, cho phép hình dung 3D tốc độ cao về những thay đổi trong mạng lưới ty thể theo thời gian33,38. Chúng tôi quan sát thấy những thay đổi tinh tế nhưng đáng kể trong động lực học của ty thể dưới stress PPA (Hình 2). Ở nồng độ 3 mM, số lượng sự kiện phân chia tăng lên đáng kể, trong khi các sự kiện hợp nhất vẫn giữ nguyên như ở nhóm đối chứng. Sự gia tăng số lượng cả sự kiện phân chia và hợp nhất được quan sát thấy ở nồng độ 5 mM PPA, nhưng những thay đổi này xấp xỉ tỷ lệ thuận, cho thấy động học phân chia và hợp nhất đạt trạng thái cân bằng ở nồng độ cao hơn (Hình 2b). Thể tích ty thể trung bình vẫn không thay đổi ở cả 3 và 5 mM PPA, cho thấy tính toàn vẹn của mạng lưới ty thể được bảo toàn (Hình 2d). Điều này phản ánh khả năng của mạng lưới ty thể năng động trong việc đáp ứng với căng thẳng chuyển hóa nhẹ để duy trì cân bằng nội môi một cách hiệu quả mà không gây ra sự phân mảnh mạng lưới. Ở nồng độ PPA 3 mM, sự gia tăng phân chia là đủ để thúc đẩy quá trình chuyển đổi sang trạng thái cân bằng mới, nhưng cần có sự tái cấu trúc động học sâu sắc hơn để đáp ứng với căng thẳng do nồng độ PPA cao hơn gây ra.
Số lượng ty thể tăng lên ở cả hai nồng độ gây stress PPA, nhưng thể tích ty thể trung bình không thay đổi đáng kể (Hình 2c). Điều này có thể là do tăng sinh tổng hợp hoặc tăng phân chia; tuy nhiên, trong trường hợp không có sự giảm đáng kể về thể tích ty thể trung bình, thì nhiều khả năng là do tăng sinh tổng hợp. Tuy nhiên, dữ liệu trong Hình 2 hỗ trợ sự tồn tại của hai cơ chế bù trừ: tăng số lượng sự kiện phân chia, phù hợp với sự điều hòa tăng cường phân chia ty thể, và tăng số lượng sự kiện, phù hợp với sinh tổng hợp ty thể. Cuối cùng, sự bù trừ động cho stress nhẹ có thể bao gồm các quá trình đồng thời liên quan đến phân chia, hợp nhất, sinh tổng hợp và tự thực ty thể. Mặc dù các tác giả trước đây đã chỉ ra rằng PPA tăng cường nguyên phân30,39 và tự thực ty thể29, chúng tôi cung cấp bằng chứng về sự tái cấu trúc động lực phân chia và hợp nhất ty thể để đáp ứng với PPA. Những dữ liệu này xác nhận những thay đổi hình thái được quan sát bằng TEM và cung cấp thêm thông tin chi tiết về các cơ chế liên quan đến rối loạn chức năng ty thể do PPA gây ra.
Vì cả phân tích TEM lẫn MEL đều không cung cấp bằng chứng trực tiếp về cơ chế điều hòa gen nằm dưới những thay đổi hình thái quan sát được, chúng tôi đã kiểm tra biểu hiện RNA của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa, sinh tổng hợp và động lực của ty thể. Gen tiền ung thư cMYC là một yếu tố phiên mã tham gia vào việc điều hòa ty thể, quá trình đường phân, chuyển hóa axit amin và axit béo40. Ngoài ra, cMYC được biết là điều hòa biểu hiện của gần 600 gen ty thể liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và lắp ráp phức hợp ty thể, bao gồm NRF1 và TFAM41. NRF1 và TFAM là hai chất điều hòa trung tâm của quá trình phân bào, hoạt động ở hạ lưu của PGC-1α để kích hoạt quá trình sao chép mtDNA. Con đường này được kích hoạt bởi tín hiệu cAMP và AMPK và nhạy cảm với sự tiêu hao năng lượng và căng thẳng chuyển hóa. Chúng tôi cũng đã kiểm tra NFE2L2, một chất điều hòa oxy hóa khử của quá trình sinh tổng hợp ty thể, để xác định xem tác động của PPA có thể được trung gian bởi căng thẳng oxy hóa hay không.
Mặc dù biểu hiện NFE2L2 không thay đổi, chúng tôi nhận thấy sự giảm biểu hiện cMYC, NRF1 và TFAM phụ thuộc vào liều lượng một cách nhất quán sau 24 giờ điều trị với 3 mM và 5 mM PPA (Hình 3a–c). Sự giảm biểu hiện cMYC trước đây đã được báo cáo là phản ứng với stress ty thể42, và ngược lại, sự giảm biểu hiện cMYC có thể gây ra rối loạn chức năng ty thể bằng cách tái cấu trúc chuyển hóa ty thể, kết nối mạng lưới và phân cực màng43. Điều thú vị là, cMYC cũng tham gia vào việc điều hòa sự phân chia và hợp nhất ty thể42,43 và được biết là làm tăng quá trình phosphoryl hóa DRP1 và định vị ty thể trong quá trình phân chia tế bào44, cũng như làm trung gian cho sự tái cấu trúc hình thái ty thể trong tế bào gốc thần kinh45. Thật vậy, các nguyên bào sợi thiếu cMYC cho thấy kích thước ty thể giảm, phù hợp với những thay đổi do stress PPA43 gây ra. Những dữ liệu này minh họa mối quan hệ thú vị nhưng chưa rõ ràng giữa cMYC và động lực học ty thể, cung cấp một mục tiêu hấp dẫn cho các nghiên cứu trong tương lai về sự tái cấu trúc do căng thẳng PPA gây ra.
Sự suy giảm của NRF1 và TFAM phù hợp với vai trò của cMYC như một chất hoạt hóa phiên mã quan trọng. Dữ liệu này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên tế bào ung thư ruột kết ở người cho thấy PPA làm giảm biểu hiện mRNA của NRF1 sau 22 giờ, điều này liên quan đến sự cạn kiệt ATP và tăng ROS46. Các tác giả này cũng báo cáo rằng biểu hiện TFAM tăng lên sau 8,5 giờ nhưng trở lại mức cơ bản sau 22 giờ. Ngược lại, Kim et al. (2019) cho thấy biểu hiện mRNA của TFAM giảm đáng kể sau 4 giờ chịu stress PPA ở tế bào SH-SY5Y; tuy nhiên, sau 72 giờ, biểu hiện protein TFAM tăng lên đáng kể và số lượng bản sao mtDNA cũng tăng lên đáng kể. Do đó, sự giảm số lượng gen sinh tổng hợp ty thể mà chúng tôi quan sát được sau 24 giờ không loại trừ khả năng sự gia tăng số lượng ty thể có liên quan đến sự hoạt hóa quá trình sinh tổng hợp ở các thời điểm sớm hơn. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng PPA làm tăng đáng kể mRNA và protein PGC-1α trong tế bào SH-SY5Y ở thời điểm 4 giờ 30 phút, trong khi axit propionic tăng cường quá trình sinh tổng hợp ty thể trong tế bào gan bê thông qua PGC-1α ở thời điểm 12 giờ 39 phút. Điều thú vị là, PGC-1α không chỉ là chất điều hòa phiên mã trực tiếp của NRF1 và TFAM, mà còn được chứng minh là điều chỉnh hoạt động của MFN2 và DRP1 bằng cách điều hòa sự phân chia và hợp nhất47. Tóm lại, điều này làm nổi bật sự liên kết chặt chẽ của các cơ chế điều chỉnh phản ứng bù trừ ty thể do PPA gây ra. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi phản ánh sự rối loạn đáng kể trong điều hòa phiên mã của quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa dưới tác động của stress PPA.
Các gen STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 và DRP1 nằm trong số các yếu tố điều hòa trung tâm của quá trình phân chia, hợp nhất và động lực học ty thể37,48,49. Có nhiều gen khác liên quan đến động lực học ty thể, tuy nhiên, STOML2, OPA1 và MFN2 trước đây đã được phát hiện là bị methyl hóa khác biệt ở các nhóm ASD,16 và một số nghiên cứu độc lập đã báo cáo những thay đổi trong các yếu tố phiên mã này để đáp ứng với stress ty thể50,51. 52. Sự biểu hiện của cả OPA1 và STOML2 đều giảm đáng kể khi điều trị bằng PPA 3 mM và 5 mM (Hình 3e, f). OPA1 là một trong những yếu tố điều hòa kinh điển của sự hợp nhất ty thể thông qua tương tác trực tiếp với MFN1 và 2 và đóng vai trò trong việc tái cấu trúc màng trong và hình thái ty thể53. Vai trò chính xác của STOML2 trong động lực học ty thể vẫn chưa rõ ràng, nhưng bằng chứng cho thấy nó đóng vai trò trong sự hợp nhất ty thể, sinh tổng hợp và tự thực ty thể.
STOML2 tham gia vào việc duy trì sự kết hợp hô hấp ty thể và hình thành các phức hợp chuỗi hô hấp54,55 và đã được chứng minh là làm thay đổi sâu sắc các đặc điểm chuyển hóa của tế bào ung thư56. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng STOML2 thúc đẩy điện thế màng ty thể và quá trình sinh tổng hợp thông qua tương tác với BAN và cardiolipin55, 57, 58. Ngoài ra, các nghiên cứu độc lập đã chỉ ra rằng sự tương tác giữa STOML2 và PINK1 điều chỉnh quá trình tự thực ty thể59,60. Đáng chú ý, STOML2 được báo cáo là tương tác trực tiếp với và ổn định MFN2 và cũng đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định các dạng OPA1 dài bằng cách ức chế protease chịu trách nhiệm phân hủy OPA153,61,62. Sự giảm biểu hiện STOML2 được quan sát thấy trong các phản ứng PPA có thể làm cho các protein hợp nhất này dễ bị phân hủy hơn thông qua các con đường phụ thuộc ubiquitin và proteasome48. Mặc dù vai trò chính xác của STOML2 và OPA1 trong phản ứng động học với PPA vẫn chưa rõ ràng, nhưng sự giảm biểu hiện của các gen hợp nhất này (Hình 3) có thể phá vỡ sự cân bằng giữa phân chia và hợp nhất và dẫn đến giảm kích thước ty thể (Hình 3). 1).
Mặt khác, biểu hiện protein OPA1 vẫn không thay đổi sau 24 giờ, trong khi mức độ mRNA và protein của MFN1, MFN2 hoặc DRP1 không thay đổi đáng kể sau khi điều trị bằng PPA (Hình 3g-i, Hình 4). Điều này có thể cho thấy không có thay đổi nào trong việc điều hòa các yếu tố liên quan đến sự hợp nhất và phân chia ty thể. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng mỗi trong bốn gen này cũng được điều hòa bởi các biến đổi sau phiên mã (PTM) kiểm soát hoạt động của protein. OPA1 có tám biến thể ghép nối thay thế được phân giải protein trong ty thể để tạo ra hai dạng đồng phân khác nhau 63. Sự cân bằng giữa các dạng đồng phân dài và ngắn cuối cùng quyết định vai trò của OPA1 trong sự hợp nhất ty thể và duy trì mạng lưới ty thể64. Hoạt động của DRP1 được điều hòa bởi quá trình phosphoryl hóa protein kinase II phụ thuộc canxi/calmodulin (CaMKII), trong khi sự thoái hóa DRP1 được điều hòa bởi quá trình ubiquitin hóa và SUMO hóa65. Cuối cùng, cả DRP1 và MFN1/2 đều là GTPase, do đó hoạt động có thể bị ảnh hưởng bởi tốc độ sản xuất GTP trong ty thể 66. Vì vậy, mặc dù sự biểu hiện của các protein này vẫn không đổi, điều này có thể không phản ánh hoạt động hoặc vị trí của protein không thay đổi 67,68. Thật vậy, các tập hợp protein PTM hiện có thường đóng vai trò là tuyến phòng thủ đầu tiên chịu trách nhiệm điều hòa các phản ứng căng thẳng cấp tính. Trong điều kiện căng thẳng chuyển hóa vừa phải trong mô hình của chúng tôi, có khả năng PTM thúc đẩy hoạt động tăng cường của các protein hợp nhất và phân tách để khôi phục đầy đủ tính toàn vẹn của ty thể mà không cần kích hoạt thêm các gen này ở cấp độ mRNA hoặc protein.
Tóm lại, các dữ liệu trên nhấn mạnh sự điều hòa phức tạp và phụ thuộc thời gian của hình thái ty thể và những thách thức trong việc làm sáng tỏ các cơ chế này. Để nghiên cứu biểu hiện gen, trước tiên cần phải xác định các gen đích cụ thể trong con đường tín hiệu. Tuy nhiên, dữ liệu của chúng tôi cho thấy các gen trong cùng một con đường tín hiệu không phản ứng theo cùng một cách với cùng một tác nhân gây stress. Trên thực tế, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các gen khác nhau trong cùng một con đường tín hiệu có thể thể hiện các hồ sơ phản ứng theo thời gian khác nhau30,46. Ngoài ra, còn có các cơ chế hậu phiên mã phức tạp làm gián đoạn mối quan hệ giữa phiên mã và chức năng gen. Các nghiên cứu về protein có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc về tác động của các biến đổi sau phiên mã (PTM) và chức năng protein, nhưng chúng cũng đặt ra những thách thức bao gồm các phương pháp có thông lượng thấp, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu cao và độ phân giải kém.
Trong bối cảnh này, việc nghiên cứu hình thái ty thể bằng TEM và MEL có tiềm năng lớn để giải quyết các câu hỏi cơ bản về mối quan hệ giữa động lực và chức năng ty thể cũng như ảnh hưởng của nó đến bệnh tật. Quan trọng nhất, TEM cung cấp một phương pháp trực tiếp để đo hình thái ty thể như một điểm cuối hội tụ của rối loạn chức năng và động lực ty thể51. MEL cũng cung cấp một phương pháp trực tiếp để hình dung các sự kiện phân chia và hợp nhất trong môi trường tế bào ba chiều, cho phép định lượng sự tái cấu trúc ty thể động ngay cả khi không có sự thay đổi trong biểu hiện gen33. Ở đây, chúng tôi nhấn mạnh tiện ích của các kỹ thuật hình ảnh ty thể trong các bệnh ty thể thứ phát. Những bệnh này thường được đặc trưng bởi căng thẳng chuyển hóa nhẹ mãn tính, đặc trưng bởi sự tái cấu trúc tinh tế của mạng lưới ty thể hơn là tổn thương ty thể cấp tính. Tuy nhiên, sự bù trừ ty thể cần thiết để duy trì quá trình phân bào dưới căng thẳng mãn tính có những hậu quả chức năng sâu sắc. Trong bối cảnh khoa học thần kinh, việc hiểu rõ hơn về các cơ chế bù trừ này có thể cung cấp thông tin quan trọng về bệnh lý thần kinh đa dạng liên quan đến rối loạn chức năng ty thể.
Tóm lại, dữ liệu của chúng tôi nhấn mạnh tính hữu ích của các kỹ thuật hình ảnh trong việc hiểu rõ hậu quả chức năng của sự tương tác phức tạp giữa biểu hiện gen, biến đổi protein và hoạt động protein kiểm soát động lực ty thể thần kinh. Chúng tôi đã sử dụng PPA để mô hình hóa rối loạn chức năng ty thể trong mô hình tế bào thần kinh nhằm hiểu rõ hơn về thành phần ty thể của ASD. Các tế bào SH-SY5Y được xử lý bằng PPA cho thấy những thay đổi về hình thái ty thể: ty thể trở nên nhỏ và tròn, và màng trong (cristae) không được xác định rõ khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Phân tích MEL cho thấy những thay đổi này xảy ra đồng thời với sự gia tăng các sự kiện phân chia và hợp nhất để duy trì mạng lưới ty thể nhằm đáp ứng với stress chuyển hóa nhẹ. Hơn nữa, PPA làm gián đoạn đáng kể sự điều hòa phiên mã của quá trình chuyển hóa và cân bằng nội môi ty thể. Chúng tôi đã xác định cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 và OPA1 là các chất điều hòa ty thể chính bị gián đoạn do stress PPA và có thể đóng vai trò trung gian trong các thay đổi do PPA gây ra về hình thái và chức năng ty thể. Cần có thêm các nghiên cứu trong tương lai để mô tả rõ hơn những thay đổi theo thời gian do PPA gây ra trong biểu hiện gen và hoạt động protein, vị trí và các biến đổi sau dịch mã. Dữ liệu của chúng tôi nhấn mạnh tính phức tạp và sự phụ thuộc lẫn nhau của các cơ chế điều hòa trung gian phản ứng căng thẳng ty thể và chứng minh tính hữu ích của TEM và các kỹ thuật hình ảnh khác cho các nghiên cứu cơ chế có mục tiêu hơn.
Dòng tế bào SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) được mua từ Sigma-Aldrich. Tế bào SH-SY5Y được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle's medium/hỗn hợp dinh dưỡng F-12 (DMEM/F-12) và L-glutamine (SC09411, ScienCell) trong bình 25 cm2 bổ sung 20% ​​huyết thanh bào thai bò (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) và 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ở 37 °C, 5% CO2. Tế bào được cấy chuyển đến độ phủ 80% bằng cách sử dụng trypsin-EDTA 0,05% (15400054, ThermoFisher Scientific), ly tâm ở 300 g và cấy trên đĩa với mật độ khoảng 7 × 105 tế bào/ml. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trên tế bào SH-SY5Y chưa biệt hóa ở các lần cấy chuyển từ 19 đến 22. PPA được sử dụng dưới dạng NaP. Hòa tan bột NaP (CAS số 137-40-6, công thức hóa học C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) trong nước MilliQ ấm đến nồng độ 1 M và bảo quản ở 4 °C. Vào ngày điều trị, pha loãng dung dịch này với PPA 1 M đến nồng độ 3 mM và 5 mM PPA trong môi trường không chứa huyết thanh (DMEM/F-12 có L-glutamine). Nồng độ điều trị cho tất cả các thí nghiệm là không có PPA (0 mM, đối chứng), 3 mM và 5 mM PPA. Các thí nghiệm được thực hiện với ít nhất ba lần lặp lại sinh học.
Tế bào SH-SY5Y được cấy vào bình 25 cm5 với mật độ 5,5 × 105 tế bào/ml và nuôi cấy trong 24 giờ. Dung dịch PPA được thêm vào bình trước khi ủ 24 giờ. Thu thập khối tế bào theo quy trình nuôi cấy mô động vật có vú thông thường (đã mô tả ở trên). Hòa tan khối tế bào trong 100 µl dung dịch glutaraldehyde 2,5%, PBS 1× và bảo quản ở 4 °C cho đến khi xử lý. Tế bào SH-SY5Y được ly tâm nhanh để tạo khối tế bào và loại bỏ dung dịch glutaraldehyde 2,5%, PBS 1×. Hòa tan cặn trong gel agarose 4% được pha trong nước cất (tỷ lệ thể tích agarose so với cặn là 1:1). Các mảnh agarose được đặt trên lưới trên tấm phẳng và phủ 1-hexadecene trước khi đông lạnh áp suất cao. Các mẫu được đông lạnh trong acetone khô 100% ở -90°C trong 24 giờ. Sau đó, nhiệt độ được nâng lên -80°C và thêm dung dịch gồm 1% osmium tetroxide và 0,1% glutaraldehyde. Các mẫu được bảo quản ở -80°C trong 24 giờ. Sau đó, nhiệt độ được tăng dần lên nhiệt độ phòng trong vài ngày: từ -80°C đến -50°C trong 24 giờ, đến -30°C trong 24 giờ, đến -10°C trong 24 giờ và cuối cùng là đến nhiệt độ phòng.
Sau khi chuẩn bị bằng phương pháp đông lạnh, các mẫu được tẩm nhựa và cắt thành các lát siêu mỏng (khoảng 100 nm) bằng máy cắt siêu mỏng Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Các lát cắt được nhuộm bằng dung dịch uranyl acetate 2% và chì citrate. Các mẫu được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (trước đây là FEI), Eindhoven, Hà Lan) hoạt động ở điện áp 200 kV (bộ phát Lab6) và camera CCD Gatan (Gatan, Anh) được trang bị bộ lọc năng lượng Tridiem.
Trong mỗi lần lặp lại kỹ thuật, ít nhất 24 hình ảnh tế bào đơn được thu thập, tổng cộng là 266 hình ảnh. Tất cả các hình ảnh được phân tích bằng cách sử dụng macro Vùng quan tâm (ROI) và macro Mitochondria. Macro mitochondrial dựa trên các phương pháp đã được công bố17,31,32 và cho phép xử lý hàng loạt bán tự động các hình ảnh TEM trong Fiji/ImageJ69. Tóm lại: hình ảnh được đảo ngược và đảo ngược bằng cách sử dụng phép trừ nền quả cầu lăn (bán kính 60 pixel) và bộ lọc thông dải FFT (sử dụng giới hạn trên và dưới lần lượt là 60 và 8 pixel) và triệt tiêu đường thẳng đứng với dung sai hướng là 5%. Hình ảnh đã xử lý được tự động phân ngưỡng bằng thuật toán entropy tối đa và một mặt nạ nhị phân được tạo ra. Các vùng hình ảnh liên quan đến các ROI được chọn thủ công trong hình ảnh TEM thô được trích xuất, đặc trưng cho mitochondria và loại trừ màng plasma và các vùng có độ tương phản cao khác. Đối với mỗi vùng quan tâm (ROI) được trích xuất, các hạt nhị phân lớn hơn 600 pixel đã được phân tích, và diện tích hạt, chu vi, trục chính và trục phụ, đường kính Feret, độ tròn và độ tròn trịa được đo bằng các chức năng đo lường tích hợp của Fiji/ImageJ. Theo Merrill, Flippo và Strack (2017), diện tích 2, tỷ lệ khung hình của hạt (tỷ lệ trục chính so với trục phụ) và hệ số hình dạng (FF) được tính toán từ các dữ liệu này, trong đó FF = chu vi 2/4pi x diện tích. Định nghĩa của công thức tham số có thể được tìm thấy trong Merrill, Flippo và Strack (2017). Các macro được đề cập có sẵn trên GitHub (xem Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu). Trung bình, khoảng 5.600 hạt được phân tích cho mỗi phương pháp xử lý PPA, tổng cộng khoảng 17.000 hạt (dữ liệu không được hiển thị).
Tế bào SH-SH5Y được đặt trong đĩa nuôi cấy 8 ngăn (ThermoFisher, #155411) để cho phép bám dính qua đêm, sau đó được ủ với TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) và Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) để nhuộm. Hình ảnh được thu thập bằng laser 405 nm và 561 nm trong môi trường 10 phút, và hình ảnh thô được thu thập dưới dạng chồng ảnh z chứa 10 ảnh hiển vi với bước az là 0,2 μm giữa các khung hình tại 12 thời điểm liên tiếp. Hình ảnh được thu thập bằng nền tảng siêu phân giải Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Đức) sử dụng ống kính LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Các hình ảnh được phân tích trong ImageJ bằng cách sử dụng quy trình đã được mô tả trước đó và plugin ImageJ để đo các sự kiện hợp nhất và phân chia, số lượng cấu trúc ty thể trung bình và thể tích ty thể trung bình trên mỗi tế bào33. Các macro MEL có sẵn trên GitHub (xem Tuyên bố về tính khả dụng của dữ liệu).
Tế bào SH-SY5Y được nuôi cấy trong đĩa sáu giếng với mật độ 0,3 × 10⁶ tế bào/mL trong 24 giờ trước khi xử lý. RNA được chiết xuất bằng quy trình Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) với một số sửa đổi nhỏ: thêm 300 μl dung dịch đệm ly giải RNA vào mỗi giếng trước khi lấy ra và ly giải từng mẫu ở bước cuối cùng với 30 μl nước không chứa DNase/RNase. Tất cả các mẫu được kiểm tra về số lượng và chất lượng bằng máy quang phổ UV-Vis NanoDrop ND-1000. Tổng lượng protein từ dịch ly giải tế bào được thu được bằng cách sử dụng 200 μl dung dịch đệm ly giải RIPA, và nồng độ protein được định lượng bằng phương pháp định lượng protein Bradford⁷⁰.
Quá trình tổng hợp cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng Bộ kit tổng hợp cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số sửa đổi. cDNA được tổng hợp trong phản ứng 20 μl sử dụng 0,7 đến 1 μg tổng RNA. Các mồi được chọn từ các bài báo đã được công bố trước đó 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Bảng S1) và các đầu dò đi kèm được thiết kế bằng công cụ PrimerQuest từ Integrated DNA Technologies. Tất cả các gen quan tâm đều được chuẩn hóa so với gen B2M trong nhân. Sự biểu hiện gen của STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC và OPA1 được đo bằng RT-qPCR. Hỗn hợp chính bao gồm polymerase LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM mồi xuôi và ngược, cDNA và nước tinh khiết dùng cho PCR để tạo ra thể tích cuối cùng là 10 μL cho mỗi phản ứng. Sự biểu hiện của các gen phân chia và phân hạch (DRP1, MFN1/2) được đo bằng phương pháp xét nghiệm đa kênh TaqMan. Hỗn hợp chính Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất với một số sửa đổi nhỏ. Hỗn hợp chính RT-qPCR đa kênh bao gồm polymerase LUNA Taq 1X, mồi xuôi và ngược 10 μM, đầu dò 10 μM, cDNA và nước tinh khiết dùng cho PCR, tạo ra thể tích cuối cùng là 20 μL cho mỗi phản ứng. RT-qPCR được thực hiện bằng máy Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—số sê-ri: R0618110). Điều kiện chu kỳ được trình bày trong Bảng S1. Tất cả các mẫu cDNA đều được khuếch đại ba lần và đường cong chuẩn được tạo ra bằng cách sử dụng một loạt các pha loãng mười lần. Các giá trị ngoại lệ trong các mẫu lặp lại ba lần có độ lệch chuẩn ngưỡng chu kỳ (Ct) >0,5 đã được loại bỏ khỏi phân tích để đảm bảo tính khả reproducible của dữ liệu30,72. Biểu hiện gen tương đối được tính toán bằng phương pháp 2-ΔΔCt79.
Mẫu protein (60 μg) được trộn với dung dịch đệm Laemmli theo tỷ lệ 2:1 và chạy trên gel protein không màu 12% (Bio-Rad #1610184). Protein được chuyển sang màng PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) bằng hệ thống Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Màng được chặn và ủ với các kháng thể chính thích hợp (OPA1, MFN1, MFN2 và DRP1) (pha loãng 1:1000) trong 48 giờ, sau đó ủ với kháng thể phụ (1:10.000) trong 1 giờ. Sau đó, màng được chụp ảnh bằng chất nền Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) và ghi lại bằng hệ thống Bio-Rad ChemiDoc MP. Phần mềm ImageLab phiên bản 6.1 được sử dụng để phân tích Western blot. Hình ảnh gel và blot gốc được hiển thị trong Hình S1. Thông tin về kháng thể được cung cấp trong Bảng S2.
Các bộ dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM) của ít nhất ba mẫu độc lập. Các bộ dữ liệu được kiểm tra tính chuẩn hóa bằng phép thử Shapiro-Wilks (trừ khi có quy định khác) trước khi giả định phân bố Gaussian và độ lệch chuẩn bằng nhau và tiến hành phân tích. Ngoài ra, bộ dữ liệu được phân tích bằng phép thử MEL LSD của Fisher (p < 0,05), ANOVA một chiều (trung bình nhóm điều trị so với nhóm đối chứng) và phép thử so sánh đa bội Dunnett để xác định ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Các giá trị p có ý nghĩa được hiển thị trên biểu đồ là *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Tất cả các phân tích thống kê và biểu đồ được thực hiện và tạo bằng phần mềm GraphPad Prism 9.4.0.
Các macro Fiji/ImageJ để phân tích ảnh TEM được cung cấp công khai trên GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Macro Mitochondrial Event Locator (MEL) cũng được cung cấp công khai trên GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM và Vijaya A. Mitochondria: những nhà điều hòa chính của quá trình trao đổi chất, cân bằng nội môi, căng thẳng, lão hóa và biểu sinh. Tạp chí Khoa học Y sinh Indonesia. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Rối loạn chức năng ty thể đa diện trong bệnh tâm thần phân liệt, phức hợp I như một mục tiêu bệnh lý tiềm tàng. Tâm thần phân liệt. nguồn tài liệu. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. và Beal, MF Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh Parkinson. Tạp chí Hóa học thần kinh. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG và Mehta V. Các ty thể bị căng thẳng: mục tiêu xâm lấn trong bệnh Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF và Ferreira GK. Mitochondria và não: sinh năng lượng và hơn thế nữa. Neurotoxins. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. và cộng sự. Ty thể đa chức năng: tác động của ty thể đến sự phát triển và bệnh lý thần kinh. Tạp chí Khoa học thần kinh. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. và Morais, VA. Sự hình thành ty thể trong tế bào thần kinh: như thế nào và ở đâu. Tạp chí khoa học quốc tế. J. Mohr. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. và Zhao, J. Điều hòa động lực ty thể ở động vật có vú: cơ hội và thách thức. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. và Slack, RS Động lực học ty thể trong điều hòa quá trình hình thành tế bào thần kinh: từ não bộ đang phát triển đến não bộ trưởng thành. phát triển. động lực. 247, 47–53 (2018).