Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Các hạt nano insulin (NPs) với hàm lượng tải cao đã được ứng dụng trong nhiều dạng bào chế khác nhau. Nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của quá trình đông khô và sấy phun lên cấu trúc của các hạt nano chitosan chứa insulin, có hoặc không có mannitol làm chất bảo vệ đông lạnh. Chúng tôi cũng đánh giá chất lượng của các hạt nano này bằng cách hòa tan lại chúng. Trước khi khử nước, kích thước hạt của các hạt nano liên kết chéo chitosan/natri tripolyphosphat/insulin được tối ưu hóa ở mức 318 nm, chỉ số phân bố kích thước hạt (PDI) là 0,18, hiệu quả đóng gói là 99,4% và hàm lượng tải là 25,01%. Sau khi hòa tan lại, tất cả các hạt nano, ngoại trừ những hạt được sản xuất bằng phương pháp đông khô không sử dụng mannitol, đều duy trì cấu trúc hạt hình cầu. So với các hạt nano chứa mannitol được khử nước bằng phương pháp sấy phun, các hạt nano sấy phun không chứa mannitol cũng cho thấy kích thước hạt trung bình nhỏ nhất (376 nm) và hàm lượng tải cao nhất (25,02%) với tỷ lệ đóng gói tương tự (98,7%). PDI (0,20) bằng kỹ thuật sấy khô hoặc sấy đông khô. Các hạt nano được sấy khô bằng phương pháp phun sấy không dùng mannitol cũng cho kết quả giải phóng insulin nhanh nhất và hiệu quả hấp thụ tế bào cao nhất. Công trình này cho thấy rằng phương pháp phun sấy có thể khử nước các hạt nano insulin mà không cần chất bảo vệ đông lạnh so với các phương pháp sấy đông khô thông thường, tạo ra khả năng tải lớn hơn, yêu cầu chất phụ gia thấp hơn và chi phí vận hành thấp hơn đáng kể.
Kể từ khi được phát hiện vào năm 19221,2,3, insulin và các chế phẩm dược phẩm của nó đã cứu sống bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường loại 1 (T1DM) và loại 2 (T2DM). Tuy nhiên, do đặc tính là một loại protein có trọng lượng phân tử cao, insulin dễ bị kết tụ, bị phân hủy bởi các enzyme phân giải protein và bị đào thải bởi hiệu ứng chuyển hóa lần đầu. Những người được chẩn đoán mắc bệnh tiểu đường loại 1 cần tiêm insulin suốt đời. Nhiều bệnh nhân ban đầu được chẩn đoán mắc bệnh tiểu đường loại 2 cũng cần tiêm insulin lâu dài. Việc tiêm insulin hàng ngày là một nguồn gây đau đớn và khó chịu nghiêm trọng cho những người này, với những ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe tinh thần. Do đó, các hình thức sử dụng insulin khác gây ít khó chịu hơn, chẳng hạn như sử dụng insulin đường uống, đang được nghiên cứu rộng rãi5 vì chúng có tiềm năng khôi phục chất lượng cuộc sống cho khoảng 5 tỷ người mắc bệnh tiểu đường trên toàn thế giới.
Công nghệ hạt nano đã mang lại một bước tiến đáng kể trong nỗ lực đưa insulin dạng uống vào cơ thể4,6,7. Nó có khả năng bao bọc và bảo vệ insulin khỏi bị phân hủy một cách hiệu quả để vận chuyển đến các vị trí cụ thể trong cơ thể. Tuy nhiên, việc sử dụng các chế phẩm hạt nano có một số hạn chế, chủ yếu là do vấn đề ổn định của huyền phù hạt. Một số hiện tượng kết tụ có thể xảy ra trong quá trình bảo quản, làm giảm sinh khả dụng của các hạt nano chứa insulin8. Ngoài ra, tính ổn định hóa học của ma trận polymer của các hạt nano và insulin cũng cần được xem xét để đảm bảo tính ổn định của các hạt nano insulin (NPs). Hiện nay, công nghệ đông khô là tiêu chuẩn vàng để tạo ra các NPs ổn định đồng thời ngăn ngừa những thay đổi không mong muốn trong quá trình bảo quản9.
Tuy nhiên, quá trình đông khô đòi hỏi phải thêm chất bảo vệ lạnh để ngăn cấu trúc hình cầu của các hạt nano bị ảnh hưởng bởi ứng suất cơ học của tinh thể băng. Điều này làm giảm đáng kể lượng insulin trong các hạt nano sau khi đông khô, vì chất bảo vệ lạnh chiếm phần lớn trọng lượng. Do đó, các hạt nano insulin được sản xuất thường không phù hợp để sản xuất các chế phẩm dạng bột khô, chẳng hạn như viên nén uống và màng uống, do cần một lượng lớn hạt nano khô để đạt được phạm vi điều trị của insulin.
Sấy phun là một quy trình công nghiệp quy mô lớn nổi tiếng và không tốn kém để sản xuất bột khô từ pha lỏng trong ngành dược phẩm10,11. Việc kiểm soát quá trình hình thành hạt cho phép bao bọc đúng cách một số hợp chất hoạt tính sinh học12, 13. Hơn nữa, nó đã trở thành một kỹ thuật hiệu quả để điều chế protein được bao bọc để dùng đường uống. Trong quá trình sấy phun, nước bay hơi rất nhanh, giúp giữ nhiệt độ lõi hạt ở mức thấp11,14, cho phép ứng dụng nó để bao bọc các thành phần nhạy cảm với nhiệt. Trước khi sấy phun, vật liệu phủ phải được đồng nhất kỹ lưỡng với dung dịch chứa các thành phần được bao bọc11,14. Không giống như sấy đông khô, việc đồng nhất trước khi bao bọc trong sấy phun giúp cải thiện hiệu quả bao bọc trong quá trình khử nước. Vì quá trình bao bọc bằng sấy phun không cần chất bảo vệ lạnh, nên sấy phun có thể được sử dụng để sản xuất các hạt nano khô với hàm lượng tải cao.
Nghiên cứu này báo cáo về việc sản xuất các hạt nano chứa insulin bằng cách liên kết chéo chitosan và natri tripolyphosphate sử dụng phương pháp gel ion. Gel ion là một phương pháp điều chế cho phép sản xuất các hạt nano thông qua tương tác tĩnh điện giữa hai hoặc nhiều loại ion trong những điều kiện nhất định. Cả hai kỹ thuật sấy đông khô và sấy phun đều được sử dụng để khử nước các hạt nano liên kết chéo chitosan/natri tripolyphosphate/insulin đã được tối ưu hóa. Sau khi khử nước, hình thái của chúng được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Khả năng tái kết hợp của chúng được đánh giá bằng cách đo phân bố kích thước, điện tích bề mặt, chỉ số phân bố kích thước (PDI), hiệu quả đóng gói và hàm lượng tải. Chất lượng của các hạt nano được hòa tan lại được sản xuất bằng các phương pháp khử nước khác nhau cũng được đánh giá bằng cách so sánh khả năng bảo vệ insulin, hành vi giải phóng và hiệu quả hấp thụ tế bào của chúng.
Độ pH của dung dịch hỗn hợp và tỷ lệ chitosan và insulin là hai yếu tố chính ảnh hưởng đến kích thước hạt và hiệu quả bao bọc (EE) của các hạt nano cuối cùng, vì chúng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tạo gel ionotropic. Độ pH của dung dịch hỗn hợp cho thấy mối tương quan cao với kích thước hạt và hiệu quả bao bọc (Hình 1a). Như thể hiện trong Hình 1a, khi pH tăng từ 4,0 đến 6,0, kích thước hạt trung bình (nm) giảm và EE tăng đáng kể, trong khi khi pH tăng lên 6,5, kích thước hạt trung bình bắt đầu tăng và EE không thay đổi. Khi tỷ lệ chitosan so với insulin tăng, kích thước hạt trung bình cũng tăng. Hơn nữa, không có sự thay đổi nào về EE được quan sát khi các hạt nano được điều chế ở tỷ lệ khối lượng chitosan/insulin cao hơn 2,5:1 (w/w) (Hình 1b). Do đó, điều kiện điều chế tối ưu trong nghiên cứu này là (pH 6,0, tỷ lệ khối lượng chitosan/insulin là 2,5:1). Các điều kiện này được sử dụng để điều chế các hạt nano chứa insulin cho các nghiên cứu tiếp theo. Dưới điều kiện điều chế này, kích thước hạt trung bình của các hạt nano insulin được tối ưu hóa là 318 nm (Hình 1c), chỉ số phân bố kích thước (PDI) là 0,18, hiệu suất nhúng là 99,4%, điện thế zeta là 9,8 mV và hàm lượng insulin là 25,01% (m/m). Dựa trên kết quả hiển vi điện tử truyền qua (TEM), các hạt nano được tối ưu hóa có hình dạng gần như hình cầu và riêng biệt với kích thước tương đối đồng nhất (Hình 1d).
Tối ưu hóa thông số của các hạt nano insulin: (a) ảnh hưởng của pH đến đường kính trung bình và hiệu quả đóng gói (EE) của các hạt nano insulin (được điều chế ở tỷ lệ khối lượng chitosan và insulin là 5:1); (b) ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng chitosan và insulin đến đường kính trung bình và hiệu quả đóng gói (EE) của các hạt nano insulin (được điều chế ở pH 6); (c) phân bố kích thước hạt của các hạt nano insulin được tối ưu hóa; (d) ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của các hạt nano insulin được tối ưu hóa.
Ai cũng biết rằng chitosan là một chất điện phân yếu với pKa là 6,5. Nó mang điện tích dương trong môi trường axit vì nhóm amino chính của nó bị proton hóa bởi các ion hydro15. Do đó, nó thường được sử dụng làm chất mang để bao bọc các đại phân tử mang điện tích âm. Trong nghiên cứu này, chitosan được sử dụng để bao bọc insulin có điểm đẳng điện là 5,3. Vì chitosan được sử dụng làm vật liệu phủ, nên khi tỷ lệ của nó tăng lên, độ dày của lớp ngoài của các hạt nano cũng tăng lên tương ứng, dẫn đến kích thước hạt trung bình lớn hơn. Ngoài ra, hàm lượng chitosan cao hơn có thể bao bọc được nhiều insulin hơn. Trong trường hợp của chúng tôi, hiệu suất bao bọc (EE) cao nhất khi tỷ lệ chitosan và insulin đạt 2,5:1, và không có sự thay đổi đáng kể về EE khi tỷ lệ tiếp tục tăng.
Bên cạnh tỷ lệ chitosan và insulin, độ pH cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chế NP. Gan et al. 17 đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến kích thước hạt nano chitosan. Họ nhận thấy kích thước hạt giảm liên tục cho đến khi pH đạt 6,0, và kích thước hạt tăng đáng kể ở pH > 6,0, điều này phù hợp với quan sát của chúng tôi. Hiện tượng này là do khi pH tăng, phân tử insulin thu được điện tích âm trên bề mặt, do đó, thúc đẩy tương tác tĩnh điện với phức hợp chitosan/natri tripolyphosphat (TPP), dẫn đến kích thước hạt nhỏ và hiệu suất đóng gói (EE) cao. Tuy nhiên, khi pH được điều chỉnh đến 6,5, các nhóm amino trên chitosan bị khử proton, dẫn đến chitosan bị gấp lại. Do đó, pH cao dẫn đến sự tiếp xúc của các ion amino với TPP và insulin ít hơn, dẫn đến liên kết chéo thấp hơn, kích thước hạt trung bình cuối cùng lớn hơn và EE thấp hơn.
Phân tích các đặc tính hình thái của các hạt nano (NP) được sấy đông khô và sấy phun có thể hướng dẫn việc lựa chọn các kỹ thuật khử nước và tạo bột tốt hơn. Phương pháp được ưu tiên nên đảm bảo tính ổn định của thuốc, hình dạng hạt đồng nhất, tải lượng thuốc cao và độ hòa tan tốt trong dung dịch ban đầu. Trong nghiên cứu này, để so sánh tốt hơn hai kỹ thuật, các hạt nano insulin có hoặc không có 1% mannitol đã được sử dụng trong quá trình khử nước. Mannitol được sử dụng như một chất độn hoặc chất bảo vệ đông lạnh trong các công thức bột khô khác nhau để sấy đông khô và sấy phun. Đối với các hạt nano insulin đông khô không có mannitol, như thể hiện trong Hình 2a, cấu trúc bột xốp cao với bề mặt lớn, không đều và thô ráp đã được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). Một vài hạt riêng lẻ được phát hiện trong bột sau khi khử nước (Hình 2e). Những kết quả này cho thấy hầu hết các NP đã bị phân hủy trong quá trình sấy đông khô mà không có bất kỳ chất bảo vệ đông lạnh nào. Đối với các hạt nano insulin sấy đông khô và sấy phun có chứa 1% mannitol, các hạt nano hình cầu với bề mặt nhẵn đã được quan sát (Hình 2b, d, f, h). Các hạt nano sấy phun không có mannitol vẫn giữ hình cầu nhưng bề mặt bị nhăn (Hình 2c). Hình cầu và bề mặt nhăn sẽ được thảo luận thêm trong các thử nghiệm về hành vi giải phóng và hấp thụ tế bào bên dưới. Dựa trên hình dạng bên ngoài của các hạt nano đã sấy khô, cả các hạt nano sấy phun không có mannitol và các hạt nano sấy đông khô và sấy phun có mannitol đều tạo ra bột hạt nano mịn (Hình 2f, g, h). Diện tích bề mặt tiếp xúc giữa các hạt càng lớn thì độ hòa tan càng cao và do đó tốc độ giải phóng càng cao.
Hình thái học của các hạt nano insulin đã khử nước khác nhau: (a) Ảnh SEM của các hạt nano insulin đông khô không có mannitol; (b) Ảnh SEM của các hạt nano insulin đông khô có mannitol; (c) Ảnh SEM của các hạt nano insulin sấy phun không có mannitol; (d) Ảnh SEM của các hạt nano insulin sấy phun có mannitol; (e) Ảnh bột các hạt nano insulin đông khô không có mannitol; (f) Ảnh các hạt nano insulin đông khô có mannitol; (g) Ảnh bột các hạt nano insulin sấy phun không có mannitol; (h) Ảnh bột các hạt nano insulin sấy phun có mannitol.
Trong quá trình đông khô, mannitol hoạt động như một chất bảo vệ đông lạnh, giữ cho các NP ở dạng vô định hình và ngăn ngừa hư hại do tinh thể băng19. Ngược lại, không có bước đông lạnh trong quá trình sấy phun. Do đó, mannitol không cần thiết trong phương pháp này. Trên thực tế, các NP sấy phun không có mannitol tạo ra các NP mịn hơn như đã mô tả trước đó. Tuy nhiên, mannitol vẫn có thể hoạt động như một chất độn trong quá trình sấy phun để tạo cho NP cấu trúc hình cầu hơn20 (Hình 2d), giúp đạt được hành vi giải phóng đồng đều của các NP được bao bọc như vậy. Ngoài ra, rõ ràng là một số hạt lớn có thể được phát hiện trong cả NP insulin đông khô và sấy phun có chứa mannitol (Hình 2b,d), điều này có thể là do sự tích tụ của mannitol trong lõi hạt cùng với insulin được bao bọc. Lớp Chitosan. Điều đáng chú ý là trong nghiên cứu này, để đảm bảo cấu trúc hình cầu vẫn còn nguyên vẹn sau khi khử nước, tỷ lệ mannitol và chitosan được giữ ở mức 5:1, nhờ đó lượng chất độn lớn cũng có thể làm tăng kích thước hạt của các NP khô.
Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier phản xạ toàn phần suy giảm (FTIR-ATR) được sử dụng để đặc trưng hóa hỗn hợp vật lý của insulin tự do, chitosan, TPP và insulin. Tất cả các NP đã khử nước đều được đặc trưng bằng cách sử dụng phổ FTIR-ATR. Đáng chú ý, cường độ dải ở 1641, 1543 và 1412 cm-1 được quan sát thấy trong các NP được bao bọc đông khô với mannitol và trong các NP được sấy phun có và không có mannitol (Hình 3). Như đã báo cáo trước đây, sự gia tăng cường độ này có liên quan đến sự liên kết chéo giữa chitosan, TPP và insulin. Nghiên cứu về sự tương tác giữa chitosan và insulin cho thấy trong phổ FTIR của các hạt nano chitosan chứa insulin, dải chitosan chồng lên dải của insulin, làm tăng cường độ carbonyl (1641 cm-1) và dải amin (1543 cm-1). Các nhóm tripolyphosphate của TPP được liên kết với các nhóm amoni trong chitosan, tạo thành một dải ở 1412 cm-1.
Phổ FTIR-ATR của insulin tự do, chitosan, hỗn hợp vật lý chitosan/TPP/insulin và các hạt nano được khử nước bằng các phương pháp khác nhau.
Hơn nữa, những kết quả này phù hợp với những kết quả hiển thị trong SEM, cho thấy các NP được bao bọc vẫn còn nguyên vẹn cả khi phun và sấy đông khô với mannitol, nhưng khi không có mannitol, chỉ có phương pháp sấy phun mới tạo ra các hạt được bao bọc. Ngược lại, kết quả phổ FTIR-ATR của các NP sấy đông khô không có mannitol rất giống với hỗn hợp vật lý của chitosan, TPP và insulin. Kết quả này cho thấy các liên kết chéo giữa chitosan, TPP và insulin không còn tồn tại trong các NP sấy đông khô không có mannitol. Cấu trúc của NP bị phá hủy trong quá trình sấy đông khô không có chất bảo vệ đông lạnh, điều này có thể thấy trong kết quả SEM (Hình 2a). Dựa trên hình thái và kết quả FTIR của các NP insulin đã khử nước, chỉ có các NP sấy đông khô, sấy phun và không có mannitol được sử dụng cho các thí nghiệm tái tạo và các NP không có mannitol do sự phân hủy của các NP không có mannitol trong quá trình khử nước.
Quá trình khử nước được sử dụng để bảo quản lâu dài và tái chế thành các dạng bào chế khác. Khả năng tái cấu trúc của các hạt nano khô sau khi bảo quản rất quan trọng đối với việc sử dụng chúng trong các dạng bào chế khác nhau như viên nén và màng. Chúng tôi nhận thấy rằng kích thước hạt trung bình của các hạt nano insulin sấy phun khi không có mannitol chỉ tăng nhẹ sau khi tái cấu trúc. Mặt khác, kích thước hạt của các hạt nano insulin sấy phun và sấy đông khô có mannitol tăng lên đáng kể (Bảng 1). PDI và EE không thay đổi đáng kể (p > 0,05) sau khi kết hợp lại tất cả các hạt nano trong nghiên cứu này (Bảng 1). Kết quả này cho thấy hầu hết các hạt vẫn còn nguyên vẹn sau khi hòa tan lại. Tuy nhiên, việc bổ sung mannitol đã làm giảm đáng kể lượng insulin được tải trong các hạt nano mannitol sấy đông khô và sấy phun (Bảng 1). Ngược lại, hàm lượng insulin được tải trong các hạt nano sấy phun không có mannitol vẫn giữ nguyên như trước (Bảng 1).
Ai cũng biết rằng việc tải các hạt nano là rất quan trọng khi sử dụng cho mục đích vận chuyển thuốc. Đối với các hạt nano có tải trọng thấp, cần một lượng vật liệu rất lớn để đạt đến ngưỡng điều trị. Tuy nhiên, độ nhớt cao của nồng độ hạt nano cao như vậy dẫn đến sự bất tiện và khó khăn trong việc dùng đường uống và các công thức tiêm, tương ứng 22. Ngoài ra, các hạt nano insulin cũng có thể được sử dụng để tạo viên nén và màng sinh học nhớt 23, 24, điều này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn hạt nano ở mức tải trọng thấp, dẫn đến viên nén lớn và màng sinh học dày không phù hợp cho ứng dụng đường uống. Do đó, các hạt nano khử nước với tải trọng insulin cao rất được mong muốn. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng tải trọng insulin cao của các hạt nano sấy phun không chứa mannitol có thể mang lại nhiều lợi thế hấp dẫn cho các phương pháp vận chuyển thay thế này.
Tất cả các NP đã khử nước được bảo quản trong tủ lạnh trong ba tháng. Kết quả SEM cho thấy hình thái của tất cả các NP đã khử nước không thay đổi đáng kể trong suốt ba tháng bảo quản (Hình 4). Sau khi hòa tan lại trong nước, tất cả các NP đều cho thấy sự giảm nhẹ về EE và giải phóng một lượng nhỏ (~5%) insulin trong suốt ba tháng bảo quản (Bảng 2). Tuy nhiên, kích thước hạt trung bình của tất cả các hạt nano đều tăng lên. Kích thước hạt của NP sấy phun không có mannitol tăng lên 525 nm, trong khi đó kích thước hạt của NP sấy phun và sấy đông khô có mannitol tăng lên lần lượt là 872 và 921 nm (Bảng 2).
Hình thái của các hạt nano insulin đã khử nước khác nhau được bảo quản trong ba tháng: (a) Hình ảnh SEM của các hạt nano insulin đông khô có mannitol; (b) Hình ảnh SEM của các hạt nano insulin sấy phun không có mannitol; (c) Hình ảnh SEM của các hạt nano insulin sấy phun không có mannitol.
Hơn nữa, các kết tủa được quan sát thấy trong các hạt nano insulin được tái cấu trúc bằng phương pháp sấy phun với mannitol và sấy đông khô (Hình S2). Điều này có thể do các hạt lớn không phân tán đều trong nước. Tất cả các kết quả trên chứng minh rằng kỹ thuật sấy phun có thể bảo vệ các hạt nano insulin khỏi bị mất nước và có thể thu được hàm lượng cao các hạt nano insulin mà không cần bất kỳ chất độn hoặc chất bảo vệ đông lạnh nào.
Khả năng giữ insulin được kiểm tra trong môi trường pH = 2,5 với pepsin, trypsin và α-chymotrypsin để chứng minh khả năng bảo vệ của các hạt nano chống lại sự phân hủy enzyme sau khi khử nước. Khả năng giữ insulin của các hạt nano đã khử nước được so sánh với các hạt nano mới được điều chế, và insulin tự do được sử dụng làm đối chứng âm. Trong nghiên cứu này, insulin tự do cho thấy sự loại bỏ insulin nhanh chóng trong vòng 4 giờ trong cả ba phương pháp xử lý enzyme (Hình 5a–c). Ngược lại, thử nghiệm loại bỏ insulin của các hạt nano đông khô với mannitol và các hạt nano phun sấy có hoặc không có mannitol cho thấy khả năng bảo vệ của các hạt nano này chống lại sự phân hủy enzyme cao hơn đáng kể, tương tự như các hạt nano insulin mới được điều chế (hình 1). 5a-c). Với sự hỗ trợ của các hạt nano trong pepsin, trypsin và α-chymotrypsin, hơn 50%, 60% và 75% insulin có thể được bảo vệ trong vòng 4 giờ, tương ứng (Hình 5a–c). Khả năng bảo vệ insulin này có thể làm tăng cơ hội hấp thụ insulin cao hơn vào cơ thể. máu25.Những kết quả này cho thấy rằng việc sấy phun có hoặc không có mannitol và sấy đông khô với mannitol có thể bảo tồn khả năng bảo vệ insulin của NP sau khi khử nước.
Hành vi bảo vệ và giải phóng của các hạt nano insulin đã khử nước: (a) bảo vệ insulin trong dung dịch pepsin; (b) bảo vệ insulin trong dung dịch trypsin; (c) bảo vệ insulin bằng dung dịch α-chymotrypsin; (d) Hành vi giải phóng của các hạt nano đã khử nước trong dung dịch có pH = 2,5; (e) hành vi giải phóng của các hạt nano đã khử nước trong dung dịch có pH = 6,6; (f) hành vi giải phóng của các hạt nano đã khử nước trong dung dịch có pH = 7,0.
Các hạt nano insulin khô mới được điều chế và hoàn nguyên được ủ trong các dung dịch đệm khác nhau (pH = 2,5, 6,6, 7,0) ở 37 °C, mô phỏng môi trường pH của dạ dày, tá tràng và phần trên ruột non, để kiểm tra tác dụng của insulin đối với tình trạng kháng insulin. Hành vi giải phóng trong các môi trường khác nhau. Đoạn mô đường tiêu hóa. Ở pH = 2,5, các hạt nano chứa insulin và các hạt nano insulin khô được hòa tan lại cho thấy sự giải phóng nhanh ban đầu trong vòng một giờ đầu tiên, sau đó là sự giải phóng chậm trong 5 giờ tiếp theo (Hình 5d). Sự giải phóng nhanh chóng ban đầu này rất có thể là kết quả của sự khử hấp phụ nhanh chóng trên bề mặt của các phân tử protein không được cố định hoàn toàn trong cấu trúc bên trong của hạt. Ở pH = 6,5, các hạt nano chứa insulin và các hạt nano insulin khô được tái cấu trúc cho thấy sự giải phóng đều đặn và chậm trong 6 giờ, vì pH của dung dịch thử nghiệm tương tự như pH của dung dịch chuẩn bị hạt nano (Hình 5e). Ở pH = 7, các hạt nano không ổn định và gần như bị phân hủy hoàn toàn trong vòng hai giờ đầu tiên (Hình 5f). Điều này là do sự khử proton của chitosan xảy ra ở pH cao hơn, dẫn đến mạng lưới polymer kém đặc hơn và giải phóng insulin được nạp.
Hơn nữa, các hạt nano insulin được sấy phun mà không có mannitol cho thấy tốc độ giải phóng nhanh hơn so với các hạt nano đã khử nước khác (Hình 5d–f). Như đã mô tả trước đó, các hạt nano insulin được tái cấu trúc và sấy khô mà không có mannitol cho thấy kích thước hạt nhỏ nhất. Các hạt nhỏ cung cấp diện tích bề mặt lớn hơn, do đó hầu hết lượng thuốc cần thiết sẽ nằm ở hoặc gần bề mặt hạt, dẫn đến giải phóng thuốc nhanh chóng26.
Độc tính tế bào của NP được nghiên cứu bằng phương pháp thử nghiệm MTT. Như thể hiện trong Hình S4, tất cả các NP đã khử nước đều không có tác động đáng kể đến khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ 50–500 μg/ml, cho thấy rằng tất cả các NP đã khử nước đều có thể được sử dụng an toàn để đạt được phạm vi điều trị.
Gan là cơ quan chính mà insulin thực hiện các chức năng sinh lý của nó. Tế bào HepG2 là dòng tế bào ung thư gan người thường được sử dụng làm mô hình hấp thụ tế bào gan trong ống nghiệm. Ở đây, tế bào HepG2 được sử dụng để đánh giá sự hấp thụ tế bào của các hạt nano đã được khử nước bằng phương pháp đông khô và sấy phun. Sự hấp thụ tế bào được đánh giá bằng phương pháp quét laser confocal sử dụng cytometry dòng chảy và quan sát sau vài giờ ủ với insulin FITC tự do ở nồng độ 25 μg/mL, các hạt nano chứa insulin FITC mới được điều chế và các hạt nano chứa insulin FITC đã khử nước ở cùng nồng độ insulin. Quan sát hiển vi định lượng (CLSM) đã được thực hiện. Các hạt nano đông khô không có mannitol bị phá hủy trong quá trình khử nước và không được đánh giá trong thử nghiệm này. Cường độ huỳnh quang nội bào của các hạt nano chứa insulin mới được điều chế, các hạt nano đông khô có mannitol và các hạt nano sấy phun có và không có mannitol (Hình 6a) lần lượt là 4,3, 2,6, 2,4 và Cao hơn 4,1 lần so với insulin tự do. Nhóm insulin FITC (Hình 6b). Những kết quả này cho thấy insulin được bao bọc có hiệu quả hấp thụ vào tế bào cao hơn insulin tự do, chủ yếu là do kích thước nhỏ hơn của các hạt nano chứa insulin được tạo ra trong nghiên cứu này.
Sự hấp thụ insulin-FITC của tế bào HepG2 sau 4 giờ ủ với NP mới điều chế và NP đã khử nước: (a) Phân bố sự hấp thụ insulin-FITC bởi tế bào HepG2. (b) Giá trị trung bình hình học của cường độ huỳnh quang được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (n = 3), *P < 0,05 so với insulin tự do.
Tương tự, hình ảnh CLSM cho thấy cường độ huỳnh quang FITC của các hạt nano FITC-insulin mới điều chế và các hạt nano FITC-insulin sấy phun (không có mannitol) mạnh hơn nhiều so với các mẫu khác (Hình 6a). Hơn nữa, với việc bổ sung mannitol, độ nhớt cao hơn của dung dịch làm tăng sức cản đối với sự hấp thụ tế bào, dẫn đến giảm sự tăng sinh insulin. Những kết quả này cho thấy các hạt nano sấy phun không chứa mannitol thể hiện hiệu quả hấp thụ tế bào cao nhất vì kích thước hạt của chúng nhỏ hơn so với các hạt nano đông khô sau khi hòa tan lại.
Chitosan (khối lượng phân tử trung bình 100 KDa, độ khử acetyl 75–85%) được mua từ Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Natri tripolyphosphat (TPP) được mua từ VWR (Radnor, Pennsylvania, Hoa Kỳ). Insulin người tái tổ hợp được sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ Fisher Scientific (Waltham, MA, Hoa Kỳ). Insulin người được gắn nhãn fluorescein isothiocyanate (FITC) và 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) được mua từ Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Dòng tế bào HepG2 được lấy từ ATCC (Manassas, Virginia, Hoa Kỳ). Tất cả các thuốc thử khác đều thuộc loại phân tích hoặc sắc ký.
Chuẩn bị dung dịch CS 1 mg/ml bằng cách hòa tan trong nước cất hai lần (nước DD) có chứa 0,1% axit axetic. Chuẩn bị dung dịch TPP và insulin 1 mg/ml bằng cách hòa tan chúng lần lượt trong nước DD và axit axetic 0,1%. Nhũ tương sơ bộ được chuẩn bị bằng máy đồng hóa tốc độ cao Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Quy trình chuẩn bị như sau: đầu tiên, thêm 2 ml dung dịch TPP vào 4 ml dung dịch insulin, và khuấy hỗn hợp trong 30 phút cho đến khi trộn đều. Sau đó, nhỏ giọt dung dịch hỗn hợp vào dung dịch CS bằng ống tiêm dưới sự khuấy tốc độ cao (10.000 vòng/phút). Giữ hỗn hợp ở tốc độ cao (15.000 vòng/phút) trong bể đá trong 30 phút, và điều chỉnh đến độ pH nhất định để thu được các hạt nano insulin liên kết chéo. Để đồng nhất hóa hơn nữa và giảm kích thước hạt nano insulin, chúng được siêu âm. thêm 30 phút trong bồn nước đá bằng máy siêu âm dạng đầu dò (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Đức).
Các hạt nano insulin (NPS) được kiểm tra đường kính trung bình Z, chỉ số phân tán (PDI) và điện thế zeta bằng phép đo tán xạ ánh sáng động (DLS) sử dụng máy Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Áo) bằng cách pha loãng chúng trong nước cất khử ion ở 25°C. Hình thái và phân bố kích thước được đặc trưng bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản), và hình ảnh sau đó được phân tích bằng phần mềm hình ảnh Hitachi (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản). Để đánh giá hiệu quả đóng gói (EE) và khả năng tải (LC) của các hạt nano insulin, các hạt nano được nhỏ vào ống siêu lọc có giới hạn trọng lượng phân tử là 100 kDa và ly tâm ở 500 xg trong 30 phút. Lượng insulin không được đóng gói trong dịch lọc được định lượng bằng hệ thống HPLC Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, California, Hoa Kỳ) bao gồm bơm bốn cấp, bộ lấy mẫu tự động, bộ gia nhiệt cột và... Máy dò DAD. Insulin được phân tích bằng cột C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, Hoa Kỳ) và được phát hiện ở bước sóng 214 nm. Pha động là acetonitrile và nước, chứa 0,1% TFA, tỷ lệ gradient từ 10/90 đến 100/0, và chạy trong 10 phút. Pha động được bơm với tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút. Nhiệt độ cột được đặt ở 20 °C. Tính phần trăm EE và LC bằng cách sử dụng các phương trình (1) và phương trình (2).
Nhiều tỷ lệ CS/insulin khác nhau, từ 2,0 đến 4,0, đã được thử nghiệm để tối ưu hóa việc điều chế hạt nano insulin. Các lượng dung dịch CS khác nhau được thêm vào trong quá trình điều chế, trong khi hỗn hợp insulin/TPP được giữ không đổi. Các hạt nano insulin được điều chế trong phạm vi pH từ 4,0 đến 6,5 bằng cách kiểm soát cẩn thận pH của hỗn hợp sau khi thêm tất cả các dung dịch (insulin, TPP và CS). Hiệu suất đóng gói (EE) và kích thước hạt của các hạt nano insulin được đánh giá ở các giá trị pH khác nhau và tỷ lệ khối lượng CS/insulin khác nhau để tối ưu hóa sự hình thành các hạt nano insulin.
Các hạt nano insulin đã được tối ưu hóa được đặt trên hộp nhôm và phủ bằng giấy ăn, cố định bằng băng dính. Sau đó, các hộp đã được vặn chặt được đặt trong máy sấy đông khô Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) được trang bị khay sấy. Nhiệt độ và áp suất chân không được thiết lập ở -10 °C, 0,350 Torr trong 2 giờ đầu tiên, và 0 °C và 0,120 Torr trong 22 giờ còn lại của tổng số 24 giờ để thu được các hạt nano insulin khô.
Máy sấy phun mini Buchi B-290 (BÜCHI, Flawil, Thụy Sĩ) được sử dụng để tạo ra insulin dạng viên nang. Các thông số sấy được chọn là: nhiệt độ 100 °C, lưu lượng nguyên liệu 3 L/min và lưu lượng khí 4 L/min.
Các hạt nano insulin trước và sau khi khử nước được đặc trưng bằng phương pháp quang phổ FTIR-ATR. Các hạt nano đã khử nước cũng như insulin tự do và chitosan được phân tích bằng máy quang phổ FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) được trang bị phụ kiện lấy mẫu ATR đa năng (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Giá trị trung bình của tín hiệu được thu được từ 16 lần quét ở độ phân giải 4 cm2 trong dải tần số 4000-600 cm2.
Hình thái của các hạt nano insulin khô được đánh giá bằng ảnh SEM của các hạt nano insulin đông khô và phun khô được chụp bằng kính hiển vi điện tử quét chùm ion hội tụ Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, Hoa Kỳ). Thông số chính được sử dụng là điện áp 5 keV và dòng điện 30 mA.
Tất cả các hạt nano insulin đã khử nước đều được hòa tan lại trong nước cất. Kích thước hạt, chỉ số phân bố kích thước (PDI), hiệu suất đóng gói (EE) và hàm lượng lipid (LC) được kiểm tra lại bằng phương pháp đã đề cập trước đó để đánh giá chất lượng sau khi khử nước. Độ ổn định của các hạt nano anhydroinsulin cũng được đo bằng cách kiểm tra các đặc tính của hạt nano sau thời gian bảo quản dài. Trong nghiên cứu này, tất cả các hạt nano sau khi khử nước được bảo quản trong tủ lạnh trong ba tháng. Sau ba tháng bảo quản, các hạt nano được kiểm tra kích thước hạt, PDI, EE và LC.
Hòa tan 5 mL NP đã được tái cấu trúc trong 45 mL dung dịch mô phỏng dịch vị (pH 1,2, chứa 1% pepsin), dịch ruột (pH 6,8, chứa 1% trypsin) hoặc dung dịch chymotrypsin (100 g/mL, trong dung dịch đệm phosphat, pH 7,8) để đánh giá hiệu quả của insulin trong việc bảo vệ NP sau khi bị mất nước. Chúng được ủ ở 37°C với tốc độ khuấy 100 vòng/phút. Lấy 500 μL dung dịch ở các thời điểm khác nhau và xác định nồng độ insulin bằng HPLC.
Hành vi giải phóng in vitro của các hạt nano insulin mới được điều chế và khử nước đã được thử nghiệm bằng phương pháp túi thẩm tách (giới hạn trọng lượng phân tử 100 kDa, Spectra Por Inc.). Các hạt nano khô mới được điều chế và hoàn nguyên được thẩm tách trong dung dịch có pH 2,5, pH 6,6 và pH 7,0 (dung dịch muối đệm phosphat 0,1 M, PBS) để mô phỏng môi trường pH của dạ dày, tá tràng và ruột non trên, tương ứng. Tất cả các mẫu được ủ ở 37 °C với sự lắc liên tục ở tốc độ 200 vòng/phút. Hút dung dịch bên ngoài túi thẩm tách 5 mL ở các thời điểm sau: 0,5, 1, 2, 3, 4 và 6 giờ, và ngay lập tức bổ sung thể tích bằng dung dịch thẩm tách mới. Sự nhiễm bẩn insulin trong dung dịch được phân tích bằng HPLC, và tốc độ giải phóng insulin từ các hạt nano được tính toán từ tỷ lệ insulin tự do được giải phóng so với tổng lượng insulin được bao bọc trong các hạt nano (Phương trình 3).
Dòng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 được nuôi cấy trong đĩa đường kính 60 mm bằng môi trường Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) chứa 10% huyết thanh bào thai bò, 100 IU/mL penicillin và 100 μg/mL streptomycin29. Nuôi cấy được duy trì ở 37°C, độ ẩm tương đối 95% và 5% CO2. Đối với các thử nghiệm hấp thụ, tế bào HepG2 được gieo cấy ở mật độ 1 × 105 tế bào/ml vào hệ thống lam kính buồng 8 giếng Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, USA). Đối với các thử nghiệm độc tính tế bào, chúng được gieo cấy vào đĩa 96 giếng (Corning, NY, USA) ở mật độ 5 × 104 tế bào/ml.
Phương pháp xét nghiệm MTT được sử dụng để đánh giá độc tính tế bào của các hạt nano insulin mới được điều chế và khử nước30. Tế bào HepG2 được gieo vào đĩa 96 giếng với mật độ 5 × 104 tế bào/mL và nuôi cấy trong 7 ngày trước khi thử nghiệm. Các hạt nano insulin được pha loãng đến các nồng độ khác nhau (50 đến 500 μg/mL) trong môi trường nuôi cấy và sau đó được cho vào tế bào. Sau 24 giờ ủ, tế bào được rửa 3 lần bằng PBS và ủ với môi trường chứa 0,5 mg/ml MTT trong 4 giờ nữa. Độc tính tế bào được đánh giá bằng cách đo sự khử enzym của tetrazolium màu vàng MTT thành formazan màu tím ở bước sóng 570 nm bằng máy đọc quang phổ Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Thụy Sĩ).
Hiệu quả hấp thụ tế bào của các hạt nano (NP) được kiểm tra bằng kính hiển vi quét laser confocal và phân tích tế bào học dòng chảy. Mỗi giếng của hệ thống lam kính buồng Nunc Lab-Tek được xử lý bằng FITC-insulin tự do, các hạt nano chứa FITC-insulin và 25 μg/mL các hạt nano FITC-insulin đã khử nước được hòa tan lại ở cùng nồng độ và ủ trong 4 giờ. Tế bào được rửa 3 lần bằng PBS và cố định bằng paraformaldehyde 4%. Nhân tế bào được nhuộm bằng 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Vị trí của insulin được quan sát bằng kính hiển vi quét laser/confocal hai photon Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Nhật Bản). Đối với phân tích tế bào học dòng chảy, cùng nồng độ 10 μg/mL FITC-insulin tự do, các hạt nano chứa FITC-insulin và các hạt nano FITC-insulin đã khử nước được hòa tan lại được thêm vào... Các đĩa 96 giếng được cấy tế bào HepG2 và ủ trong 4 giờ. Sau 4 giờ ủ, tế bào được lấy ra và rửa 3 lần với FBS. 5 × 104 tế bào mỗi mẫu được phân tích bằng máy đo tế bào dòng chảy BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Hoa Kỳ).
Tất cả các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. So sánh giữa tất cả các nhóm được đánh giá bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) hoặc kiểm định t bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 26 cho Mac (IBM, Endicott, New York, USA) và p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Nghiên cứu này chứng minh tính linh hoạt và khả năng của phương pháp sấy phun trong việc khử nước các hạt nano chitosan/TPP/insulin liên kết chéo với khả năng tái tạo tốt hơn so với các phương pháp đông khô tiêu chuẩn sử dụng chất độn hoặc chất bảo vệ đông lạnh, cùng với khả năng tải cao hơn. Các hạt nano insulin được tối ưu hóa cho kích thước hạt trung bình là 318 nm và hiệu quả đóng gói là 99,4%. Kết quả SEM và FTIR sau khi khử nước cho thấy cấu trúc hình cầu chỉ được duy trì ở các hạt nano sấy phun có và không có mannitol và đông khô với mannitol, nhưng các hạt nano đông khô không có mannitol bị phân hủy trong quá trình khử nước. Trong thử nghiệm khả năng tái tạo, các hạt nano insulin sấy phun không có mannitol cho thấy kích thước hạt trung bình nhỏ nhất và khả năng tải cao nhất khi tái tạo. Hành vi giải phóng của tất cả các hạt nano đã khử nước này cho thấy chúng được giải phóng nhanh chóng trong dung dịch có pH = 2,5 và pH = 7, và rất ổn định trong dung dịch có pH = 6,5. So với các hạt nano đã khử nước được hòa tan lại khác, các hạt nano sấy phun không có mannitol cho thấy tốc độ giải phóng nhanh nhất. Kết quả này phù hợp với kết quả quan sát được trong thử nghiệm hấp thụ tế bào, vì các hạt nano sấy phun không có mannitol hầu như duy trì hoàn toàn hiệu quả hấp thụ tế bào của các hạt nano mới điều chế. Những kết quả này cho thấy các hạt nano insulin khô được điều chế bằng phương pháp sấy phun không có mannitol là phù hợp nhất để tiếp tục chế biến thành các dạng bào chế khan khác, chẳng hạn như viên nén uống hoặc màng sinh học dính.
Do vấn đề bản quyền sở hữu trí tuệ, các bộ dữ liệu được tạo ra và/hoặc phân tích trong nghiên cứu này không được công khai, nhưng có thể được cung cấp từ các tác giả tương ứng khi có yêu cầu hợp lý.
Kagan, A. Bệnh tiểu đường loại 2: nguồn gốc xã hội và khoa học, biến chứng y tế và ý nghĩa đối với bệnh nhân và những người khác. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Sự phát triển của việc bao bọc insulin: Liệu việc dùng đường uống giờ đây đã khả thi? Tạp chí Dược học. Dược sinh học. Kho chứa. 1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Những tiến bộ gần đây trong hệ thống phân phối liposome chứa insulin đường uống để điều trị bệnh tiểu đường. Giải thích. Tạp chí Dược học. 549, 201–217 (2018).