Bài viết này là một phần của đề tài nghiên cứu “Nâng cao khả năng kháng bệnh và sâu hại của cây họ đậu”, xem tất cả 5 bài viết.
Tác nhân gây bệnh hoại tử nấm thực vật Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary sử dụng chiến lược nhiều tầng để lây nhiễm các cây chủ khác nhau. Nghiên cứu này đề xuất sử dụng diamine L-ornithine, một axit amin không phải protein có khả năng kích thích tổng hợp các axit amin thiết yếu khác, như một chiến lược quản lý thay thế để tăng cường các phản ứng phân tử, sinh lý và sinh hóa của cây đậu Phaseolus vulgaris L. đối với bệnh mốc trắng do Pseudomonas sclerotiorum gây ra. Các thí nghiệm trong ống nghiệm cho thấy L-ornithine ức chế đáng kể sự phát triển sợi nấm của S. pyrenoidosa theo liều lượng. Hơn nữa, nó có thể làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh mốc trắng trong điều kiện nhà kính. Ngoài ra, L-ornithine kích thích sự phát triển của cây được xử lý, cho thấy nồng độ L-ornithine được thử nghiệm không gây độc cho cây. Ngoài ra, L-ornithine làm tăng biểu hiện của các chất chống oxy hóa không enzym (tổng lượng phenolic hòa tan và flavonoid) và các chất chống oxy hóa enzym (catalase (CAT), peroxidase (POX) và polyphenol oxidase (PPO)), đồng thời làm tăng biểu hiện của ba gen liên quan đến chất chống oxy hóa (PvCAT1, PvSOD và PvGR). Hơn nữa, phân tích trên máy tính cho thấy sự hiện diện của một protein oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) tiềm năng trong bộ gen của S. sclerotiorum, có độ tương đồng cao với các protein oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) của Aspergillus fijiensis (AfOAH) và Penicillium sp. (PlOAH) về phân tích chức năng, các miền bảo tồn và cấu trúc không gian. Điều thú vị là, việc bổ sung L-ornithine vào môi trường canh thang khoai tây dextrose (PDB) làm giảm đáng kể biểu hiện của gen SsOAH trong sợi nấm S. sclerotiorum. Tương tự, việc bổ sung L-ornithine từ bên ngoài đã làm giảm đáng kể sự biểu hiện của gen SsOAH trong sợi nấm thu thập từ cây được xử lý. Cuối cùng, việc sử dụng L-ornithine đã làm giảm đáng kể sự tiết axit oxalic trong cả môi trường PDB và lá bị nhiễm bệnh. Tóm lại, L-ornithine đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái oxy hóa khử cũng như tăng cường phản ứng phòng vệ của cây bị nhiễm bệnh. Kết quả nghiên cứu này có thể giúp phát triển các phương pháp mới, thân thiện với môi trường để kiểm soát bệnh mốc trắng và giảm thiểu tác động của nó đến sản xuất đậu và các loại cây trồng khác.
Bệnh mốc trắng, do nấm hoại sinh Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary gây ra, là một bệnh tàn phá, làm giảm năng suất nghiêm trọng, đe dọa sản lượng đậu (Phaseolus vulgaris L.) toàn cầu (Bolton và cộng sự, 2006). Sclerotinia sclerotiorum là một trong những tác nhân gây bệnh thực vật do nấm trong đất khó kiểm soát nhất, với phạm vi vật chủ rộng lớn trên hơn 600 loài thực vật và khả năng phân hủy nhanh chóng các mô vật chủ một cách không đặc hiệu (Liang và Rollins, 2018). Trong điều kiện không thuận lợi, nó trải qua một giai đoạn quan trọng trong vòng đời của mình, ngủ đông trong thời gian dài dưới dạng các cấu trúc màu đen, cứng, giống như hạt gọi là 'sclerotia' trong đất hoặc dưới dạng các mảng trắng, xốp trong sợi nấm hoặc lõi thân cây bị nhiễm bệnh (Schwartz và cộng sự, 2005). Nấm S. sclerotiorum có khả năng hình thành hạch nấm (sclerotia), cho phép nó tồn tại trong các cánh đồng bị nhiễm bệnh trong thời gian dài và duy trì sự sống trong quá trình gây bệnh (Schwartz và cộng sự, 2005). Hạch nấm rất giàu chất dinh dưỡng, có thể tồn tại trong đất trong thời gian dài và đóng vai trò là nguồn lây nhiễm chính cho các lần nhiễm bệnh tiếp theo (Schwartz và cộng sự, 2005). Trong điều kiện thuận lợi, hạch nấm nảy mầm và tạo ra bào tử trong không khí có thể lây nhiễm tất cả các bộ phận trên mặt đất của cây, bao gồm nhưng không giới hạn ở hoa, thân hoặc quả (Schwartz và cộng sự, 2005).
Nấm Sclerotinia sclerotiorum sử dụng chiến lược nhiều tầng để lây nhiễm cây chủ, bao gồm một loạt các sự kiện phối hợp từ sự nảy mầm của hạch nấm đến sự phát triển triệu chứng. Ban đầu, S. sclerotiorum tạo ra các bào tử lơ lửng (gọi là bào tử túi) từ các cấu trúc giống nấm gọi là thể quả, chúng bay trong không khí và phát triển thành hạch nấm không di động trên các mảnh vụn thực vật bị nhiễm bệnh (Bolton và cộng sự, 2006). Sau đó, nấm tiết ra axit oxalic, một yếu tố độc lực, để kiểm soát độ pH của thành tế bào thực vật, thúc đẩy sự phân hủy enzyme và xâm nhập mô (Hegedus và Rimmer, 2005), và ức chế sự bùng phát oxy hóa của cây chủ. Quá trình axit hóa này làm suy yếu thành tế bào thực vật, tạo ra môi trường thuận lợi cho hoạt động bình thường và hiệu quả của các enzyme phân hủy thành tế bào nấm (CWDEs), cho phép mầm bệnh vượt qua rào cản vật lý và xâm nhập vào mô vật chủ (Marciano và cộng sự, 1983). Sau khi xâm nhập, S. sclerotiorum tiết ra một số enzyme phân giải thành tế bào (CWDE), chẳng hạn như polygalacturonase và cellulase, giúp nó lan rộng trong các mô bị nhiễm bệnh và gây hoại tử mô. Sự tiến triển của các vết bệnh và thảm sợi nấm dẫn đến các triệu chứng đặc trưng của bệnh mốc trắng (Hegedus và Rimmer, 2005). Trong khi đó, cây chủ nhận biết các mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh (PAMPs) thông qua các thụ thể nhận dạng mẫu (PRRs), kích hoạt một loạt các sự kiện tín hiệu cuối cùng kích hoạt các phản ứng phòng vệ.
Mặc dù đã có hàng thập kỷ nỗ lực kiểm soát dịch bệnh, tình trạng thiếu nguồn giống kháng bệnh vẫn còn tồn tại ở cây đậu, cũng như các cây trồng thương mại khác, do khả năng kháng bệnh, sinh tồn và thích nghi của mầm bệnh. Do đó, việc quản lý dịch bệnh vô cùng khó khăn và đòi hỏi một chiến lược tích hợp, đa diện bao gồm sự kết hợp giữa các biện pháp canh tác, kiểm soát sinh học và thuốc diệt nấm hóa học (O'Sullivan et al., 2021). Kiểm soát hóa học bệnh mốc trắng là hiệu quả nhất vì thuốc diệt nấm, khi được sử dụng đúng cách và đúng thời điểm, có thể kiểm soát hiệu quả sự lây lan của bệnh, giảm mức độ nghiêm trọng của nhiễm bệnh và giảm thiểu tổn thất năng suất. Tuy nhiên, việc lạm dụng và phụ thuộc quá mức vào thuốc diệt nấm có thể dẫn đến sự xuất hiện các chủng kháng thuốc của S. sclerotiorum và ảnh hưởng tiêu cực đến các sinh vật không phải mục tiêu, sức khỏe của đất và chất lượng nước (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế thân thiện với môi trường đã trở thành ưu tiên hàng đầu.
Các polyamine (PA), chẳng hạn như putrescine, spermidine, spermine và cadaverine, có thể là những giải pháp thay thế đầy hứa hẹn để chống lại các tác nhân gây bệnh thực vật trong đất, từ đó giảm thiểu hoàn toàn hoặc một phần việc sử dụng thuốc diệt nấm hóa học nguy hiểm (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Ở thực vật bậc cao, PA tham gia vào nhiều quá trình sinh lý bao gồm, nhưng không giới hạn ở, sự phân chia tế bào, sự biệt hóa và phản ứng với các tác nhân gây căng thẳng sinh học và phi sinh học (Killiny và Nehela, 2020). Chúng có thể hoạt động như chất chống oxy hóa, giúp loại bỏ các gốc oxy phản ứng (ROS), duy trì cân bằng oxy hóa khử (Nehela và Killiny, 2023), kích hoạt các gen liên quan đến phòng vệ (Romero et al., 2018), điều chỉnh các con đường trao đổi chất khác nhau (Nehela và Killiny, 2023), điều hòa các phytohormone nội sinh (Nehela và Killiny, 2019), thiết lập khả năng kháng bệnh toàn thân (SAR) và điều chỉnh tương tác giữa thực vật và mầm bệnh (Nehela và Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Điều đáng chú ý là các cơ chế và vai trò cụ thể của PA trong phòng vệ thực vật khác nhau tùy thuộc vào loài thực vật, mầm bệnh và điều kiện môi trường. PA dồi dào nhất trong thực vật được tổng hợp sinh học từ polyamine thiết yếu L-ornithine (Killiny và Nehela, 2020).
L-ornithine đóng nhiều vai trò trong sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Ví dụ, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng ở cây lúa (Oryza sativa), ornithine có thể liên quan đến quá trình tái chế nitơ (Liu et al., 2018), năng suất, chất lượng và hương thơm của lúa (Lu et al., 2020), và phản ứng với stress do thiếu nước (Yang et al., 2000). Hơn nữa, việc bón L-ornithine từ bên ngoài đã tăng cường đáng kể khả năng chịu hạn ở củ cải đường (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) và làm giảm stress do muối ở cây hành tây (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu và Çavuşoǧlu, 2021) và cây điều (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Vai trò tiềm năng của L-ornithine trong phòng vệ chống lại stress phi sinh học có thể là do sự tham gia của nó vào quá trình tích lũy proline trong cây được xử lý. Ví dụ, các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa proline, chẳng hạn như gen ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) và proline dehydrogenase (ProDH1 và ProDH2), trước đây đã được báo cáo là có liên quan đến khả năng phòng vệ của Nicotiana benthamiana và Arabidopsis thaliana chống lại các chủng Pseudomonas syringae không phải vật chủ (Senthil-Kumar và Mysore, 2012). Mặt khác, ornithine decarboxylase (ODC) của nấm là cần thiết cho sự phát triển của mầm bệnh (Singh et al., 2020). Việc nhắm mục tiêu vào ODC của Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici thông qua phương pháp làm im lặng gen do vật chủ gây ra (HIGS) đã tăng cường đáng kể khả năng kháng bệnh héo rũ do Fusarium ở cây cà chua (Singh et al., 2020). Tuy nhiên, vai trò tiềm năng của việc bổ sung ornithine ngoại sinh chống lại các tác nhân gây hại sinh học như mầm bệnh thực vật vẫn chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng. Quan trọng hơn, tác dụng của ornithine đối với khả năng kháng bệnh và các hiện tượng sinh hóa và sinh lý liên quan vẫn chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng.
Hiểu rõ sự phức tạp của bệnh nấm mốc trắng S. sclerotiorum ở cây họ đậu rất quan trọng cho việc phát triển các chiến lược kiểm soát hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhằm mục đích xác định vai trò tiềm năng của diamine L-ornithine như một yếu tố then chốt trong việc tăng cường cơ chế phòng vệ và khả năng kháng bệnh của cây họ đậu đối với bệnh nấm mốc trắng Sclerotinia sclerotiorum. Chúng tôi giả thuyết rằng, ngoài việc tăng cường phản ứng phòng vệ của cây bị nhiễm bệnh, L-ornithine còn đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái oxy hóa khử. Chúng tôi đề xuất rằng các tác dụng tiềm năng của L-ornithine có liên quan đến việc điều hòa các cơ chế phòng vệ chống oxy hóa enzym và không enzym, cũng như sự can thiệp vào các yếu tố gây bệnh/độc lực của nấm và các protein liên quan. Chức năng kép này của L-ornithine khiến nó trở thành một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho một chiến lược bền vững nhằm giảm thiểu tác động của bệnh nấm mốc trắng và tăng cường khả năng kháng bệnh của các loại cây họ đậu phổ biến đối với tác nhân gây bệnh nấm mạnh này. Kết quả của nghiên cứu hiện tại có thể giúp phát triển các phương pháp kiểm soát bệnh nấm mốc trắng tiên tiến, thân thiện với môi trường và giảm thiểu tác động của nó đến sản xuất cây họ đậu.
Trong nghiên cứu này, giống đậu tương thương mại mẫn cảm, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm. Hạt giống khỏe mạnh được cung cấp bởi Khoa Nghiên cứu Cây họ đậu, Viện Nghiên cứu Cây trồng (FCRI), Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp (ARC), Ai Cập. Năm hạt giống được gieo trong chậu nhựa (đường kính trong 35 cm, độ sâu 50 cm) chứa đất nhiễm S. sclerotiorum trong điều kiện nhà kính (25 ± 2 °C, độ ẩm tương đối 75 ± 1%, 8 giờ chiếu sáng/16 giờ tối). Sau 7-10 ngày gieo (DPS), cây con được tỉa bớt chỉ để lại hai cây con phát triển đồng đều và ba lá đã phát triển đầy đủ trong mỗi chậu. Tất cả các cây trong chậu được tưới nước hai tuần một lần và bón phân hàng tháng theo liều lượng khuyến cáo cho từng giống.
Để chuẩn bị dung dịch L-ornithinediamine (còn được gọi là axit (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Đức) với nồng độ 500 mg/L, trước tiên hòa tan 50 mg chất này vào 100 mL nước cất vô trùng. Dung dịch gốc sau đó được pha loãng và sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Tóm lại, sáu dãy nồng độ L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 và 125 mg/L) đã được thử nghiệm trong ống nghiệm. Ngoài ra, nước cất vô trùng được sử dụng làm đối chứng âm (Mock) và thuốc diệt nấm thương mại “Rizolex-T” dạng bột hòa tan 50% (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; Công ty Thuốc trừ sâu và Hóa chất KZ-Kafr El Zayat, Kafr El Zayat, Tỉnh Gharbia, Ai Cập) được sử dụng làm đối chứng dương. Thuốc diệt nấm thương mại “Rizolex-T” đã được thử nghiệm trong ống nghiệm ở năm nồng độ (2, 4, 6, 8 và 10 mg/L).
Các mẫu thân và quả đậu tương có triệu chứng điển hình của bệnh mốc trắng (tỷ lệ nhiễm bệnh: 10–30%) được thu thập từ các trang trại thương mại. Mặc dù hầu hết các vật liệu thực vật bị nhiễm bệnh đã được xác định loài/giống (giống thương mại mẫn cảm Giza 3), nhưng một số khác, đặc biệt là những mẫu thu được từ các chợ địa phương, có loài không xác định. Các vật liệu bị nhiễm bệnh thu thập được trước tiên được khử trùng bề mặt bằng dung dịch natri hypoclorit 0,5% trong 3 phút, sau đó rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng và lau khô bằng giấy lọc vô trùng để loại bỏ nước thừa. Các bộ phận bị nhiễm bệnh sau đó được cắt thành từng mảnh nhỏ từ mô giữa (giữa mô khỏe mạnh và mô bị nhiễm bệnh), nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây dextrose (PDA) và ủ ở 25 ± 2 °C với chu kỳ sáng/tối 12 giờ trong 5 ngày để kích thích sự hình thành hạch nấm. Phương pháp đầu sợi nấm cũng được sử dụng để tinh sạch các chủng nấm từ các mẫu nuôi cấy hỗn hợp hoặc bị nhiễm bẩn. Chủng nấm tinh khiết được xác định lần đầu tiên dựa trên đặc điểm hình thái nuôi cấy, sau đó được khẳng định là S. sclerotiorum dựa trên đặc điểm hiển vi. Cuối cùng, tất cả các chủng tinh khiết đều được thử nghiệm khả năng gây bệnh trên giống đậu tương mẫn cảm Giza 3 để đáp ứng các định đề Koch.
Ngoài ra, chủng S. sclerotiorum xâm lấn nhất (chủng #3) đã được xác nhận thêm dựa trên trình tự vùng phiên mã nội bộ (ITS) như mô tả bởi White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Tóm lại, các chủng được nuôi cấy trong môi trường canh thang khoai tây dextrose (PDB) và ủ ở 25 ± 2 °C trong 5–7 ngày. Sau đó, sợi nấm được thu thập, lọc qua vải thưa, rửa hai lần bằng nước vô trùng và làm khô bằng giấy lọc vô trùng. DNA bộ gen được phân lập bằng bộ kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Vùng ITS rDNA sau đó được khuếch đại bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; kích thước dự kiến: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Sản phẩm PCR tinh khiết được gửi đi giải trình tự (Công ty TNHH Công nghệ sinh học Bắc Kinh Aoke Dingsheng). Trình tự ITS rDNA được giải trình tự theo hai chiều bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Các trình tự truy vấn được lắp ráp sau đó được so sánh với dữ liệu mới nhất trong GenBank và Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) bằng phần mềm BLASTn. Trình tự truy vấn được so sánh với 20 chủng/mẫu phân lập S. sclerotiorum khác được lấy từ dữ liệu mới nhất trong NCBI GenBank (Bảng bổ sung S1) bằng cách sử dụng ClustalW trong Gói phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA-11; phiên bản 11) (Kumar et al., 2024). Phân tích tiến hóa được thực hiện bằng phương pháp xác suất tối đa và mô hình thay thế nucleotide thuận nghịch theo thời gian tổng quát (Nei và Kumar, 2000). Cây có log-likelihood cao nhất được hiển thị. Cây ban đầu cho tìm kiếm heuristic được chọn bằng cách chọn cây có log-likelihood cao hơn giữa cây nối liền kề (NJ) (Kumar et al., 2024) và cây tiết kiệm tối đa (MP). Cây NJ được xây dựng bằng cách sử dụng ma trận khoảng cách từng cặp được tính toán bằng cách sử dụng mô hình thuận nghịch theo thời gian tổng quát (Nei và Kumar, 2000).
Hoạt tính kháng khuẩn của L-ornithine và thuốc diệt khuẩn “Rizolex-T” được xác định trong ống nghiệm bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Phương pháp: Lấy một lượng dung dịch gốc L-ornithine thích hợp (500 mg/L) và trộn đều với 10 ml môi trường dinh dưỡng PDA để chuẩn bị các dung dịch có nồng độ cuối cùng lần lượt là 12,5, 25, 50, 75, 100 và 125 mg/L. Năm nồng độ của thuốc diệt nấm “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 và 10 mg/L) và nước cất vô trùng được sử dụng làm đối chứng. Sau khi môi trường đông đặc, một mẩu sợi nấm Sclerotinia sclerotiorum mới được chuẩn bị, đường kính 4 mm, được chuyển vào giữa đĩa Petri và nuôi cấy ở 25±2°C cho đến khi sợi nấm phủ kín toàn bộ đĩa Petri đối chứng, sau đó ghi lại sự phát triển của nấm. Tính phần trăm ức chế sự phát triển xuyên tâm của S. sclerotiorum bằng cách sử dụng phương trình 1:
Thí nghiệm được lặp lại hai lần, với sáu mẫu sinh học cho mỗi nhóm đối chứng/thí nghiệm và năm chậu (hai cây mỗi chậu) cho mỗi mẫu sinh học. Mỗi mẫu sinh học được phân tích hai lần (hai lần lặp kỹ thuật) để đảm bảo tính chính xác, độ tin cậy và khả năng tái lập của kết quả thí nghiệm. Ngoài ra, phân tích hồi quy probit được sử dụng để tính toán nồng độ ức chế bán tối đa (IC50) và IC99 (Prentice, 1976).
Để đánh giá tiềm năng của L-ornithine trong điều kiện nhà kính, hai thí nghiệm trồng trong chậu liên tiếp đã được tiến hành. Tóm lại, các chậu được đổ đầy đất sét pha cát đã khử trùng (tỷ lệ 3:1) và cấy với dịch nuôi cấy S. sclerotiorum mới được chuẩn bị. Đầu tiên, chủng S. sclerotiorum xâm lấn nhất (chủng số 3) được nuôi cấy bằng cách cắt đôi một hạch nấm, đặt úp xuống trên môi trường PDA và ủ ở 25°C trong bóng tối liên tục (24 giờ) trong 4 ngày để kích thích sự phát triển của sợi nấm. Sau đó, bốn mẩu thạch đường kính 5 mm được lấy từ mép trước và cấy 100 g hỗn hợp cám lúa mì và cám gạo đã khử trùng (tỷ lệ 1:1, v/v) và tất cả các bình được ủ ở 25 ± 2 °C dưới chu kỳ chiếu sáng 12 giờ/tối 12 giờ trong 5 ngày để kích thích sự hình thành hạch nấm. Nội dung của tất cả các bình được trộn kỹ để đảm bảo tính đồng nhất trước khi thêm đất. Sau đó, 100 g hỗn hợp cám dùng để cấy nấm được thêm vào mỗi chậu để đảm bảo nồng độ mầm bệnh ổn định. Các chậu đã được cấy nấm được tưới nước để kích hoạt sự phát triển của nấm và đặt trong điều kiện nhà kính trong 7 ngày.
Năm hạt giống giống Giza 3 được gieo vào mỗi chậu. Đối với các chậu được xử lý bằng L-ornithine và thuốc diệt nấm Rizolex-T, hạt giống đã được khử trùng được ngâm trong dung dịch nước của hai hợp chất này trong hai giờ với nồng độ IC99 cuối cùng lần lượt khoảng 250 mg/L và 50 mg/L, sau đó phơi khô trong một giờ trước khi gieo. Mặt khác, hạt giống được ngâm trong nước cất vô trùng làm đối chứng âm tính. Sau 10 ngày, trước khi tưới nước lần đầu, cây con được tỉa bớt, chỉ để lại hai cây con khỏe mạnh trong mỗi chậu. Ngoài ra, để đảm bảo nhiễm S. sclerotiorum, thân cây đậu ở cùng giai đoạn phát triển (10 ngày) được cắt ở hai vị trí khác nhau bằng dao mổ đã khử trùng và khoảng 0,5 g hỗn hợp cám dùng để cấy mầm được đặt vào mỗi vết cắt, sau đó duy trì độ ẩm cao để kích thích sự lây nhiễm và phát triển bệnh ở tất cả các cây được cấy mầm. Các cây đối chứng cũng được gây tổn thương tương tự và một lượng hỗn hợp cám vô trùng, không bị nhiễm khuẩn (0,5 g) được đặt vào vết thương và duy trì ở độ ẩm cao để mô phỏng môi trường phát triển bệnh và đảm bảo tính nhất quán giữa các nhóm điều trị.
Phương pháp xử lý: Cây đậu con được tưới 500 ml dung dịch L-ornithine (250 mg/l) hoặc thuốc diệt nấm Rizolex-T (50 mg/l) bằng cách tưới vào đất, sau đó lặp lại ba lần với khoảng thời gian 10 ngày. Nhóm đối chứng được xử lý bằng giả dược được tưới 500 ml nước cất vô trùng. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà kính (25 ± 2°C, độ ẩm tương đối 75 ± 1%, và chu kỳ chiếu sáng 8 giờ sáng/16 giờ tối). Tất cả các chậu được tưới nước hai tuần một lần và bón phân NPK cân bằng (20-20-20, với 3,6% lưu huỳnh và các nguyên tố vi lượng TE; Zain Seeds, Ai Cập) hàng tháng ở nồng độ 3–4 g/l bằng cách phun qua lá theo khuyến nghị cho từng giống cụ thể và hướng dẫn của nhà sản xuất. Trừ khi có quy định khác, các lá trưởng thành đã phát triển hoàn toàn (lá thứ 2 và thứ 3 tính từ ngọn) được thu thập từ mỗi mẫu sinh học sau 72 giờ xử lý (hpt), được nghiền nhỏ, gộp lại và bảo quản ở -80 °C để phân tích thêm, bao gồm nhưng không giới hạn ở việc xác định vị trí mô học tại chỗ của các chỉ số stress oxy hóa, quá trình peroxy hóa lipid, chất chống oxy hóa enzym và không enzym, và biểu hiện gen.
Mức độ nhiễm nấm mốc trắng được đánh giá hàng tuần sau 21 ngày kể từ khi gây nhiễm (dpi) bằng thang điểm từ 1–9 (Bảng bổ sung S2) dựa trên thang điểm Petzoldt và Dickson (1996) được Teran et al. (2006) sửa đổi. Tóm lại, thân và cành cây đậu được kiểm tra bắt đầu từ điểm gây nhiễm để theo dõi sự tiến triển của các vết bệnh dọc theo lóng và đốt. Khoảng cách của vết bệnh từ điểm gây nhiễm đến điểm xa nhất dọc theo thân hoặc cành sau đó được đo và điểm số từ 1–9 được gán dựa trên vị trí của vết bệnh, trong đó (1) cho biết không có nhiễm trùng rõ ràng gần điểm gây nhiễm và (2–9) cho biết kích thước vết bệnh tăng dần và tiến triển dọc theo đốt/láng (Bảng bổ sung S2). Mức độ nhiễm nấm mốc trắng sau đó được chuyển đổi thành phần trăm bằng công thức 2:
Ngoài ra, diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) được tính bằng công thức (Shaner và Finney, 1977), công thức này gần đây đã được điều chỉnh cho bệnh thối trắng ở đậu tương (Chauhan et al., 2020) bằng phương trình 3:
Trong đó, Yi = mức độ nghiêm trọng của bệnh tại thời điểm ti, Yi+1 = mức độ nghiêm trọng của bệnh tại thời điểm tiếp theo ti+1, ti = thời điểm đo lần đầu (tính bằng ngày), ti+1 = thời điểm đo tiếp theo (tính bằng ngày), n = tổng số điểm thời gian hoặc điểm quan sát. Các thông số sinh trưởng của cây đậu bao gồm chiều cao cây (cm), số cành trên mỗi cây và số lá trên mỗi cây được ghi lại hàng tuần trong 21 ngày ở tất cả các mẫu sinh học.
Trong mỗi lần lặp lại sinh học, mẫu lá (lá thứ hai và thứ ba phát triển hoàn toàn tính từ ngọn) được thu thập vào ngày thứ 45 sau khi xử lý (15 ngày sau lần xử lý cuối cùng). Mỗi lần lặp lại sinh học bao gồm năm chậu (hai cây mỗi chậu). Khoảng 500 mg mô nghiền được sử dụng để chiết xuất các sắc tố quang hợp (diệp lục a, diệp lục b và carotenoid) bằng acetone 80% ở 4 °C trong bóng tối. Sau 24 giờ, các mẫu được ly tâm và dịch nổi được thu thập để xác định hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và carotenoid bằng phương pháp đo màu sử dụng máy quang phổ UV-160A (Shimadzu Corporation, Nhật Bản) theo phương pháp của (Lichtenthaler, 1987) bằng cách đo độ hấp thụ ở ba bước sóng khác nhau (A470, A646 và A663 nm). Cuối cùng, hàm lượng các sắc tố quang hợp được tính toán bằng cách sử dụng các công thức 4–6 được mô tả bởi Lichtenthaler (1987).
Sau 72 giờ xử lý (hpt), lá (lá thứ hai và thứ ba phát triển hoàn toàn tính từ ngọn) được thu thập từ mỗi mẫu sinh học để xác định vị trí mô học tại chỗ của hydrogen peroxide (H2O2) và anion superoxide (O2•−). Mỗi mẫu sinh học bao gồm năm chậu (hai cây mỗi chậu). Mỗi mẫu sinh học được phân tích hai lần (hai lần lặp lại kỹ thuật) để đảm bảo độ chính xác, độ tin cậy và khả năng tái lập của phương pháp. H2O2 và O2•− được xác định bằng cách sử dụng 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Đức) hoặc nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Đức), tương ứng, theo các phương pháp được mô tả bởi Romero-Puertas et al. (2004) và Adam et al. (1989) với một số sửa đổi nhỏ. Để xác định vị trí H2O2 tại chỗ bằng phương pháp mô học, các lá van được ngấm chân không với dung dịch DAB 0,1% trong dung dịch đệm Tris 10 mM (pH 7,8) và sau đó ủ ở nhiệt độ phòng dưới ánh sáng trong 60 phút. Các lá van được tẩy trắng trong dung dịch TCA 0,15% (v/v) trong hỗn hợp ethanol:chloroform tỷ lệ 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Ai Cập) và sau đó chiếu sáng cho đến khi chúng sẫm màu. Tương tự, các van được ngấm chân không với dung dịch đệm kali photphat 10 mM (pH 7,8) chứa 0,1% HBT để xác định vị trí O2•− tại chỗ bằng phương pháp mô học. Các lá van được ủ dưới ánh sáng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, sau đó tẩy trắng như trên, và sau đó chiếu sáng cho đến khi xuất hiện các đốm màu xanh đậm/tím. Cường độ của màu nâu (như một chỉ thị H2O2) hoặc màu xanh tím (như một chỉ thị O2•−) thu được đã được đánh giá bằng cách sử dụng phiên bản Fiji của phần mềm xử lý hình ảnh ImageJ (http://fiji.sc; truy cập ngày 7 tháng 3 năm 2024).
Malondialdehyde (MDA; dùng làm chỉ thị cho quá trình peroxy hóa lipid) được xác định theo phương pháp của Du và Bramlage (1992) với một số sửa đổi nhỏ. Lá từ mỗi mẫu sinh học (lá thứ hai và thứ ba phát triển hoàn toàn tính từ ngọn) được thu thập 72 giờ sau khi xử lý (hpt). Mỗi mẫu sinh học bao gồm năm chậu (hai cây mỗi chậu). Mỗi mẫu sinh học được phân tích lặp lại hai lần (hai lần lặp lại kỹ thuật) để đảm bảo độ chính xác, độ tin cậy và khả năng tái lập của phương pháp. Tóm lại, 0,5 g mô lá nghiền được sử dụng để chiết xuất MDA bằng axit trichloroacetic 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) chứa 0,01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Hàm lượng MDA trong dịch nổi sau đó được xác định bằng phương pháp đo màu bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 532 và 600 nm sử dụng máy quang phổ UV-160A (Shimadzu Corporation, Nhật Bản) và được biểu thị bằng nmol g−1 FW.
Để đánh giá các chất chống oxy hóa không enzyme và enzyme, lá (lá thứ hai và thứ ba phát triển hoàn toàn từ ngọn) được thu thập từ mỗi mẫu sinh học sau 72 giờ xử lý (hpt). Mỗi mẫu sinh học bao gồm năm chậu (hai cây mỗi chậu). Mỗi mẫu sinh học được phân tích hai lần (hai mẫu kỹ thuật). Hai lá được nghiền bằng nitơ lỏng và sử dụng trực tiếp để xác định các chất chống oxy hóa enzyme và không enzyme, tổng axit amin, hàm lượng proline, biểu hiện gen và định lượng oxalat.
Tổng lượng phenolic hòa tan được xác định bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) với một số sửa đổi nhỏ so với phương pháp được mô tả bởi Kahkonen et al. (1999). Tóm lại, khoảng 0,1 g mô lá đã được đồng nhất hóa được chiết xuất với 20 ml methanol 80% trong bóng tối trong 24 giờ và phần dịch nổi được thu thập sau khi ly tâm. 0,1 ml dịch chiết mẫu được trộn với 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%), lắc trong 30 giây và để trong bóng tối trong 5 phút. Sau đó, 0,5 ml dung dịch natri cacbonat 20% (Na2CO3; Công ty Dược phẩm và Vật tư Y tế Al-Gomhoria, Cairo, Ai Cập) được thêm vào mỗi ống nghiệm, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối trong 1 giờ. Sau khi ủ, độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 765 nm bằng máy quang phổ UV-160A (Shimadzu Corporation, Nhật Bản). Nồng độ tổng phenol hòa tan trong dịch chiết mẫu được xác định bằng đường cong hiệu chuẩn axit gallic (Fisher Scientific, Hampton, NH, Hoa Kỳ) và được biểu thị bằng miligam tương đương axit gallic trên gam trọng lượng tươi (mg GAE g-1 trọng lượng tươi).
Tổng hàm lượng flavonoid hòa tan được xác định theo phương pháp của Djeridane et al. (2006) với một số sửa đổi nhỏ. Tóm lại, 0,3 ml dịch chiết methanol ở trên được trộn với 0,3 ml dung dịch nhôm clorua 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), khuấy mạnh và sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tiếp theo là thêm 0,3 ml dung dịch kali axetat 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Ai Cập), trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trong bóng tối. Sau khi ủ, độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 430 nm bằng máy quang phổ UV-160A (Shimadzu Corporation, Nhật Bản). Nồng độ tổng flavonoid hòa tan trong dịch chiết mẫu được xác định bằng đường cong hiệu chuẩn rutin (TCI America, Portland, OR, USA) và sau đó được biểu thị bằng miligam rutin tương đương trên gam trọng lượng tươi (mg RE g-1 trọng lượng tươi).
Tổng hàm lượng axit amin tự do trong lá đậu được xác định bằng thuốc thử ninhydrin cải tiến (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) dựa trên phương pháp do Yokoyama và Hiramatsu (2003) đề xuất và được Sun et al. (2006) sửa đổi. Tóm lại, 0,1 g mô nghiền được chiết xuất bằng dung dịch đệm pH 5,4, và 200 μL dịch nổi được cho phản ứng với 200 μL ninhydrin (2%) và 200 μL pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), ủ trong bể nước sôi trong 30 phút, sau đó làm nguội và đo ở bước sóng 580 nm bằng máy quang phổ UV-160A (Shimadzu Corporation, Nhật Bản). Mặt khác, proline được xác định bằng phương pháp Bates (Bates et al., 1973). Proline được chiết xuất bằng axit sulfosalicylic 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) và sau khi ly tâm, 0,5 ml dịch nổi được trộn với 1 ml axit axetic băng (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) và thuốc thử ninhydrin, ủ ở 90°C trong 45 phút, làm nguội và đo ở bước sóng 520 nm bằng cùng máy quang phổ như trên. Tổng lượng axit amin tự do và proline trong dịch chiết lá được xác định bằng cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn glycine và proline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), tương ứng, và được biểu thị bằng mg/g trọng lượng tươi.
Để xác định hoạt tính enzym của các enzym chống oxy hóa, khoảng 500 mg mô đồng nhất được chiết xuất với 3 ml dung dịch đệm Tris 50 mM (pH 7,8) chứa 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) và 7,5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ly tâm ở 10.000 × g trong 20 phút ở nhiệt độ lạnh (4 °C), và thu thập phần dịch nổi (chiết xuất enzym thô) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Sau đó, catalase (CAT) được cho phản ứng với 2 ml dung dịch đệm natri photphat 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) và 100 μl dung dịch H2O2 269 mM để xác định hoạt tính enzym của nó theo phương pháp của Aebi (1984) với một số sửa đổi nhỏ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Hoạt tính enzym peroxidase phụ thuộc guaiacol (POX) được xác định bằng phương pháp của Harrach et al. (2009). (2008) với một số sửa đổi nhỏ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) và hoạt tính enzym của polyphenol oxidase (PPO) được xác định sau phản ứng với 2,2 ml dung dịch đệm natri phosphat 100 mM (pH 6,0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) và 100 μl H2O2 12 mM. Phương pháp này được sửa đổi một chút từ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Thử nghiệm được thực hiện sau phản ứng với 3 ml dung dịch catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) được pha chế mới trong dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 6,0). Hoạt tính CAT được đo bằng cách theo dõi sự phân hủy H2O2 ở bước sóng 240 nm (A240), hoạt tính POX được đo bằng cách theo dõi sự tăng độ hấp thụ ở bước sóng 436 nm (A436), và hoạt tính PPO được đo bằng cách ghi lại sự biến động độ hấp thụ ở bước sóng 495 nm (A495) mỗi 30 giây trong 3 phút bằng máy quang phổ UV-160A (Shimadzu, Nhật Bản).
Phương pháp RT-PCR thời gian thực được sử dụng để phát hiện mức độ biểu hiện của ba gen liên quan đến chất chống oxy hóa, bao gồm catalase peroxisomal (PvCAT1; Mã số truy cập GenBank KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; Mã số truy cập GenBank XM_068639556.1) và glutathione reductase (PvGR; Mã số truy cập GenBank KY195009.1), trong lá đậu (lá thứ hai và thứ ba phát triển hoàn toàn từ ngọn) 72 giờ sau lần xử lý cuối cùng. Tóm lại, RNA được phân lập bằng Bộ kit chiết xuất tổng RNA Simply P (Mã số BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, cDNA được tổng hợp bằng Bộ kit tổng hợp cDNA TOP script™ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trình tự mồi của ba gen trên được liệt kê trong Bảng bổ sung S3. Gen PvActin-3 (số hiệu truy cập GenBank: XM_068616709.1) được sử dụng làm gen nội chuẩn và biểu hiện gen tương đối được tính toán bằng phương pháp 2-ΔΔCT (Livak và Schmittgen, 2001). Tính ổn định của actin dưới tác động của stress sinh học (tương tác không tương thích giữa các cây họ đậu thông thường và nấm gây bệnh thán thư Colletotrichum lindemuthianum) và stress phi sinh học (hạn hán, độ mặn, nhiệt độ thấp) đã được chứng minh (Borges et al., 2012).
Ban đầu, chúng tôi đã thực hiện phân tích trên máy tính toàn bộ hệ gen của protein oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) trong S. sclerotiorum bằng công cụ BLAST protein-protein (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Tóm lại, chúng tôi đã sử dụng OAH từ Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; mã định danh: 1191702; số hiệu truy cập GenBank XP_040799428.1; 342 axit amin) và Penicillium lagena (PlOAH; mã định danh: 94218; số hiệu truy cập GenBank XP_056833920.1; 316 axit amin) làm chuỗi truy vấn để lập bản đồ protein tương đồng trong S. sclerotiorum (mã định danh: 5180). BLASTp được thực hiện so sánh với dữ liệu bộ gen S. sclerotiorum mới nhất hiện có trong GenBank trên trang web của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ngoài ra, gen OAH dự đoán từ S. sclerotiorum (SsOAH) và phân tích tiến hóa cũng như cây phát sinh chủng loại của AfOAH từ A. fijiensis CBS 313.89 và PlOAH từ P. lagena được suy luận bằng phương pháp xác suất tối đa trong MEGA11 (Tamura et al., 2021) và mô hình dựa trên ma trận JTT (Jones et al., 1992). Cây phát sinh chủng loại được kết hợp với phân tích căn chỉnh đa trình tự protein của tất cả các gen OAH dự đoán (SsOAH) từ S. sclerotiorum và trình tự truy vấn bằng cách sử dụng Công cụ căn chỉnh dựa trên ràng buộc (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos và Agarwala, 2007). Ngoài ra, các trình tự axit amin phù hợp nhất của SsOAH từ S. sclerotiorum đã được căn chỉnh với các trình tự truy vấn (AfOAH và PlOAH) (Larkin et al., 2007) bằng cách sử dụng ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), và các vùng bảo tồn trong sự căn chỉnh đã được hiển thị bằng công cụ ESPript (phiên bản 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Hơn nữa, các miền đại diện chức năng dự đoán và các vị trí bảo tồn của S. sclerotiorum SsOAH đã được phân loại tương tác thành các họ khác nhau bằng công cụ InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Cuối cùng, mô hình cấu trúc ba chiều (3D) của S. sclerotiorum SsOAH dự đoán đã được thực hiện bằng cách sử dụng Công cụ Nhận dạng Tương đồng/Song song Protein (máy chủ Phyre2 phiên bản 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) và được xác thực bằng máy chủ SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Các cấu trúc ba chiều dự đoán (định dạng PDB) được trực quan hóa tương tác bằng cách sử dụng gói UCSF-Chimera (phiên bản 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Phương pháp PCR huỳnh quang định lượng thời gian thực được sử dụng để xác định mức độ phiên mã của oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; số hiệu truy cập GenBank: XM_001590428.1) trong sợi nấm Sclerotinia sclerotiorum. Tóm lại, S. sclerotiorum được cấy vào bình chứa PDB và đặt trong tủ ấm lắc (mẫu: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ở 25 ± 2 °C trong 24 giờ với tốc độ 150 vòng/phút và trong bóng tối liên tục (24 giờ) để kích thích sự phát triển của sợi nấm. Sau đó, các tế bào được xử lý bằng L-ornithine và thuốc diệt nấm Rizolex-T ở nồng độ IC50 cuối cùng (khoảng 40 và 3,2 mg/L, tương ứng) và sau đó được nuôi cấy thêm 24 giờ trong cùng điều kiện. Sau khi ủ, các mẫu nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút và dịch nổi (sợi nấm) được thu thập để phân tích biểu hiện gen. Tương tự, sợi nấm được thu thập ở các thời điểm 0, 24, 48, 72, 96 và 120 giờ sau khi nhiễm bệnh từ các cây bị nhiễm bệnh đã hình thành nấm mốc trắng và sợi nấm dạng bông trên bề mặt mô bị nhiễm bệnh. RNA được chiết xuất từ ​​sợi nấm và sau đó cDNA được tổng hợp như mô tả ở trên. Trình tự mồi cho SsOAH được liệt kê trong Bảng bổ sung S3. SsActin (số hiệu truy cập GenBank: XM_001589919.1) được sử dụng làm gen nội chuẩn, và biểu hiện gen tương đối được tính toán bằng phương pháp 2-ΔΔCT (Livak và Schmittgen, 2001).
Axit oxalic được xác định trong môi trường canh thang khoai tây dextrose (PDB) và các mẫu thực vật chứa tác nhân gây bệnh nấm Sclerotinia sclerotiorum theo phương pháp của Xu và Zhang (2000) với một số sửa đổi nhỏ. Tóm lại, các chủng S. sclerotiorum được cấy vào bình chứa PDB và sau đó được nuôi cấy trong tủ ấm lắc (mẫu I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ở tốc độ 150 vòng/phút ở 25 ± 2 °C trong 3–5 ngày trong bóng tối liên tục (24 giờ) để kích thích sự phát triển của sợi nấm. Sau khi ủ, dịch nuôi cấy nấm được lọc qua giấy lọc Whatman #1 và sau đó ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ sợi nấm còn sót lại. Phần dịch nổi được thu thập và bảo quản ở 4°C để xác định định lượng oxalate sau này. Để chuẩn bị mẫu thực vật, khoảng 0,1 g mảnh mô thực vật được chiết xuất ba lần với nước cất (mỗi lần 2 ml). Các mẫu sau đó được ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút, phần dịch nổi được lọc khô qua giấy lọc Whatman số 1 và thu thập để phân tích tiếp.
Để phân tích định lượng axit oxalic, hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống nghiệm có nút đậy bằng thủy tinh theo thứ tự sau: 0,2 ml mẫu (hoặc dịch lọc nuôi cấy PDB hoặc dung dịch chuẩn axit oxalic), 0,11 ml bromophenol xanh (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml axit sulfuric 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Ai Cập) và 0,176 ml kali dicromat 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), sau đó pha loãng dung dịch đến 4,8 ml bằng nước cất, khuấy đều và ngay lập tức đặt vào bể nước ở 60 °C. Sau 10 phút, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH; 0,75 M). Độ hấp thụ (A600) của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 600 nm bằng máy quang phổ UV-160 (Shimadzu Corporation, Nhật Bản). Môi trường PDB và nước cất được sử dụng làm đối chứng để định lượng dịch lọc nuôi cấy và mẫu thực vật tương ứng. Nồng độ axit oxalic trong dịch lọc nuôi cấy, được biểu thị bằng microgam axit oxalic trên mililit môi trường PDB (μg.mL−1), và trong dịch chiết lá, được biểu thị bằng microgam axit oxalic trên gam trọng lượng tươi (μg.g−1 FW), được xác định bằng cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn axit oxalic (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, Hoa Kỳ).
Trong suốt quá trình nghiên cứu, tất cả các thí nghiệm đều được thiết kế theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD) với sáu lần lặp sinh học cho mỗi nghiệm thức và năm chậu cho mỗi lần lặp sinh học (hai cây mỗi chậu), trừ khi có quy định khác. Các lần lặp sinh học được phân tích lặp lại hai lần (hai lần lặp kỹ thuật). Các lần lặp kỹ thuật được sử dụng để kiểm tra khả năng tái lập của cùng một thí nghiệm nhưng không được sử dụng trong phân tích thống kê để tránh các lần lặp sai lệch. Dữ liệu được phân tích thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) tiếp theo là kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa trung thực Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0,05). Đối với các thí nghiệm trong ống nghiệm, giá trị IC50 và IC99 được tính toán bằng mô hình probit và khoảng tin cậy 95% được tính toán.
Tổng cộng có bốn chủng phân lập được thu thập từ các cánh đồng đậu nành khác nhau ở tỉnh El Ghabiya, Ai Cập. Trên môi trường PDA, tất cả các chủng phân lập đều tạo ra sợi nấm màu trắng kem, nhanh chóng chuyển sang màu trắng bông (Hình 1A) và sau đó chuyển sang màu be hoặc nâu ở giai đoạn hạch nấm. Hạch nấm thường dày đặc, màu đen, hình cầu hoặc hình dạng bất thường, dài từ 5,2 đến 7,7 mm và đường kính từ 3,4 đến 5,3 mm (Hình 1B). Mặc dù bốn chủng phân lập đều phát triển mô hình hạch nấm ở rìa môi trường nuôi cấy sau 10-12 ngày ủ ở 25 ± 2 °C (Hình 1A), số lượng hạch nấm trên mỗi đĩa khác nhau đáng kể giữa chúng (P < 0,001), với chủng phân lập số 3 có số lượng hạch nấm cao nhất (32,33 ± 1,53 hạch nấm trên mỗi đĩa; Hình 1C). Tương tự, chủng phân lập #3 tạo ra nhiều axit oxalic hơn trong môi trường PDB so với các chủng phân lập khác (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Hình 1D). Chủng phân lập #3 cho thấy các đặc điểm hình thái và vi thể điển hình của nấm gây bệnh thực vật Sclerotinia sclerotiorum. Ví dụ, trên môi trường PDA, khuẩn lạc của chủng phân lập #3 phát triển nhanh, có màu trắng kem (Hình 1A), màu be ngược hoặc vàng nâu nhạt, và cần 6-7 ngày ở 25 ± 2°C để phủ kín hoàn toàn bề mặt đĩa đường kính 9 cm. Dựa trên các đặc điểm hình thái và vi thể nêu trên, chủng phân lập #3 được xác định là Sclerotinia sclerotiorum.
Hình 1. Đặc điểm và khả năng gây bệnh của các chủng S. sclerotiorum phân lập từ các cây họ đậu phổ biến. (A) Sự phát triển sợi nấm của bốn chủng S. sclerotiorum trên môi trường PDA, (B) thể hạch của bốn chủng S. sclerotiorum, (C) số lượng thể hạch (trên mỗi đĩa), (D) sự tiết axit oxalic trên môi trường PDB (μg.mL−1), và (E) mức độ nghiêm trọng của bệnh (%) của bốn chủng S. sclerotiorum trên giống cây họ đậu thương mại mẫn cảm Giza 3 trong điều kiện nhà kính. Các giá trị biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của năm lần lặp lại sinh học (n = 5). Các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (p < 0,05). (F–H) Các triệu chứng mốc trắng điển hình xuất hiện trên thân cây và quả, tương ứng, 10 ngày sau khi cấy chủng số 3 (dpi). (I) Phân tích tiến hóa vùng trình tự phiên mã nội bộ (ITS) của chủng S. sclerotiorum phân lập số 3 được thực hiện bằng phương pháp xác suất tối đa và so sánh với 20 chủng/mẫu tham chiếu thu được từ cơ sở dữ liệu của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Các số phía trên các đường phân cụm biểu thị độ phủ vùng (%), và các số phía dưới các đường phân cụm biểu thị chiều dài nhánh.
Hơn nữa, để xác nhận khả năng gây bệnh, bốn chủng S. sclerotiorum thu được đã được sử dụng để gây nhiễm cho giống đậu thương mại mẫn cảm Giza 3 trong điều kiện nhà kính, phù hợp với định đề Koch (Hình 1E). Mặc dù tất cả các chủng nấm thu được đều có khả năng gây bệnh và có thể lây nhiễm đậu xanh (giống Giza 3), gây ra các triệu chứng mốc trắng điển hình trên tất cả các bộ phận trên mặt đất (Hình 1F), đặc biệt là trên thân (Hình 1G) và quả (Hình 1H) sau 10 ngày gây nhiễm (dpi), chủng 3 là chủng gây bệnh mạnh nhất trong hai thí nghiệm độc lập. Chủng 3 có mức độ bệnh nặng nhất (%) trên cây đậu (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 và 76,7 ± 3,1 lần lượt sau 7, 14 và 21 ngày nhiễm bệnh; Hình 1F).
Việc xác định chủng S. sclerotiorum xâm lấn nhất số 3 đã được khẳng định thêm dựa trên trình tự vùng phiên mã nội bộ (ITS) (Hình 1I). Phân tích phát sinh chủng loại giữa chủng số 3 và 20 chủng/mẫu tham chiếu cho thấy độ tương đồng cao (>99%) giữa chúng. Điều đáng chú ý là chủng S. sclerotiorum số 3 (533 bp) có độ tương đồng cao với chủng S. sclerotiorum LPM36 của Mỹ được phân lập từ hạt đậu khô (số hiệu truy cập GenBank MK896659.1; 540 bp) và chủng S. sclerotiorum YKY211 của Trung Quốc (số hiệu truy cập GenBank OR206374.1; 548 bp), gây bệnh thối thân tím (Matthiola incana), tất cả đều được nhóm riêng biệt ở đầu biểu đồ cây (Hình 1I). Trình tự mới đã được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu NCBI và được đặt tên là “Sclerotinia sclerotiorum – chủng YN-25” (số hiệu truy cập GenBank PV202792). Có thể thấy rằng chủng 3 là chủng xâm lấn mạnh nhất; do đó, chủng này đã được chọn để nghiên cứu trong tất cả các thí nghiệm tiếp theo.
Hoạt tính kháng khuẩn của diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Đức) ở các nồng độ khác nhau (12,5, 25, 50, 75, 100 và 125 mg/L) chống lại chủng S. sclerotiorum phân lập 3 đã được nghiên cứu trong ống nghiệm. Điều đáng chú ý là L-ornithine thể hiện tác dụng kháng khuẩn và ức chế dần sự phát triển theo chiều bán kính của sợi nấm S. sclerotiorum theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Hình 2A, B). Ở nồng độ cao nhất được thử nghiệm (125 mg/L), L-ornithine cho thấy tỷ lệ ức chế sự phát triển sợi nấm cao nhất (99,62 ± 0,27%; Hình 2B), tương đương với thuốc diệt nấm thương mại Rizolex-T (tỷ lệ ức chế 99,45 ± 0,39%; Hình 2C) ở nồng độ cao nhất được thử nghiệm (10 mg/L), cho thấy hiệu quả tương tự.
Hình 2. Hoạt tính kháng khuẩn in vitro của L-ornithine chống lại Sclerotinia sclerotiorum. (A) So sánh hoạt tính kháng khuẩn của các nồng độ L-ornithine khác nhau chống lại S. sclerotiorum với thuốc diệt nấm thương mại Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tỷ lệ ức chế (%) sự phát triển sợi nấm S. sclerotiorum sau khi xử lý với các nồng độ L-ornithine khác nhau (12,5, 25, 50, 75, 100 và 125 mg/L) hoặc Rizolex-T (2, 4, 6, 8 và 10 mg/L), tương ứng. Các giá trị biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của năm lần lặp lại sinh học (n = 5). Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt thống kê giữa các phương pháp điều trị (p < 0,05). (D, E) Phân tích hồi quy mô hình Probit của L-ornithine và thuốc diệt nấm thương mại Rizolex-T, tương ứng. Đường hồi quy của mô hình probit được thể hiện bằng đường màu xanh liền nét, và khoảng tin cậy (95%) được thể hiện bằng đường màu đỏ đứt nét.
Ngoài ra, phân tích hồi quy probit đã được thực hiện và các biểu đồ tương ứng được hiển thị trong Bảng 1 và Hình 2D, E. Tóm lại, giá trị độ dốc chấp nhận được (y = 2,92x − 4,67) và các thống kê có ý nghĩa liên quan (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 và p < 0,0001; Hình 2D) của L-ornithine cho thấy hoạt tính kháng nấm được tăng cường chống lại S. sclerotiorum so với thuốc diệt nấm thương mại Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 và p < 0,0001) (Bảng 1).
Bảng 1. Giá trị nồng độ ức chế bán tối đa (IC50) và IC99 (mg/l) của L-ornithine và thuốc diệt nấm thương mại “Rizolex-T” đối với S. sclerotiorum.
Nhìn chung, L-ornithine (250 mg/L) đã làm giảm đáng kể sự phát triển và mức độ nghiêm trọng của bệnh mốc trắng trên cây đậu tương được xử lý so với cây bị nhiễm S. sclerotiorum không được xử lý (đối chứng; Hình 3A). Tóm lại, mặc dù mức độ nghiêm trọng của bệnh ở cây đối chứng bị nhiễm bệnh không được xử lý tăng dần (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 và 92,33 ± 3,06%), L-ornithine đã làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh (%) trong suốt thí nghiệm (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 và 26,36 ± 3,07) lần lượt vào các ngày thứ 7, 14 và 21 sau khi xử lý (dpt) (Hình 3A). Tương tự, khi cây đậu bị nhiễm S. sclerotiorum được xử lý bằng 250 mg/L L-ornithine, diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) giảm từ 1274,33 ± 33,13 ở nhóm đối chứng không được xử lý xuống còn 281,03 ± 7,95, thấp hơn một chút so với nhóm đối chứng dương sử dụng thuốc diệt nấm Rizolex-T 50 mg/L (183,61 ± 7,71; Hình 3B). Xu hướng tương tự cũng được quan sát thấy trong thí nghiệm thứ hai.
Hình 3. Ảnh hưởng của việc bón L-ornithine ngoại sinh đến sự phát triển bệnh thối trắng đậu tương do nấm Sclerotinia sclerotiorum gây ra trong điều kiện nhà kính. (A) Đường cong tiến triển bệnh thối trắng đậu tương sau khi xử lý với 250 mg/L L-ornithine. (B) Diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) của bệnh thối trắng đậu tương sau khi xử lý với L-ornithine. Các giá trị biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của năm lần lặp lại sinh học (n = 5). Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các phương pháp xử lý (p < 0,05).
Việc bón bổ sung L-ornithine 250 mg/L làm tăng dần chiều cao cây (Hình 4A), số cành trên mỗi cây (Hình 4B) và số lá trên mỗi cây (Hình 4C) sau 42 ngày. Trong khi thuốc diệt nấm thương mại Rizolex-T (50 mg/L) có tác dụng mạnh nhất đối với tất cả các thông số dinh dưỡng được nghiên cứu, thì việc bón bổ sung L-ornithine 250 mg/L có tác dụng mạnh thứ hai so với nhóm đối chứng không được xử lý (Hình 4A–C). Mặt khác, việc xử lý bằng L-ornithine không có tác động đáng kể đến hàm lượng sắc tố quang hợp chlorophyll a (Hình 4D) và chlorophyll b (Hình 4E), nhưng làm tăng nhẹ tổng hàm lượng carotenoid (0,56 ± 0,03 mg/g trọng lượng tươi) so với nhóm đối chứng âm tính (0,44 ± 0,02 mg/g trọng lượng tươi) và nhóm đối chứng dương tính (0,46 ± 0,02 mg/g trọng lượng tươi; Hình 4F). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy L-ornithine không gây độc cho cây họ đậu được xử lý và thậm chí có thể kích thích sự sinh trưởng của chúng.
Hình 4. Ảnh hưởng của việc bón L-ornithine ngoại sinh đến đặc điểm sinh trưởng và sắc tố quang hợp của lá đậu bị nhiễm Sclerotinia sclerotiorum trong điều kiện nhà kính. (A) Chiều cao cây (cm), (B) Số cành trên mỗi cây, (C) Số lá trên mỗi cây, (D) Hàm lượng diệp lục a (mg g-1 trọng lượng tươi), (E) Hàm lượng diệp lục b (mg g-1 trọng lượng tươi), (F) Tổng hàm lượng carotenoid (mg g-1 trọng lượng tươi). Các giá trị là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của năm lần lặp lại sinh học (n = 5). Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (p < 0,05).
Định vị mô học tại chỗ của các loài oxy phản ứng (ROS; biểu thị dưới dạng hydro peroxide [H2O2]) và các gốc tự do (biểu thị dưới dạng anion superoxide [O2•−]) cho thấy rằng việc bón L-ornithine ngoại sinh (250 mg/L) đã làm giảm đáng kể sự tích lũy H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Hình 5A) và O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Hình 5B) so với sự tích lũy của cả cây bị nhiễm bệnh không được xử lý (lần lượt là 173,31 ± 12,06 và 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) và cây được xử lý với 50 mg/L thuốc diệt nấm thương mại Rizolex-T (170,12 ± 9,50 và 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 trọng lượng tươi, tương ứng) sau 72 giờ. Nồng độ H2O2 và O2•− tích lũy cao dưới tác động của hpt (Hình 5A, B). Tương tự, xét nghiệm malondialdehyde (MDA) dựa trên TCA cho thấy cây đậu bị nhiễm S. sclerotiorum tích lũy MDA ở mức cao hơn (113,48 ± 10,02 nmol.g trọng lượng tươi) trong lá (Hình 5C). Tuy nhiên, việc bổ sung L-ornithine từ bên ngoài đã làm giảm đáng kể quá trình peroxy hóa lipid, được thể hiện bằng sự giảm hàm lượng MDA trong cây được xử lý (33,08 ± 4,00 nmol.g trọng lượng tươi).
Hình 5. Tác dụng của việc bổ sung L-ornithine ngoại sinh lên các chỉ số chính của stress oxy hóa và cơ chế bảo vệ chống oxy hóa không enzyme trong lá đậu bị nhiễm S. sclerotiorum sau 72 giờ nhiễm bệnh trong điều kiện nhà kính. (A) Hydrogen peroxide (H2O2; nmol g−1 FW) ở 72 hpt, (B) anion superoxide (O2•−; nmol g−1 FW) ở 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) ở 72 hpt, (D) tổng phenol hòa tan (mg GAE g−1 FW) ở 72 hpt, (E) tổng flavonoid hòa tan (mg RE g−1 FW) ở 72 hpt, (F) tổng axit amin tự do (mg g−1 FW) ở 72 hpt, và (G) hàm lượng proline (mg g−1 FW) ở 72 hpt. Các giá trị biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (mean ± SD) của 5 lần lặp lại sinh học (n = 5). Các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các phương pháp xử lý (p < 0,05).