Các lý thuyết phòng vệ thực vật khác nhau cung cấp hướng dẫn lý thuyết quan trọng để giải thích các mô hình chuyển hóa chuyên biệt của thực vật, nhưng các dự đoán chính của chúng vẫn cần được kiểm chứng. Ở đây, chúng tôi đã sử dụng phân tích khối phổ song song không thiên vị (MS/MS) để khám phá một cách có hệ thống hệ thống chuyển hóa của các chủng thuốc lá suy yếu từ cây riêng lẻ đến quần thể và các loài có quan hệ gần gũi, và xử lý một lượng lớn các lý thuyết đặc điểm khối phổ dựa trên phổ hợp chất trong khung thông tin để kiểm tra các dự đoán chính của lý thuyết phòng vệ tối ưu (OD) và lý thuyết mục tiêu di động (MT). Thành phần thông tin của chuyển hóa thực vật phù hợp với lý thuyết OD, nhưng mâu thuẫn với dự đoán chính của lý thuyết MT về động lực chuyển hóa do động vật ăn cỏ gây ra. Từ quy mô tiến hóa vi mô đến vĩ mô, tín hiệu jasmonate được xác định là yếu tố quyết định chính của OD, trong khi tín hiệu ethylene cung cấp sự điều chỉnh tinh tế cho phản ứng đặc hiệu với động vật ăn cỏ được chú thích bởi mạng lưới phân tử MS/MS.
Các chất chuyển hóa đặc biệt với cấu trúc đa dạng là những thành phần chính tham gia vào quá trình thích nghi của thực vật với môi trường, đặc biệt là trong việc phòng vệ chống lại kẻ thù (1). Sự đa dạng đáng kinh ngạc của quá trình chuyển hóa đặc biệt được tìm thấy ở thực vật đã thúc đẩy hàng thập kỷ nghiên cứu chuyên sâu về nhiều khía cạnh chức năng sinh thái của nó, và đã hình thành nên một danh sách dài các lý thuyết phòng vệ của thực vật, đó là sự phát triển tiến hóa và sinh thái của tương tác giữa thực vật và côn trùng. Nghiên cứu thực nghiệm cung cấp hướng dẫn quan trọng (2). Tuy nhiên, những lý thuyết phòng vệ của thực vật này đã không tuân theo con đường chuẩn mực của lý luận suy diễn giả thuyết, trong đó các dự đoán chính ở cùng một mức độ phân tích (3) và được kiểm nghiệm thực nghiệm để thúc đẩy chu kỳ phát triển lý thuyết tiếp theo (4). Những hạn chế về kỹ thuật hạn chế việc thu thập dữ liệu đối với các loại chuyển hóa cụ thể và loại trừ phân tích toàn diện các chất chuyển hóa chuyên biệt, do đó ngăn cản việc so sánh giữa các loại, điều cần thiết cho sự phát triển lý thuyết (5). Việc thiếu dữ liệu chuyển hóa học toàn diện và một đơn vị chung để so sánh quy trình xử lý không gian chuyển hóa giữa các nhóm thực vật khác nhau cản trở sự trưởng thành khoa học của lĩnh vực này.
Những phát triển mới nhất trong lĩnh vực chuyển hóa học bằng phương pháp khối phổ song song (MS/MS) có thể mô tả toàn diện các thay đổi chuyển hóa trong và giữa các loài của một nhánh hệ thống nhất định, và có thể được kết hợp với các phương pháp tính toán để tính toán sự tương đồng về cấu trúc giữa các hỗn hợp phức tạp này. Kiến thức trước đó về hóa học (5). Sự kết hợp của các công nghệ tiên tiến trong phân tích và tính toán cung cấp một khuôn khổ cần thiết cho việc kiểm tra lâu dài nhiều dự đoán được đưa ra bởi các lý thuyết sinh thái và tiến hóa về sự đa dạng chuyển hóa. Shannon (6) đã giới thiệu lý thuyết thông tin lần đầu tiên trong bài báo quan trọng của ông vào năm 1948, đặt nền tảng cho việc phân tích toán học thông tin, đã được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác ngoài ứng dụng ban đầu của nó. Trong hệ gen học, lý thuyết thông tin đã được áp dụng thành công để định lượng thông tin bảo tồn trình tự (7). Trong nghiên cứu phiên mã học, lý thuyết thông tin phân tích những thay đổi tổng thể trong phiên mã (8). Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã áp dụng khuôn khổ thống kê của lý thuyết thông tin vào chuyển hóa học để mô tả chuyên môn chuyển hóa ở cấp độ mô trong thực vật (9). Ở đây, chúng tôi kết hợp quy trình làm việc dựa trên MS/MS với khung thống kê của lý thuyết thông tin, đặc trưng bởi sự đa dạng trao đổi chất trong đơn vị tiền tệ chung, để so sánh các dự đoán chính của lý thuyết phòng vệ thực vật về hệ thống trao đổi chất được tạo ra bởi động vật ăn cỏ.
Các khung lý thuyết về phòng vệ thực vật thường bao hàm lẫn nhau và có thể được chia thành hai loại: những khung lý thuyết cố gắng giải thích sự phân bố các chất chuyển hóa đặc hiệu của thực vật dựa trên các chức năng phòng vệ, chẳng hạn như phòng vệ tối ưu (OD) (10), mục tiêu di động (MT) (11) và lý thuyết xuất hiện (12), trong khi những khung lý thuyết khác tìm kiếm các giải thích cơ học về cách thay đổi về nguồn tài nguyên sẵn có ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật và sự tích lũy các chất chuyển hóa chuyên biệt, chẳng hạn như giả thuyết cân bằng carbon: chất dinh dưỡng (13), giả thuyết tốc độ tăng trưởng (14) và giả thuyết cân bằng tăng trưởng và phân hóa (15). Hai nhóm lý thuyết này ở các cấp độ phân tích khác nhau (4). Tuy nhiên, hai lý thuyết liên quan đến các chức năng phòng vệ ở cấp độ chức năng chi phối cuộc thảo luận về phòng vệ cấu thành và cảm ứng của thực vật: lý thuyết OD, giả định rằng thực vật chỉ đầu tư vào các biện pháp phòng vệ hóa học đắt tiền của chúng khi cần thiết, ví dụ, khi chúng bị động vật ăn cỏ tấn công, do đó, tùy thuộc vào khả năng tấn công trong tương lai, hợp chất có chức năng phòng vệ sẽ được chỉ định (10); Giả thuyết MT đề xuất rằng không có trục thay đổi chất chuyển hóa theo hướng nhất định, mà chất chuyển hóa thay đổi ngẫu nhiên, do đó tạo ra khả năng cản trở “mục tiêu chuyển động” chuyển hóa của động vật ăn cỏ tấn công. Nói cách khác, hai lý thuyết này đưa ra những dự đoán trái ngược nhau về sự tái cấu trúc chuyển hóa xảy ra sau cuộc tấn công của động vật ăn cỏ: mối quan hệ giữa sự tích lũy chất chuyển hóa theo một hướng có chức năng phòng thủ (OD) và những thay đổi chuyển hóa không định hướng (MT) (11).
Các giả thuyết OD và MT không chỉ liên quan đến những thay đổi được tạo ra trong hệ thống chuyển hóa, mà còn cả những hậu quả sinh thái và tiến hóa của sự tích lũy các chất chuyển hóa này, chẳng hạn như chi phí và lợi ích thích ứng của những thay đổi chuyển hóa này trong một môi trường sinh thái cụ thể (16). Mặc dù cả hai giả thuyết đều công nhận chức năng phòng vệ của các chất chuyển hóa chuyên biệt, có thể tốn kém hoặc không, nhưng dự đoán quan trọng phân biệt các giả thuyết OD và MT nằm ở hướng của những thay đổi chuyển hóa được tạo ra. Dự đoán của lý thuyết OD cho đến nay đã nhận được nhiều sự chú ý về mặt thực nghiệm nhất. Các thử nghiệm này bao gồm nghiên cứu các chức năng phòng vệ trực tiếp hoặc gián tiếp của các mô khác nhau của các hợp chất cụ thể trong nhà kính và điều kiện tự nhiên, cũng như những thay đổi trong giai đoạn phát triển của cây trồng (17-19). Tuy nhiên, cho đến nay, do thiếu quy trình làm việc và khung thống kê để phân tích toàn diện sự đa dạng chuyển hóa của bất kỳ sinh vật nào, dự đoán khác biệt chính giữa hai lý thuyết (tức là hướng của những thay đổi chuyển hóa) vẫn chưa được kiểm chứng. Ở đây, chúng tôi cung cấp một phân tích như vậy.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của các chất chuyển hóa đặc trưng của thực vật là sự đa dạng cấu trúc cực kỳ phong phú ở mọi cấp độ, từ cây đơn lẻ, quần thể đến các loài tương tự (20). Nhiều thay đổi định lượng trong các chất chuyển hóa chuyên biệt có thể được quan sát ở quy mô quần thể, trong khi sự khác biệt về chất lượng mạnh mẽ thường được duy trì ở cấp độ loài (20). Do đó, sự đa dạng chuyển hóa của thực vật là khía cạnh chính của sự đa dạng chức năng, phản ánh khả năng thích nghi với các hốc sinh thái khác nhau, đặc biệt là những hốc sinh thái có khả năng xâm nhập khác nhau bởi các loài côn trùng đặc biệt và động vật ăn cỏ phổ biến (21). Kể từ bài báo đột phá của Fraenkel (22) về lý do tồn tại của các chất chuyển hóa đặc trưng của thực vật, sự tương tác với các loài côn trùng khác nhau đã được coi là áp lực chọn lọc quan trọng, và những tương tác này được cho là đã định hình thực vật trong quá trình tiến hóa. Con đường chuyển hóa (23). Sự khác biệt giữa các loài về sự đa dạng của các chất chuyển hóa chuyên biệt cũng có thể phản ánh sự cân bằng sinh lý liên quan đến cơ chế phòng vệ của thực vật chống lại các chiến lược ăn cỏ, vì hai loài thường có tương quan nghịch với nhau (24). Mặc dù việc duy trì khả năng phòng thủ tốt mọi lúc có thể mang lại lợi ích, nhưng những thay đổi chuyển hóa kịp thời liên quan đến phòng thủ mang lại lợi ích rõ ràng, cho phép thực vật phân bổ nguồn lực quý giá cho các khoản đầu tư sinh lý khác (19, 24) và tránh được sự cần thiết phải cộng sinh. Thiệt hại ngoài dự kiến ​​(25). Ngoài ra, những sự tái tổ chức các chất chuyển hóa chuyên biệt do côn trùng ăn thực vật gây ra có thể dẫn đến sự phân bố phá hoại trong quần thể (26) và có thể phản ánh trực tiếp những thay đổi tự nhiên đáng kể trong tín hiệu axit jasmonic (JA), có thể được duy trì trong quần thể. Tín hiệu JA cao và thấp là sự đánh đổi giữa việc phòng thủ chống lại động vật ăn thực vật và cạnh tranh với các loài cụ thể (27). Thêm vào đó, các con đường sinh tổng hợp chất chuyển hóa chuyên biệt sẽ trải qua quá trình mất mát và biến đổi nhanh chóng trong quá trình tiến hóa, dẫn đến sự phân bố chuyển hóa không đồng đều giữa các loài có quan hệ gần gũi (28). Những đa hình này có thể được thiết lập nhanh chóng để đáp ứng với sự thay đổi mô hình ăn thực vật (29), điều đó có nghĩa là sự biến động của cộng đồng động vật ăn thực vật là yếu tố chính thúc đẩy tính không đồng nhất về chuyển hóa.
Tại đây, chúng tôi đã giải quyết cụ thể các vấn đề sau: (I) Côn trùng ăn thực vật tái cấu hình hệ thống trao đổi chất của thực vật như thế nào? (II) Các thành phần thông tin chính của tính dẻo dai trao đổi chất có thể định lượng được để kiểm tra các dự đoán của lý thuyết phòng vệ dài hạn là gì? (III) Liệu có nên lập trình lại hệ thống trao đổi chất của thực vật theo cách riêng biệt cho kẻ tấn công hay không, nếu có, hormone thực vật đóng vai trò gì trong việc điều chỉnh phản ứng trao đổi chất cụ thể, và những chất chuyển hóa nào góp phần vào tính đặc hiệu loài của cơ chế phòng vệ? (IV) Vì các dự đoán được đưa ra bởi nhiều lý thuyết phòng vệ có thể được mở rộng trên tất cả các cấp độ mô sinh học, chúng tôi đặt câu hỏi về tính nhất quán của phản ứng trao đổi chất gây ra khi so sánh nội bộ với so sánh giữa các loài? Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã nghiên cứu một cách có hệ thống hệ thống chuyển hóa chất trong lá cây thuốc lá, một loài thực vật mô hình sinh thái với quá trình chuyển hóa chuyên biệt phong phú, và có hiệu quả chống lại ấu trùng của hai loài động vật ăn cỏ bản địa, Lepidoptera Datura (Ms) (rất hung dữ, chủ yếu ăn cây họ Solanaceae) và Spodoptera littoralis (Sl), sâu ăn lá bông là một loại “chi”, với cây chủ là họ Solanaceae và các cây chủ khác thuộc các chi và họ thực vật khác. Chúng tôi đã phân tích phổ chuyển hóa MS/MS và trích xuất các mô tả thống kê lý thuyết thông tin để so sánh các lý thuyết OD và MT. Tạo bản đồ đặc hiệu để tiết lộ danh tính của các chất chuyển hóa chính. Phân tích được mở rộng đến quần thể bản địa của N. nasi và các loài thuốc lá có quan hệ gần gũi để phân tích sâu hơn mối tương quan giữa tín hiệu hormone thực vật và sự cảm ứng OD.
Để nắm bắt bản đồ tổng thể về tính dẻo dai và cấu trúc của hệ chuyển hóa lá của cây thuốc lá ăn cỏ, chúng tôi đã sử dụng quy trình phân tích và tính toán được phát triển trước đó để thu thập và phân tích toàn diện dữ liệu độ phân giải cao độc lập phổ MS/MS từ chiết xuất thực vật (9). Phương pháp không phân biệt này (gọi là MS/MS) có thể xây dựng phổ hợp chất không trùng lặp, sau đó có thể được sử dụng cho tất cả các phân tích cấp độ hợp chất được mô tả ở đây. Các chất chuyển hóa thực vật được phân tích này thuộc nhiều loại khác nhau, bao gồm hàng trăm đến hàng nghìn chất chuyển hóa (khoảng 500-1000-s/MS/MS ở đây). Ở đây, chúng tôi xem xét tính dẻo dai chuyển hóa trong khuôn khổ lý thuyết thông tin và định lượng sự đa dạng và tính chuyên môn của hệ chuyển hóa dựa trên entropy Shannon của phân bố tần số chuyển hóa. Sử dụng công thức đã được triển khai trước đó (8), chúng tôi đã tính toán một tập hợp các chỉ số có thể được sử dụng để định lượng sự đa dạng của hệ chuyển hóa (chỉ số Hj), tính chuyên môn của hồ sơ chuyển hóa (chỉ số δj) và tính đặc hiệu chuyển hóa của một chất chuyển hóa duy nhất (chỉ số Si). Ngoài ra, chúng tôi đã áp dụng Chỉ số Độ dẻo Khoảng cách Tương đối (RDPI) để định lượng khả năng cảm ứng chuyển hóa của động vật ăn cỏ (Hình 1A) (30). Trong khuôn khổ thống kê này, chúng tôi coi phổ MS/MS là đơn vị thông tin cơ bản và xử lý sự phong phú tương đối của MS/MS thành bản đồ phân bố tần số, sau đó sử dụng entropy Shannon để ước tính sự đa dạng chuyển hóa từ đó. Sự chuyên môn hóa chuyển hóa được đo bằng độ đặc hiệu trung bình của một phổ MS/MS duy nhất. Do đó, sự gia tăng về số lượng của một số lớp MS/MS sau khi cảm ứng bởi động vật ăn cỏ được chuyển đổi thành khả năng cảm ứng phổ, RDPI và sự chuyên môn hóa, tức là sự gia tăng chỉ số δj, bởi vì nhiều chất chuyển hóa chuyên biệt hơn được tạo ra và chỉ số Si cao được tạo ra. Việc giảm chỉ số đa dạng Hj phản ánh rằng số lượng MS/MS được tạo ra bị giảm hoặc phân bố tần số hồ sơ thay đổi theo hướng ít đồng nhất hơn, đồng thời giảm độ không chắc chắn tổng thể của nó. Thông qua việc tính toán chỉ số Si, có thể xác định được MS/MS nào bị kích thích bởi các loài động vật ăn cỏ nhất định, ngược lại, MS/MS nào không phản ứng với sự kích thích đó, đây là một chỉ số quan trọng để phân biệt dự đoán MT và OD.
(A) Các chỉ số thống kê được sử dụng cho dữ liệu MS/MS của động vật ăn cỏ (H1 đến Hx) - khả năng cảm ứng (RDPI), tính đa dạng (chỉ số Hj), tính chuyên biệt (chỉ số δj) và tính đặc hiệu của chất chuyển hóa (chỉ số Si). Sự gia tăng mức độ chuyên biệt (δj) cho thấy, trung bình, sẽ sản sinh ra nhiều chất chuyển hóa đặc trưng cho động vật ăn cỏ hơn, trong khi sự giảm tính đa dạng (Hj) cho thấy sự giảm sản sinh chất chuyển hóa hoặc sự phân bố không đồng đều của chất chuyển hóa trong bản đồ phân bố. Giá trị Si đánh giá xem chất chuyển hóa có đặc trưng cho một điều kiện nhất định (ở đây là động vật ăn cỏ) hay ngược lại được duy trì ở cùng mức độ. (B) Sơ đồ khái niệm về dự đoán lý thuyết phòng vệ sử dụng trục lý thuyết thông tin. Lý thuyết OD dự đoán rằng sự tấn công của động vật ăn cỏ sẽ làm tăng các chất chuyển hóa phòng vệ, do đó làm tăng δj. Đồng thời, Hj giảm vì cấu hình được tổ chức lại theo hướng giảm sự không chắc chắn của thông tin chuyển hóa. Lý thuyết MT dự đoán rằng sự tấn công của động vật ăn cỏ sẽ gây ra những thay đổi không định hướng trong hệ thống chuyển hóa, do đó làm tăng Hj như một chỉ báo về sự gia tăng bất định thông tin chuyển hóa và gây ra sự phân bố ngẫu nhiên của Si. Chúng tôi cũng đề xuất một mô hình hỗn hợp, MT tốt nhất, trong đó một số chất chuyển hóa có giá trị phòng vệ cao hơn sẽ tăng lên đáng kể (giá trị Si cao), trong khi những chất khác thể hiện phản ứng ngẫu nhiên (giá trị Si thấp).
Sử dụng các mô tả lý thuyết thông tin, chúng tôi diễn giải lý thuyết OD để dự đoán rằng những thay đổi chất chuyển hóa đặc biệt do động vật ăn cỏ gây ra trong trạng thái cấu thành không bị kích thích sẽ dẫn đến (i) sự gia tăng tính đặc hiệu chuyển hóa (chỉ số Si) thúc đẩy tính đặc hiệu chuyển hóa (chỉ số δj) của một số nhóm chất chuyển hóa đặc biệt có giá trị phòng vệ cao hơn, và (ii) sự giảm đa dạng chuyển hóa (chỉ số Hj) do sự thay đổi phân bố tần số chuyển hóa theo hướng phân bố leptin nhiều hơn. Ở cấp độ một chất chuyển hóa đơn lẻ, dự kiến ​​sẽ có sự phân bố Si có trật tự, trong đó chất chuyển hóa sẽ làm tăng giá trị Si theo giá trị phòng vệ của nó (Hình 1B). Theo hướng này, chúng tôi giải thích lý thuyết MT để dự đoán rằng sự kích thích sẽ dẫn đến (i) những thay đổi không định hướng trong các chất chuyển hóa dẫn đến sự giảm chỉ số δj, và (ii) sự gia tăng chỉ số Hj do sự gia tăng tính không chắc chắn hoặc ngẫu nhiên trong chuyển hóa, có thể được định lượng bằng entropy Shannon dưới dạng đa dạng tổng quát. Đối với thành phần chuyển hóa, lý thuyết MT sẽ dự đoán sự phân bố ngẫu nhiên của Si. Xét đến việc một số chất chuyển hóa hoạt động trong những điều kiện cụ thể, trong khi những chất khác thì không, và giá trị phòng vệ của chúng phụ thuộc vào môi trường, chúng tôi cũng đề xuất một mô hình phòng vệ hỗn hợp, trong đó δj và Hj được phân bố theo hai hướng dọc theo Si. Sự gia tăng theo mọi hướng, chỉ một số nhóm chất chuyển hóa nhất định, có giá trị phòng vệ cao hơn, sẽ làm tăng Si một cách đặc biệt, trong khi những nhóm khác sẽ có sự phân bố ngẫu nhiên (Hình 1B).
Để kiểm tra dự đoán lý thuyết phòng vệ được định nghĩa lại trên trục mô tả lý thuyết thông tin, chúng tôi đã nuôi ấu trùng ăn lá chuyên biệt (Ms) hoặc ăn tạp (Sl) trên lá cây Nepenthes pallens (Hình 2A). Sử dụng phân tích MS/MS, chúng tôi đã thu được 599 phổ MS/MS không trùng lặp (tệp dữ liệu S1) từ dịch chiết methanol của mô lá thu thập được sau khi sâu bướm ăn. Sử dụng các chỉ số RDPI, Hj và δj để hình dung sự tái cấu hình nội dung thông tin trong các tệp cấu hình MS/MS cho thấy các mô hình thú vị (Hình 2B). Xu hướng tổng thể là, như được mô tả bởi mô tả thông tin, khi sâu bướm tiếp tục ăn lá, mức độ tái tổ chức trao đổi chất tăng lên theo thời gian: 72 giờ sau khi ăn, RDPI tăng lên đáng kể. So với nhóm đối chứng không bị tổn thương, Hj giảm đáng kể, điều này là do mức độ chuyên môn hóa của hồ sơ trao đổi chất tăng lên, được định lượng bằng chỉ số δj. Xu hướng rõ ràng này phù hợp với dự đoán của lý thuyết OD, nhưng không phù hợp với dự đoán chính của lý thuyết MT, lý thuyết này cho rằng những thay đổi ngẫu nhiên (không định hướng) trong mức độ chất chuyển hóa được sử dụng như một cơ chế ngụy trang phòng thủ (Hình 1B). Mặc dù hàm lượng chất kích thích tiết ra từ miệng (OS) và hành vi ăn uống của hai loài động vật ăn cỏ này khác nhau, nhưng việc chúng ăn trực tiếp dẫn đến những thay đổi tương tự về hướng của Hj và δj trong suốt thời gian thu hoạch 24 giờ và 72 giờ. Sự khác biệt duy nhất xảy ra ở thời điểm 72 giờ sau khi bắt đầu thu hoạch (RDPI). So với sự thay đổi do ăn Ms gây ra, sự thay đổi tổng thể do ăn Sl gây ra cao hơn.
(A) Thiết kế thí nghiệm: lợn thông thường (S1) hoặc động vật ăn cỏ chuyên nghiệp (Ms) được cho ăn lá cây nắp ấm đã khử muối, trong khi để mô phỏng việc ăn cỏ, OS của Ms (W + OSMs) được sử dụng để xử lý vết thương do đâm thủng ở các vị trí lá tiêu chuẩn. Ấu trùng S1 (W + OSSl) hoặc nước (W + W). Đối chứng (C) là lá không bị hư hại. (B) Khả năng cảm ứng (RDPI so với biểu đồ đối chứng), tính đa dạng (chỉ số Hj) và tính chuyên môn hóa (chỉ số δj) được tính toán cho bản đồ chất chuyển hóa đặc biệt (599 MS/MS; tập dữ liệu S1). Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt đáng kể giữa nhóm cho ăn trực tiếp và nhóm đối chứng (kiểm định t của Student với kiểm định t ghép cặp, *P<0,05 và ***P<0,001). ns, không quan trọng. (C) Chỉ số độ phân giải thời gian của phổ chất chuyển hóa chính (ô màu xanh lam, axit amin, axit hữu cơ và đường; tập dữ liệu S2) và phổ chất chuyển hóa đặc biệt (ô màu đỏ 443 MS/MS; tập dữ liệu S1) sau khi xử lý mô phỏng sự phá hoại của động vật ăn cỏ. Dải màu biểu thị khoảng tin cậy 95%. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt đáng kể giữa nhóm được xử lý và nhóm đối chứng [phân tích phương sai bậc hai (ANOVA), tiếp theo là kiểm định sự khác biệt đáng kể trung thực của Tukey (HSD) để so sánh đa cặp sau đó, *P<0,05, **P<0,01 và *** P <0,001]. (D) Chuyên môn hóa biểu đồ phân tán và hồ sơ chất chuyển hóa đặc biệt (mẫu lặp lại với các phương pháp xử lý khác nhau).
Để tìm hiểu xem sự tái cấu trúc do động vật ăn cỏ gây ra ở cấp độ chuyển hóa có phản ánh trong những thay đổi về mức độ của từng chất chuyển hóa riêng lẻ hay không, trước tiên chúng tôi tập trung vào các chất chuyển hóa đã được nghiên cứu trước đây trong lá của Nepenthes pallens với khả năng kháng động vật ăn cỏ đã được chứng minh. Các amid phenolic là các chất liên hợp hydroxycinnamamide-polyamine tích lũy trong quá trình ăn cỏ của côn trùng và được biết là làm giảm hiệu suất của côn trùng (32). Chúng tôi đã tìm kiếm các tiền chất của MS/MS tương ứng và vẽ các đường cong động học tích lũy của chúng (Hình S1). Không có gì đáng ngạc nhiên, các dẫn xuất phenol không trực tiếp tham gia vào việc phòng vệ chống lại động vật ăn cỏ, chẳng hạn như axit chlorogenic (CGA) và rutin, bị điều chỉnh giảm sau khi bị ăn cỏ. Ngược lại, động vật ăn cỏ có thể làm cho các amid phenol có hiệu lực cao. Việc cho ăn liên tục của hai loài động vật ăn cỏ dẫn đến phổ kích thích của phenolamit gần như giống nhau, và mô hình này đặc biệt rõ ràng đối với quá trình tổng hợp phenolamit de novo. Hiện tượng tương tự sẽ được quan sát thấy khi khám phá con đường glycoside diterpene nonanediol 17-hydroxygeranyl (17-HGL-DTGs), tạo ra một số lượng lớn diterpene không vòng có chức năng chống động vật ăn cỏ hiệu quả (33), trong đó Ms Feeding with Sl đã kích hoạt hồ sơ biểu hiện tương tự (Hình S1)).
Nhược điểm tiềm tàng của các thí nghiệm cho ăn trực tiếp của động vật ăn cỏ là sự khác biệt về tốc độ tiêu thụ lá và thời gian ăn của động vật ăn cỏ, điều này khiến việc loại bỏ các tác động đặc thù của động vật ăn cỏ do vết thương và động vật ăn cỏ gây ra trở nên khó khăn. Để giải quyết tốt hơn tính đặc thù của loài động vật ăn cỏ đối với phản ứng trao đổi chất của lá được tạo ra, chúng tôi đã mô phỏng việc cho ăn của ấu trùng Ms và Sl bằng cách áp dụng ngay lập tức OS mới thu thập (OSM và OSS1) vào vết đâm tiêu chuẩn W ở các vị trí lá nhất quán. Quy trình này được gọi là xử lý W + OS, và nó chuẩn hóa sự cảm ứng bằng cách định thời điểm chính xác sự bắt đầu của phản ứng do động vật ăn cỏ gây ra mà không gây ra các tác động gây nhiễu của sự khác biệt về tốc độ hoặc số lượng mất mô (Hình 2A) (34). Sử dụng quy trình phân tích và tính toán MS/MS, chúng tôi đã thu được 443 phổ MS/MS (tệp dữ liệu S1), trùng lặp với các phổ đã được tập hợp trước đó từ các thí nghiệm cho ăn trực tiếp. Phân tích lý thuyết thông tin của tập dữ liệu MS/MS này cho thấy rằng việc lập trình lại các chất chuyển hóa chuyên biệt của lá bằng cách mô phỏng động vật ăn cỏ cho thấy sự cảm ứng đặc thù của OS (Hình 2C). Đặc biệt, so với phương pháp điều trị OSS1, OSM đã gây ra sự tăng cường chuyên môn hóa chuyển hóa ở thời điểm 4 giờ. Điều đáng chú ý là so với bộ dữ liệu thí nghiệm cho ăn trực tiếp bởi động vật ăn cỏ, động học chuyển hóa được trực quan hóa trong không gian hai chiều bằng cách sử dụng Hj và δj làm tọa độ và hướng chuyên môn hóa chuyển hóa đáp ứng với phương pháp điều trị mô phỏng động vật ăn cỏ theo thời gian tăng lên một cách nhất quán (Hình 2D). Đồng thời, chúng tôi đã định lượng hàm lượng axit amin, axit hữu cơ và đường (tệp dữ liệu S2) để điều tra xem liệu sự gia tăng chuyên môn hóa chuyển hóa có mục tiêu này có phải do sự tái cấu hình chuyển hóa carbon trung tâm để đáp ứng với động vật ăn cỏ mô phỏng hay không (Hình S2). Để giải thích rõ hơn mô hình này, chúng tôi đã theo dõi thêm động học tích lũy chuyển hóa của các con đường phenolamide và 17-HGL-DTG đã được thảo luận trước đó. Sự cảm ứng đặc hiệu OS của động vật ăn cỏ được chuyển đổi thành một mô hình sắp xếp lại khác biệt trong quá trình chuyển hóa phenolamide (Hình S3). Các amid phenolic chứa nhóm coumarin và caffeoyl được OSS1 ưu tiên cảm ứng, trong khi OSM kích hoạt sự cảm ứng đặc hiệu của các chất liên hợp ferulyl. Đối với con đường 17-HGL-DTG, sự cảm ứng OS khác biệt bởi các sản phẩm malonylation và dimalonylation ở hạ nguồn đã được phát hiện (Hình S3).
Tiếp theo, chúng tôi đã nghiên cứu tính dẻo dai của transcriptome do OS gây ra bằng cách sử dụng bộ dữ liệu microarray theo thời gian, mô phỏng việc sử dụng OSM để xử lý lá cây hoa hồng ở động vật ăn cỏ. Động học lấy mẫu về cơ bản trùng khớp với động học được sử dụng trong nghiên cứu chuyển hóa này (35). So với cấu hình lại metabolome trong đó tính dẻo dai chuyển hóa tăng lên đáng kể theo thời gian, chúng tôi quan sát thấy sự bùng phát phiên mã tạm thời trong lá do Ms gây ra, trong đó khả năng cảm ứng transcriptome (RDPI) và chuyên môn hóa (δj) ở mức 1 giờ, và sự đa dạng (Hj) ở thời điểm này, biểu hiện của BMP1 giảm đáng kể, sau đó là sự thư giãn của chuyên môn hóa transcriptome (Hình S4). Các họ gen chuyển hóa (như P450, glycosyltransferase và BAHD acyltransferase) tham gia vào quá trình lắp ráp các chất chuyển hóa đặc biệt từ các đơn vị cấu trúc có nguồn gốc từ quá trình chuyển hóa chính, theo mô hình chuyên môn hóa cao ban đầu đã đề cập ở trên. Là một nghiên cứu điển hình, con đường phenylalanine đã được phân tích. Phân tích đã xác nhận rằng các gen cốt lõi trong quá trình chuyển hóa phenolamide được kích hoạt mạnh mẽ bởi stress oxy hóa ở động vật ăn cỏ so với thực vật không bị thu hút, và có sự tương đồng chặt chẽ về mô hình biểu hiện. Yếu tố phiên mã MYB8 và các gen cấu trúc PAL1, PAL2, C4H và 4CL ở thượng nguồn của con đường này cho thấy sự khởi đầu phiên mã sớm. Các acyltransferase đóng vai trò trong quá trình lắp ráp cuối cùng của phenolamide, chẳng hạn như AT1, DH29 và CV86, thể hiện mô hình điều hòa tăng kéo dài (Hình S4). Các quan sát trên cho thấy sự khởi đầu sớm của chuyên môn hóa phiên mã và sự tăng cường sau đó của chuyên môn hóa chuyển hóa là một chế độ kết hợp, có thể là do hệ thống điều hòa đồng bộ khởi phát phản ứng phòng vệ mạnh mẽ.
Sự tái cấu hình trong tín hiệu hormone thực vật hoạt động như một lớp điều chỉnh tích hợp thông tin từ động vật ăn cỏ để lập trình lại sinh lý của cây. Sau khi mô phỏng tác động của động vật ăn cỏ, chúng tôi đã đo lường động lực tích lũy của các loại hormone thực vật chính và hình dung sự biểu hiện đồng thời theo thời gian giữa chúng [hệ số tương quan Pearson (PCC) > 0,4] (Hình 3A). Đúng như dự đoán, các hormone thực vật liên quan đến quá trình sinh tổng hợp được liên kết trong mạng lưới biểu hiện đồng thời hormone thực vật. Ngoài ra, tính đặc hiệu chuyển hóa (chỉ số Si) được ánh xạ vào mạng lưới này để làm nổi bật các hormone thực vật được tạo ra bởi các phương pháp xử lý khác nhau. Hai vùng chính của phản ứng đặc hiệu với động vật ăn cỏ được chỉ ra: một là trong cụm JA, nơi JA (dạng hoạt động sinh học JA-Ile) và các dẫn xuất JA khác cho thấy điểm Si cao nhất; vùng còn lại là ethylene (ET). Gibberellin chỉ cho thấy sự gia tăng vừa phải về tính đặc hiệu với động vật ăn cỏ, trong khi các hormone thực vật khác, chẳng hạn như cytokinin, auxin và axit abscisic, có tính đặc hiệu cảm ứng thấp đối với động vật ăn cỏ. So với việc chỉ sử dụng W + W, việc khuếch đại giá trị đỉnh của các dẫn xuất JA thông qua ứng dụng OS (W + OS) về cơ bản có thể được chuyển đổi thành một chỉ số đặc hiệu mạnh mẽ của JA. Thật bất ngờ, OSM và OSS1 với hàm lượng chất kích thích khác nhau được biết là gây ra sự tích lũy JA và JA-Ile tương tự. Trái ngược với OSS1, OSM được kích thích đặc hiệu và mạnh mẽ bởi OSM, trong khi OSS1 không khuếch đại phản ứng của các vết thương cơ bản (Hình 3B).
(A) Phân tích mạng đồng biểu hiện dựa trên tính toán PCC của mô phỏng động học tích lũy hormone thực vật do động vật ăn cỏ gây ra. Mỗi nút đại diện cho một hormone thực vật, và kích thước của nút đại diện cho chỉ số Si đặc trưng cho hormone thực vật giữa các phương pháp xử lý. (B) Sự tích lũy JA, JA-Ile và ET trong lá do các phương pháp xử lý khác nhau gây ra được biểu thị bằng các màu khác nhau: màu mơ, W + OSM; màu xanh lam, W + OSM; màu đen, W + W; màu xám, C (đối chứng). Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt đáng kể giữa phương pháp xử lý và đối chứng (phân tích phương sai hai chiều tiếp theo là so sánh đa cặp Tukey HSD, *** P <0,001). Phân tích lý thuyết thông tin của (C) 697 MS/MS (tệp dữ liệu S1) trong quá trình sinh tổng hợp JA và phổ nhận thức bị suy giảm (irAOC và irCOI1) và (D) 585 MS/MS (tệp dữ liệu S1) trong ETR1 với tín hiệu ET bị suy giảm. Hai dòng cây được kích hoạt bởi động vật ăn cỏ mô phỏng và cây đối chứng không được xử lý (EV). Dấu hoa thị biểu thị sự khác biệt đáng kể giữa nhóm điều trị W+OS và nhóm đối chứng không bị tổn thương (phân tích phương sai hai chiều tiếp theo là so sánh đa cặp Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 và ***P<0,001). (E) Biểu đồ phân tán về sự phản đối phân tán đối với chuyên môn hóa. Màu sắc đại diện cho các chủng biến đổi gen khác nhau; các ký hiệu đại diện cho các phương pháp điều trị khác nhau: hình tam giác, W + OSS1; hình chữ nhật, W + OSM; hình tròn C
Tiếp theo, chúng tôi sử dụng một chủng Nepenthes biến đổi gen đã được làm suy yếu (irCOI1 và sETR1) trong các bước quan trọng của quá trình sinh tổng hợp JA và ET (irAOC và irACO) và nhận biết (irCOI1 và sETR1) để phân tích sự đóng góp tương đối của quá trình tái lập trình đối với sự chuyển hóa của hai hormone thực vật này trên động vật ăn cỏ. Phù hợp với các thí nghiệm trước đây, chúng tôi đã xác nhận sự cảm ứng OS do động vật ăn cỏ gây ra ở cây mang mầm bệnh (EV) (Hình 3, C đến D) và sự giảm tổng thể chỉ số Hj do OSM gây ra, trong khi chỉ số δj tăng lên. Phản ứng này rõ rệt hơn so với phản ứng do OSS1 gây ra. Biểu đồ hai đường sử dụng Hj và δj làm tọa độ cho thấy sự điều chỉnh bất thường cụ thể (Hình 3E). Xu hướng rõ ràng nhất là ở các chủng thiếu tín hiệu JA, sự đa dạng chuyển hóa và những thay đổi chuyên môn hóa do động vật ăn cỏ gây ra gần như bị loại bỏ hoàn toàn (Hình 3C). Ngược lại, sự cảm nhận ET im lặng ở cây sETR1, mặc dù tác động tổng thể đến sự thay đổi trong quá trình trao đổi chất của động vật ăn cỏ thấp hơn nhiều so với tín hiệu JA, nhưng làm giảm sự khác biệt về chỉ số Hj và δj giữa kích thích OSM và OSS1 (Hình 3D và Hình S5). Điều này cho thấy rằng ngoài chức năng cốt lõi của truyền tín hiệu JA, truyền tín hiệu ET còn đóng vai trò điều chỉnh tinh tế phản ứng trao đổi chất đặc trưng của loài động vật ăn cỏ. Phù hợp với chức năng điều chỉnh tinh tế này, không có sự thay đổi nào về khả năng cảm ứng trao đổi chất tổng thể ở cây sETR1. Mặt khác, so với cây sETR1, cây irACO tạo ra biên độ thay đổi trao đổi chất tổng thể tương tự do động vật ăn cỏ gây ra, nhưng cho thấy điểm số Hj và δj khác biệt đáng kể giữa các thử thách OSM và OSS1 (Hình S5).
Để xác định các chất chuyển hóa chuyên biệt có đóng góp quan trọng vào phản ứng đặc trưng của loài động vật ăn cỏ và điều chỉnh quá trình sản xuất của chúng thông qua tín hiệu ET, chúng tôi đã sử dụng phương pháp MS/MS cấu trúc đã được phát triển trước đó. Phương pháp này dựa trên phương pháp phân cụm kép để suy luận lại họ chất chuyển hóa từ các mảnh MS/MS [tích chấm chuẩn hóa (NDP)] và điểm tương đồng dựa trên sự mất mát trung tính (NL). Tập dữ liệu MS/MS được xây dựng thông qua phân tích các dòng chuyển gen ET tạo ra 585 MS/MS (tệp dữ liệu S1), được phân giải bằng cách phân cụm chúng thành bảy mô-đun MS/MS chính (M) (Hình 4A). Một số mô-đun này chứa nhiều chất chuyển hóa đặc biệt đã được xác định trước đó: ví dụ, M1, M2, M3, M4 và M7 giàu các dẫn xuất phenol khác nhau (M1), flavonoid glycoside (M2), đường acyl (M3 và M4) và 17-HGL-DTG (M7). Ngoài ra, thông tin đặc hiệu về chuyển hóa (chỉ số Si) của một chất chuyển hóa duy nhất trong mỗi mô-đun được tính toán, và sự phân bố Si của nó có thể được nhìn thấy một cách trực quan. Tóm lại, phổ MS/MS thể hiện tính đặc hiệu cao về kiểu gen và mức độ ăn cỏ được đặc trưng bởi các giá trị Si cao, và thống kê độ nhọn cho thấy sự phân bố lông ở góc đuôi bên phải. Một sự phân bố keo ít chất béo như vậy đã được phát hiện trong M1, trong đó phenol amide cho thấy tỷ lệ Si cao nhất (Hình 4B). Chất 17-HGL-DTG cảm ứng do ăn cỏ đã đề cập trước đó trong M7 cho thấy điểm Si trung bình, cho thấy mức độ điều chỉnh khác biệt vừa phải giữa hai loại OS. Ngược lại, hầu hết các chất chuyển hóa chuyên biệt được sản xuất liên tục, chẳng hạn như rutin, CGA và đường acyl, nằm trong số các điểm Si thấp nhất. Để khám phá tốt hơn sự phức tạp về cấu trúc và sự phân bố Si giữa các chất chuyển hóa đặc biệt, một mạng lưới phân tử đã được xây dựng cho mỗi mô-đun (Hình 4B). Một dự đoán quan trọng của lý thuyết OD (được tóm tắt trong Hình 1B) là sự tái tổ chức các chất chuyển hóa đặc biệt sau khi bị động vật ăn cỏ tấn công sẽ dẫn đến những thay đổi một chiều trong các chất chuyển hóa có giá trị phòng vệ cao, đặc biệt là bằng cách tăng tính đặc hiệu của chúng (trái ngược với phân bố ngẫu nhiên). Chất chuyển hóa phòng vệ được dự đoán bởi lý thuyết MT. Hầu hết các dẫn xuất phenol tích lũy trong M1 đều liên quan đến chức năng làm suy giảm hiệu suất của côn trùng (32). Khi so sánh giá trị Si trong các chất chuyển hóa M1 giữa lá bị tác động và lá cấu thành của cây đối chứng EV sau 24 giờ, chúng tôi nhận thấy rằng tính đặc hiệu chuyển hóa của nhiều chất chuyển hóa sau khi bị côn trùng ăn cỏ tấn công có xu hướng tăng đáng kể (Hình 4C). Sự gia tăng cụ thể về giá trị Si chỉ được phát hiện ở các phenolamide phòng vệ, nhưng không phát hiện thấy sự gia tăng giá trị Si ở các phenol khác và các chất chuyển hóa chưa biết cùng tồn tại trong mô-đun này. Đây là một mô hình chuyên biệt, có liên quan đến lý thuyết OD. Các dự đoán chính về những thay đổi chuyển hóa do động vật ăn cỏ gây ra là nhất quán. Để kiểm tra xem đặc điểm riêng biệt của phổ phenolamide này có phải do ET đặc hiệu OS gây ra hay không, chúng tôi đã vẽ biểu đồ chỉ số Si của chất chuyển hóa và tạo ra giá trị biểu hiện khác biệt giữa OSM và OSS1 trong kiểu gen EV và sETR1 (Hình 4D). Trong sETR1, sự khác biệt do phenamide gây ra giữa OSM và OSS1 đã giảm đáng kể. Phương pháp phân cụm kép cũng được áp dụng cho dữ liệu MS/MS thu thập được trong các chủng có lượng JA không đủ để suy ra các mô-đun MS/MS chính liên quan đến chuyên môn hóa chuyển hóa được điều chỉnh bởi JA (Hình S6).
(A) Kết quả phân cụm của 585 MS/MS dựa trên mảnh vỡ chung (độ tương đồng NDP) và mất mát trung tính chung (độ tương đồng NL) cho thấy mô-đun (M) phù hợp với họ hợp chất đã biết, hoặc với thành phần chất chuyển hóa chưa biết hoặc chuyển hóa kém. Bên cạnh mỗi mô-đun, phân bố đặc hiệu chất chuyển hóa (MS/MS) (Si) được hiển thị. (B) Mạng lưới phân tử mô-đun: Các nút đại diện cho MS/MS và các cạnh, điểm số MS/MS NDP (màu đỏ) và NL (màu xanh lam) (ngưỡng cắt > 0,6). Chỉ số đặc hiệu chất chuyển hóa (Si) được phân cấp, tô màu dựa trên mô-đun (bên trái) và được ánh xạ vào mạng lưới phân tử (bên phải). (C) Mô-đun M1 của cây EV ở trạng thái cấu thành (kiểm soát) và trạng thái cảm ứng (mô phỏng động vật ăn cỏ) sau 24 giờ: sơ đồ mạng lưới phân tử (giá trị Si là kích thước nút, phenolamide phòng vệ được tô sáng màu xanh lam). (D) Sơ đồ mạng phân tử M1 của vạch phổ sETR1 với khả năng cảm nhận EV và ET bị suy giảm: hợp chất phenolic được biểu thị bằng nút hình tròn màu xanh lá cây, và sự khác biệt đáng kể (giá trị P) giữa các phương pháp điều trị W + OSM và W + OSS1 được biểu thị bằng kích thước nút. CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, N-ferulic acid ester-uric acid; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum trong quả kỷ tử Son; Nick. O-AS, O-acyl sugar.
Chúng tôi tiếp tục mở rộng phân tích từ một kiểu gen Nepenthes suy yếu duy nhất sang các quần thể tự nhiên, nơi những thay đổi nội loài mạnh mẽ về mức độ JA do động vật ăn cỏ và mức độ chất chuyển hóa cụ thể đã được mô tả trước đây trong các quần thể tự nhiên (26). Sử dụng tập dữ liệu này để bao gồm 43 nguồn gen. Các nguồn gen này bao gồm 123 loài thực vật từ N. pallens. Những cây này được lấy từ hạt giống thu thập được ở các môi trường sống tự nhiên khác nhau ở Utah, Nevada, Arizona và California (Hình S7), chúng tôi đã tính toán sự đa dạng chuyển hóa (ở đây được gọi là đa dạng β ở cấp độ quần thể) và sự chuyên môn hóa do OSM gây ra. Phù hợp với các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã quan sát thấy một loạt các thay đổi chuyển hóa dọc theo trục Hj và δj, cho thấy các nguồn gen có sự khác biệt đáng kể về tính dẻo dai của phản ứng chuyển hóa của chúng đối với động vật ăn cỏ (Hình S7). Sự tổ chức này gợi nhớ đến những quan sát trước đây về phạm vi động của các thay đổi JA do động vật ăn cỏ gây ra, và đã duy trì giá trị rất cao trong một quần thể duy nhất (26, 36). Bằng cách sử dụng JA và JA-Ile để kiểm tra mối tương quan tổng thể giữa Hj và δj, chúng tôi nhận thấy có mối tương quan dương đáng kể giữa JA và chỉ số đa dạng và chuyên môn hóa β của hệ chuyển hóa (Hình S7). Điều này cho thấy sự không đồng nhất do động vật ăn cỏ gây ra trong quá trình cảm ứng JA được phát hiện ở cấp độ quần thể có thể là do các đa hình chuyển hóa quan trọng gây ra bởi sự chọn lọc từ các loài côn trùng ăn cỏ.
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các loại thuốc lá khác nhau rất nhiều về loại và mức độ phụ thuộc tương đối vào các cơ chế phòng vệ chuyển hóa cảm ứng và cấu thành. Người ta tin rằng những thay đổi trong quá trình truyền tín hiệu chống động vật ăn cỏ và khả năng phòng vệ này được điều chỉnh bởi áp lực quần thể côn trùng, chu kỳ sống của cây và chi phí sản xuất phòng vệ trong môi trường sống mà một loài nhất định phát triển. Chúng tôi đã nghiên cứu tính nhất quán của quá trình tái cấu trúc chuyển hóa lá do động vật ăn cỏ gây ra ở sáu loài Nicotiana có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và Nam Mỹ. Những loài này có quan hệ họ hàng gần với Nepenthes Bắc Mỹ, cụ thể là Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, thuốc lá tuyến tính, thuốc lá (Nicotiana spegazzinii) và thuốc lá lá (Nicotiana obtusifolia) (Hình 5A) (37). Sáu trong số các loài này, bao gồm cả loài N. please đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, là cây hàng năm thuộc nhánh petunia, và obtusifolia N. là cây lâu năm thuộc nhánh chị em Trigonophyllae (38). Tiếp theo, các thí nghiệm cảm ứng W + W, W + OSM và W + OSS1 được thực hiện trên bảy loài này để nghiên cứu sự sắp xếp lại quá trình trao đổi chất ở cấp độ loài trong hoạt động ăn uống của côn trùng.
(A) Cây phát sinh chủng loại bootstrap dựa trên khả năng tối đa [đối với quá trình tổng hợp glutamine hạt nhân (38)] và sự phân bố địa lý của bảy loài Nicotiana có quan hệ gần gũi (màu khác nhau) (37). (B) Biểu đồ phân tán về sự đa dạng chuyên biệt cho hồ sơ chuyển hóa của bảy loài Nicotiana (939 MS/MS; tệp dữ liệu S1). Ở cấp độ loài, sự đa dạng chuyển hóa có tương quan nghịch với mức độ chuyên biệt. Phân tích mối tương quan ở cấp độ loài giữa sự đa dạng chuyển hóa và chuyên biệt cũng như sự tích lũy JA được thể hiện trong Hình 2. S9. Màu sắc, các loại khác nhau; tam giác, W + OSS1; hình chữ nhật, W + OSM; (C) Động lực JA và JA-Ile của Nicotiana được xếp hạng theo biên độ kích thích OS (phân tích phương sai hai chiều và so sánh đa cặp Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 và * ** Đối với so sánh W + OS và W + W, P <0,001). Biểu đồ hộp thể hiện (D) sự đa dạng và (E) tính chuyên môn hóa của từng loài sau khi mô phỏng tác động của động vật ăn cỏ và methyl JA (MeJA). Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt đáng kể giữa W + OS và W + W hoặc lanolin cộng với W (Lan + W) hoặc Lan cộng với MeJA (Lan + MeJa) và nhóm đối chứng Lan (phân tích phương sai hai chiều, tiếp theo là so sánh đa cặp hậu kiểm Tukey's HSD, *P<0,05, **P<0,01 và ***P<0,001).
Sử dụng phương pháp phân cụm kép, chúng tôi đã xác định được 9 mô-đun gồm 939 MS/MS (tệp dữ liệu S1). Thành phần của MS/MS được cấu hình lại bởi các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau giữa các mô-đun khác nhau giữa các loài (Hình S8). Việc trực quan hóa Hj (được gọi ở đây là đa dạng γ cấp độ loài) và δj cho thấy các loài khác nhau tập hợp thành các nhóm rất khác nhau trong không gian chuyển hóa, trong đó sự phân chia cấp độ loài thường nổi bật hơn so với sự kích thích. Ngoại trừ N. linear và N. obliquus, chúng thể hiện một phạm vi động rộng của các hiệu ứng cảm ứng (Hình 5B). Ngược lại, các loài như N. purpurea và N. obtusifolia có phản ứng chuyển hóa ít rõ ràng hơn đối với phương pháp xử lý, nhưng hệ thống chuyển hóa lại đa dạng hơn. Sự phân bố đặc trưng theo loài của phản ứng chuyển hóa được tạo ra dẫn đến mối tương quan nghịch đáng kể giữa chuyên môn hóa và đa dạng gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Sự thay đổi nồng độ JA do OS gây ra có tương quan thuận với sự chuyên môn hóa chuyển hóa và tương quan nghịch với sự đa dạng gamma chuyển hóa mà mỗi loài thể hiện (Hình 5B và Hình S9). Điều đáng chú ý là các loài thường được gọi là loài “phản ứng tín hiệu” trong Hình 5C, chẳng hạn như Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute và Nepenthes attenuated, đã gây ra những dấu hiệu đáng kể sau 30 phút. Sự bùng phát JA và JA-Ile đặc hiệu với OS gần đây, trong khi các vi khuẩn khác được gọi là “không phản ứng tín hiệu”, chẳng hạn như Nepenthes mills, Nepenthes powdery và N. obtusifolia chỉ cho thấy sự cảm ứng JA-Ile Edge mà không có bất kỳ tính đặc hiệu OS nào (Hình 5C). Ở cấp độ chuyển hóa, như đã đề cập ở trên, đối với Nepenthes attenuated, các chất phản ứng tín hiệu cho thấy tính đặc hiệu OS và làm tăng đáng kể δj, đồng thời làm giảm Hj. Hiệu ứng mồi đặc hiệu OS này không được phát hiện ở các loài được phân loại là loài không phản ứng với tín hiệu (Hình 5, D và E). Các chất chuyển hóa đặc hiệu OS được chia sẻ thường xuyên hơn giữa các loài phản ứng với tín hiệu, và các cụm tín hiệu này tập trung với các loài có phản ứng tín hiệu yếu hơn, trong khi các loài có phản ứng tín hiệu yếu hơn lại ít phụ thuộc lẫn nhau hơn (Hình S8). Kết quả này cho thấy sự cảm ứng đặc hiệu OS của JAs và sự tái cấu hình đặc hiệu OS của hệ thống chuyển hóa hạ nguồn được liên kết với nhau ở cấp độ loài.
Tiếp theo, chúng tôi sử dụng hỗn hợp lanolin chứa methyl JA (MeJA) để xử lý thực vật nhằm điều tra xem liệu các phương thức liên kết này có bị hạn chế bởi lượng JA được cung cấp từ JA ngoại sinh, nằm trong tế bào chất của thực vật hay không. Quá trình khử este nhanh chóng là JA. Chúng tôi nhận thấy xu hướng thay đổi dần dần từ các loài phản ứng với tín hiệu sang các loài không phản ứng với tín hiệu do việc cung cấp JA liên tục (Hình 5, D và E). Tóm lại, xử lý bằng MeJA đã lập trình lại mạnh mẽ hệ thống chuyển hóa của các loài giun tròn N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens và N. mikimotoi, dẫn đến sự gia tăng đáng kể δj và giảm Hj. N. purpurea chỉ cho thấy sự gia tăng δj, nhưng không phải Hj. N. obtusifolia, loài trước đây được chứng minh là tích lũy lượng JA cực thấp, cũng phản ứng kém với xử lý bằng MeJA về mặt tái cấu hình hệ thống chuyển hóa. Những kết quả này cho thấy rằng việc sản xuất JA hoặc truyền tín hiệu bị hạn chế về mặt sinh lý ở các loài không phản ứng với tín hiệu. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã nghiên cứu bốn loài (N. pallens, N. mills, N. pink và N. microphylla) được kích thích bởi W + W, W + OSMs và W + OSS1 Transcriptome (39). Phù hợp với mô hình tái cấu trúc metabolome, các loài được phân tách rõ ràng trong không gian transcriptome, trong đó N. attenuated cho thấy RDPI do OS gây ra cao nhất, trong khi N. gracilis có mức thấp nhất (Hình 6A). Tuy nhiên, người ta thấy rằng sự đa dạng transcriptome do N. oblonga gây ra là thấp nhất trong số bốn loài, trái ngược với sự đa dạng metabonomic cao nhất của N. oblonga đã được chứng minh trước đây ở bảy loài. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một tập hợp các gen liên quan đến tín hiệu phòng vệ sớm, bao gồm tín hiệu JA, giải thích tính đặc hiệu của các phản ứng phòng vệ sớm do các chất kích thích liên quan đến động vật ăn cỏ gây ra ở các loài Nicotiana (39). So sánh các con đường tín hiệu JA giữa bốn loài này đã tiết lộ một mô hình thú vị (Hình 6B). Hầu hết các gen trong con đường này, chẳng hạn như AOC, OPR3, ACX và COI1, đều cho thấy mức độ cảm ứng tương đối cao ở bốn loài này. Tuy nhiên, một gen quan trọng, JAR4, chuyển đổi JA thành dạng hoạt động sinh học là JA-Ile, lại có mức độ phiên mã rất thấp, đặc biệt là ở N. mills, Nepenthes pieris và N. microphylla. Ngoài ra, chỉ có bản sao của một gen khác là AOS không được phát hiện ở N. bifidum. Những thay đổi trong biểu hiện gen này có thể là nguyên nhân gây ra các kiểu hình cực đoan do sản xuất JA thấp ở các loài không phản ứng với tín hiệu và sự cảm ứng ở N. gracilis.
(A) Phân tích lý thuyết thông tin về sự tái lập trình các phản ứng phiên mã sớm của bốn loài thuốc lá có quan hệ gần gũi được lấy mẫu 30 phút sau khi gây tổn thương do động vật ăn lá. RDPI được tính bằng cách so sánh lá bị tổn thương do động vật ăn lá OS với lá đối chứng không bị tổn thương. Màu sắc biểu thị các loài khác nhau, và các ký hiệu biểu thị các phương pháp xử lý khác nhau. (B) Phân tích biểu hiện gen trong các con đường tín hiệu JA giữa bốn loài. Đường dẫn JA được đơn giản hóa được hiển thị bên cạnh biểu đồ hộp. Các màu khác nhau biểu thị các phương pháp xử lý khác nhau. Dấu hoa thị cho biết có sự khác biệt đáng kể giữa phương pháp xử lý W + OS và phương pháp đối chứng W + W (đối với phép kiểm định t của Student cho sự khác biệt từng cặp, *P<0,05, **P<0,01 và ***P<0,001). OPDA, axit 12-oxophytodienoic; OPC-8: axit 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic.
Trong phần cuối, chúng tôi đã nghiên cứu cách tái cấu trúc đặc trưng theo loài côn trùng của hệ trao đổi chất của các loài thực vật khác nhau có thể chống lại động vật ăn cỏ. Nghiên cứu trước đây đã nhấn mạnh đến chi Nicotiana. Khả năng kháng sâu đục thân (Ms) và ấu trùng của chúng khác nhau rất nhiều (40). Ở đây, chúng tôi đã nghiên cứu mối liên hệ giữa mô hình này và tính dẻo dai trao đổi chất của chúng. Sử dụng bốn loài thuốc lá nói trên và kiểm tra mối tương quan giữa sự đa dạng và chuyên môn hóa của hệ trao đổi chất do động vật ăn cỏ gây ra và khả năng kháng sâu đục thân (Ms) và sâu đục thân (Sl), chúng tôi nhận thấy khả năng kháng sâu đục thân (Sl) tổng quát đều có tương quan dương, trong khi mối tương quan giữa khả năng kháng sâu đục thân (Sl) chuyên biệt và chuyên môn hóa là yếu, và mối tương quan với sự đa dạng không đáng kể (Hình S10). Về khả năng kháng sâu đục thân (S1), cả N. chinensis và N. gracilis đã được chứng minh là có cả mức độ truyền tín hiệu JA và tính dẻo dai trao đổi chất, đều có phản ứng rất khác nhau đối với sự tác động của động vật ăn cỏ, và chúng cũng cho thấy khả năng kháng sâu đục thân (Sl) cao tương tự.
Trong sáu mươi năm qua, lý thuyết phòng vệ thực vật đã cung cấp một khuôn khổ lý thuyết, dựa trên đó các nhà nghiên cứu đã dự đoán một số lượng đáng kể sự tiến hóa và chức năng của các chất chuyển hóa chuyên biệt của thực vật. Hầu hết các lý thuyết này không tuân theo quy trình suy luận mạnh mẽ thông thường (41). Chúng đề xuất các dự đoán chính (3) ở cùng một cấp độ phân tích. Khi việc kiểm tra các dự đoán chính cho phép phân tích các lý thuyết cụ thể, điều này sẽ giúp lĩnh vực này tiến lên. Một số lý thuyết được ủng hộ nhưng những lý thuyết khác bị bác bỏ (42). Thay vào đó, lý thuyết mới đưa ra các dự đoán ở các cấp độ phân tích khác nhau và bổ sung một lớp cân nhắc mô tả mới (42). Tuy nhiên, hai lý thuyết được đề xuất ở cấp độ chức năng, MT và OD, có thể dễ dàng được giải thích là những dự đoán quan trọng về những thay đổi chuyển hóa chuyên biệt do động vật ăn cỏ gây ra: Lý thuyết OD cho rằng những thay đổi trong “không gian” chuyển hóa chuyên biệt có tính định hướng cao. Lý thuyết MT cho rằng những thay đổi này sẽ không có tính định hướng và nằm ngẫu nhiên trong không gian chuyển hóa, và có xu hướng tạo ra các chất chuyển hóa có giá trị phòng vệ cao. Các cuộc kiểm tra trước đây về các dự đoán của OD và MT đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng một tập hợp hẹp các hợp chất “phòng vệ” được xác định trước. Các thử nghiệm tập trung vào chất chuyển hóa này ngăn cản khả năng phân tích mức độ và quỹ đạo tái cấu hình chuyển hóa trong quá trình ăn cỏ, và không cho phép thử nghiệm trong khuôn khổ thống kê nhất quán để yêu cầu các dự đoán chính có thể được xem xét như một tổng thể. Định lượng những thay đổi trong chuyển hóa thực vật. Ở đây, chúng tôi đã sử dụng công nghệ tiên tiến trong chuyển hóa học dựa trên MS tính toán và thực hiện phân tích MS giải mã trong đơn vị chung của các mô tả lý thuyết thông tin để kiểm tra sự khác biệt giữa hai đề xuất ở cấp độ chuyển hóa học toàn cầu. Dự đoán chính của lý thuyết này. Lý thuyết thông tin đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong bối cảnh nghiên cứu đa dạng sinh học và dòng chảy chất dinh dưỡng (43). Tuy nhiên, theo như chúng tôi biết, đây là ứng dụng đầu tiên được sử dụng để mô tả không gian thông tin chuyển hóa của thực vật và giải quyết các vấn đề sinh thái liên quan đến những thay đổi chuyển hóa tạm thời để đáp ứng với các tín hiệu môi trường. Cụ thể, khả năng của phương pháp này nằm ở khả năng so sánh các mô hình trong và giữa các loài thực vật để kiểm tra cách động vật ăn cỏ đã tiến hóa từ các loài khác nhau thành các mô hình tiến hóa vĩ mô giữa các loài ở các cấp độ tiến hóa khác nhau. Chuyển hóa.
Phân tích thành phần chính (PCA) chuyển đổi tập dữ liệu đa biến thành không gian giảm chiều để có thể giải thích xu hướng chính của dữ liệu, vì vậy nó thường được sử dụng như một kỹ thuật khám phá để phân tích tập dữ liệu, chẳng hạn như giải mã chuyển hóa. Tuy nhiên, việc giảm chiều sẽ làm mất một phần nội dung thông tin trong tập dữ liệu, và PCA không thể cung cấp thông tin định lượng về các đặc điểm đặc biệt liên quan đến lý thuyết sinh thái, chẳng hạn như: động vật ăn cỏ tái cấu trúc sự đa dạng trong các lĩnh vực chuyên biệt (ví dụ: sự phong phú, phân bố và số lượng) thông qua các chất chuyển hóa như thế nào? Chất chuyển hóa nào là yếu tố dự báo trạng thái được kích hoạt của một loài động vật ăn cỏ nhất định? Từ góc độ tính đặc hiệu, tính đa dạng và khả năng kích hoạt, nội dung thông tin của hồ sơ chất chuyển hóa đặc trưng của lá được phân tích, và người ta thấy rằng việc ăn của động vật ăn cỏ có thể kích hoạt quá trình chuyển hóa đặc hiệu. Thật bất ngờ, chúng tôi quan sát thấy rằng, như đã mô tả trong các chỉ số lý thuyết thông tin được thực hiện, tình trạng trao đổi chất thu được có sự chồng chéo lớn sau các cuộc tấn công của hai loài ăn cỏ (loài ăn đêm Sl) và loài chuyên gia Solanaceae Ms. Mặc dù hành vi ăn uống và nồng độ của chúng khác nhau đáng kể. Chất khởi đầu liên hợp axit béo-axit amin (FAC) trong OS (31). Bằng cách sử dụng OS của động vật ăn cỏ để điều trị các vết thương đâm thủng tiêu chuẩn, phương pháp điều trị mô phỏng động vật ăn cỏ cũng cho thấy xu hướng tương tự. Quy trình tiêu chuẩn này để mô phỏng phản ứng của thực vật đối với các cuộc tấn công của động vật ăn cỏ loại bỏ các yếu tố gây nhiễu do thay đổi hành vi ăn uống của động vật ăn cỏ, dẫn đến mức độ thiệt hại khác nhau ở các thời điểm khác nhau (34). FAC, được biết là nguyên nhân chính của OSM, làm giảm JAS và các phản ứng hormone thực vật khác trong OSS1, trong khi OSS1 giảm hàng trăm lần (31). Tuy nhiên, OSS1 gây ra mức độ tích lũy JA tương tự so với OSM. Trước đây, người ta đã chứng minh rằng phản ứng JA ở Nepenthes suy yếu rất nhạy cảm với OSM, trong đó FAC có thể duy trì hoạt động của nó ngay cả khi được pha loãng 1:1000 với nước (44). Do đó, so với OSM, mặc dù FAC trong OSS1 rất thấp, nhưng nó vẫn đủ để gây ra sự bùng phát JA đáng kể. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các protein giống porin (45) và oligosaccharide (46) có thể được sử dụng làm manh mối phân tử để kích hoạt phản ứng phòng vệ của thực vật trong OSS1. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu các chất kích thích này trong OSS1 có chịu trách nhiệm cho sự tích lũy JA được quan sát thấy trong nghiên cứu hiện tại hay không.
Mặc dù có một số nghiên cứu mô tả dấu ấn chuyển hóa khác biệt do việc sử dụng các loài động vật ăn cỏ khác nhau hoặc JA hoặc SA (axit salicylic) ngoại sinh (47), nhưng chưa ai nghiên cứu tác động tổng thể của quá trình chuyển hóa đến các loài động vật ăn cỏ cụ thể trong mạng lưới cỏ thực vật và ảnh hưởng của nó đến thông tin cá nhân cụ thể. Phân tích này càng khẳng định rằng kết nối mạng lưới hormone nội bộ với các hormone thực vật khác ngoài JA định hình tính đặc thù của quá trình tái tổ chức chuyển hóa do động vật ăn cỏ gây ra. Đặc biệt, chúng tôi phát hiện ra rằng ET do OSM gây ra lớn hơn đáng kể so với ET do OSS1 gây ra. Chế độ này phù hợp với hàm lượng FAC cao hơn trong OSM, đây là điều kiện cần và đủ để kích hoạt sự bùng phát ET (48). Trong bối cảnh tương tác giữa thực vật và động vật ăn cỏ, chức năng tín hiệu của ET đối với động lực chuyển hóa đặc hiệu của thực vật vẫn còn rời rạc và chỉ nhắm mục tiêu vào một nhóm hợp chất duy nhất. Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu đã sử dụng ứng dụng ngoại sinh của ET hoặc tiền chất của nó hoặc các chất ức chế khác nhau để nghiên cứu sự điều hòa của ET, trong đó các ứng dụng hóa chất ngoại sinh này sẽ tạo ra nhiều tác dụng phụ không đặc hiệu. Theo hiểu biết của chúng tôi, nghiên cứu này là nghiên cứu hệ thống quy mô lớn đầu tiên kiểm tra vai trò của ET trong việc sử dụng ET để tạo ra và nhận biết các cây chuyển gen bị suy yếu nhằm điều phối động lực chuyển hóa của cây. Sự cảm ứng ET đặc hiệu với động vật ăn cỏ cuối cùng có thể điều chỉnh phản ứng chuyển hóa. Quan trọng nhất là thao tác chuyển gen của các gen sinh tổng hợp (ACO) và nhận biết (ETR1) của ET đã tiết lộ sự tích lũy de novo đặc hiệu với động vật ăn cỏ của phenolamide. Trước đây, người ta đã chỉ ra rằng ET có thể điều chỉnh sự tích lũy nicotin do JA gây ra bằng cách điều hòa putrescine N-methyltransferase (49). Tuy nhiên, từ quan điểm cơ học, vẫn chưa rõ ET điều chỉnh sự cảm ứng phenamide như thế nào. Ngoài chức năng truyền tín hiệu của ET, dòng chuyển hóa cũng có thể được chuyển hướng đến S-adenosyl-1-methionine để điều chỉnh sự đầu tư vào các polyaminophenol amide. S-adenosyl-1-methionine là ET và là chất trung gian phổ biến trong con đường sinh tổng hợp polyamine. Cơ chế mà tín hiệu ET điều chỉnh mức độ phenolamide cần được nghiên cứu thêm.
Trong một thời gian dài, do số lượng lớn các chất chuyển hóa đặc biệt có cấu trúc chưa được biết đến, việc tập trung chuyên sâu vào các loại chuyển hóa cụ thể đã không thể đánh giá chính xác sự thay đổi theo thời gian của đa dạng chuyển hóa sau các tương tác sinh học. Hiện nay, dựa trên phân tích lý thuyết thông tin, kết quả chính của việc thu thập phổ MS/MS dựa trên các chất chuyển hóa không thiên vị cho thấy rằng động vật ăn cỏ ăn hoặc mô phỏng động vật ăn cỏ tiếp tục làm giảm sự đa dạng chuyển hóa tổng thể của hệ chuyển hóa lá trong khi tăng mức độ chuyên môn hóa của nó. Sự gia tăng tạm thời về tính đặc hiệu của hệ chuyển hóa do động vật ăn cỏ gây ra này có liên quan đến sự gia tăng đồng thời về tính đặc hiệu của hệ phiên mã. Đặc điểm đóng góp nhiều nhất vào sự chuyên môn hóa hệ chuyển hóa lớn hơn này (có giá trị Si cao hơn) là chất chuyển hóa đặc biệt với chức năng ăn cỏ đã được xác định trước đó. Mô hình này phù hợp với dự đoán của lý thuyết OD, nhưng không phù hợp với dự đoán của MT liên quan đến tính ngẫu nhiên của việc lập trình lại hệ chuyển hóa. Tuy nhiên, dữ liệu này cũng phù hợp với dự đoán của mô hình hỗn hợp (MT tốt nhất; Hình 1B), bởi vì các chất chuyển hóa chưa được xác định khác với chức năng phòng vệ chưa biết vẫn có thể tuân theo phân bố Si ngẫu nhiên.
Một mô hình đáng chú ý khác được nghiên cứu này nắm bắt là từ cấp độ vi tiến hóa (thực vật đơn lẻ và quần thể thuốc lá) đến quy mô tiến hóa lớn hơn (các loài thuốc lá có quan hệ gần gũi), các cấp độ tổ chức tiến hóa khác nhau nằm trong “khả năng phòng thủ tốt nhất”. Có sự khác biệt đáng kể về khả năng của động vật ăn cỏ. Moore et al. (20) và Kessler và Kalske (1) đã độc lập đề xuất chuyển đổi ba cấp độ chức năng của đa dạng sinh học ban đầu được Whittaker (50) phân biệt thành các thay đổi theo thời gian cấu thành và cảm ứng của đa dạng hóa học; những tác giả này không tóm tắt các thủ tục thu thập dữ liệu chuyển hóa quy mô lớn cũng như không nêu rõ cách tính toán đa dạng chuyển hóa từ dữ liệu này. Trong nghiên cứu này, những điều chỉnh nhỏ đối với phân loại chức năng của Whittaker sẽ xem xét đa dạng chuyển hóa α là sự đa dạng của phổ MS/MS trong một cây nhất định, đa dạng chuyển hóa β là quá trình chuyển hóa nội loài cơ bản của một nhóm quần thể, và đa dạng chuyển hóa γ sẽ là phần mở rộng của phân tích các loài tương tự.
Tín hiệu JA rất cần thiết cho nhiều phản ứng trao đổi chất của động vật ăn cỏ. Tuy nhiên, hiện vẫn thiếu các thử nghiệm định lượng nghiêm ngặt về sự đóng góp của điều hòa nội loài đối với quá trình sinh tổng hợp JA vào sự đa dạng của hệ trao đổi chất, và liệu tín hiệu JA có phải là điểm chung cho sự đa dạng hóa trao đổi chất do stress gây ra ở quy mô tiến hóa vĩ mô cao hơn hay không vẫn còn chưa rõ ràng. Chúng tôi nhận thấy rằng bản chất ăn cỏ của loài Nepenthes gây ra sự chuyên môn hóa hệ trao đổi chất và sự biến đổi của sự chuyên môn hóa hệ trao đổi chất trong quần thể các loài Nicotiana và giữa các loài Nicotiana có quan hệ gần gũi có mối tương quan tích cực một cách có hệ thống với tín hiệu JA. Ngoài ra, khi tín hiệu JA bị suy giảm, tính đặc hiệu trao đổi chất do một kiểu gen động vật ăn cỏ duy nhất gây ra sẽ bị triệt tiêu (Hình 3, C và E). Vì sự thay đổi phổ trao đổi chất của quần thể Nepenthes bị suy giảm tự nhiên chủ yếu là định lượng, nên sự thay đổi về tính đa dạng và đặc hiệu β trao đổi chất trong phân tích này có thể phần lớn là do sự kích thích mạnh mẽ của các nhóm hợp chất giàu chất chuyển hóa. Các nhóm hợp chất này chiếm ưu thế trong một phần cấu trúc chuyển hóa và dẫn đến mối tương quan tích cực với tín hiệu JA.
Do cơ chế sinh hóa của các loài thuốc lá có quan hệ gần gũi rất khác nhau, nên các chất chuyển hóa được xác định cụ thể ở khía cạnh định tính, do đó mang tính phân tích hơn. Quá trình xử lý hồ sơ chuyển hóa thu được bằng lý thuyết thông tin cho thấy sự tác động của động vật ăn cỏ làm trầm trọng thêm sự đánh đổi giữa tính đa dạng gamma chuyển hóa và tính chuyên môn hóa. Tín hiệu JA đóng vai trò trung tâm trong sự đánh đổi này. Sự gia tăng tính chuyên môn hóa chuyển hóa phù hợp với dự đoán OD chính và tương quan tích cực với tín hiệu JA, trong khi tín hiệu JA tương quan tiêu cực với tính đa dạng gamma chuyển hóa. Các mô hình này chỉ ra rằng khả năng OD của thực vật chủ yếu được xác định bởi tính dẻo dai của JA, dù ở quy mô vi tiến hóa hay quy mô tiến hóa lớn hơn. Các thí nghiệm ứng dụng JA ngoại sinh nhằm khắc phục các khiếm khuyết sinh tổng hợp JA cho thấy thêm rằng các loài thuốc lá có quan hệ gần gũi có thể được phân biệt thành các loài phản ứng với tín hiệu và các loài không phản ứng với tín hiệu, giống như chế độ JA và tính dẻo dai chuyển hóa do động vật ăn cỏ gây ra. Các loài không phản ứng với tín hiệu không thể phản ứng do không có khả năng sản xuất JA nội sinh và do đó phải chịu những hạn chế về mặt sinh lý. Điều này có thể do đột biến ở một số gen quan trọng trong con đường truyền tín hiệu JA (AOS và JAR4 ở N. crescens). Kết quả này nhấn mạnh rằng các mô hình tiến hóa vĩ mô giữa các loài này có thể chủ yếu được thúc đẩy bởi những thay đổi trong nhận thức và khả năng phản ứng với hormone nội sinh.
Ngoài sự tương tác giữa thực vật và động vật ăn cỏ, việc khám phá sự đa dạng chuyển hóa còn liên quan đến tất cả những tiến bộ lý thuyết quan trọng trong nghiên cứu về sự thích nghi sinh học với môi trường và sự tiến hóa của các đặc điểm kiểu hình phức tạp. Với sự gia tăng lượng dữ liệu thu được từ các thiết bị MS hiện đại, việc kiểm định giả thuyết về sự đa dạng chuyển hóa giờ đây có thể vượt qua sự khác biệt giữa các chất chuyển hóa riêng lẻ/theo loại và thực hiện phân tích toàn cầu để phát hiện ra các mô hình bất ngờ. Trong quá trình phân tích quy mô lớn, một phép ẩn dụ quan trọng là ý tưởng về việc hình thành các bản đồ có ý nghĩa có thể được sử dụng để khám phá dữ liệu. Do đó, một kết quả quan trọng của sự kết hợp hiện tại giữa phương pháp chuyển hóa MS/MS không thiên vị và lý thuyết thông tin là nó cung cấp một thước đo đơn giản có thể được sử dụng để xây dựng bản đồ nhằm xem xét sự đa dạng chuyển hóa ở các thang phân loại khác nhau. Đây là yêu cầu cơ bản của phương pháp này trong nghiên cứu về tiến hóa vi mô/vĩ mô và sinh thái cộng đồng.
Ở cấp độ tiến hóa vĩ mô, cốt lõi của lý thuyết đồng tiến hóa thực vật-côn trùng của Ehrlich và Raven (51) là dự đoán rằng sự biến đổi về đa dạng trao đổi chất giữa các loài là nguyên nhân gây ra sự đa dạng hóa của các dòng thực vật. Tuy nhiên, trong năm mươi năm kể từ khi công bố công trình quan trọng này, giả thuyết này hiếm khi được kiểm chứng (52). Điều này phần lớn là do đặc điểm phát sinh loài của các đặc điểm trao đổi chất tương đương trên các dòng thực vật ở khoảng cách xa. Sự hiếm hoi này có thể được sử dụng để neo các phương pháp phân tích mục tiêu. Quy trình MS/MS hiện tại được xử lý bằng lý thuyết thông tin định lượng sự tương đồng cấu trúc MS/MS của các chất chuyển hóa chưa biết (không cần lựa chọn chất chuyển hóa trước đó) và chuyển đổi các MS/MS này thành một tập hợp các MS/MS, do đó trong quá trình trao đổi chất chuyên nghiệp, các mô hình tiến hóa vĩ mô này được so sánh trên thang phân loại. Các chỉ số thống kê đơn giản. Quá trình này tương tự như phân tích phát sinh loài, có thể sử dụng sự sắp xếp trình tự để định lượng tốc độ đa dạng hóa hoặc tiến hóa đặc điểm mà không cần dự đoán trước.
Ở cấp độ sinh hóa, giả thuyết sàng lọc của Firn và Jones (53) cho thấy sự đa dạng chuyển hóa được duy trì ở các cấp độ khác nhau để cung cấp nguyên liệu thô nhằm thực hiện các hoạt động sinh học của các chất chuyển hóa không liên quan hoặc thay thế trước đó. Các phương pháp lý thuyết thông tin cung cấp một khuôn khổ trong đó các chuyển đổi tiến hóa đặc hiệu chất chuyển hóa xảy ra trong quá trình chuyên môn hóa chất chuyển hóa có thể được định lượng như một phần của quá trình sàng lọc tiến hóa được đề xuất: sự thích nghi hoạt động sinh học từ tính đặc hiệu thấp đến tính đặc hiệu cao. Các chất chuyển hóa bị ức chế của một môi trường nhất định.
Tóm lại, trong những ngày đầu của sinh học phân tử, các lý thuyết quan trọng về phòng vệ thực vật đã được phát triển, và các phương pháp dựa trên giả thuyết suy luận được coi là phương tiện duy nhất để tiến bộ khoa học. Điều này phần lớn là do những hạn chế về mặt kỹ thuật trong việc đo lường toàn bộ hệ thống chuyển hóa. Mặc dù các phương pháp dựa trên giả thuyết đặc biệt hữu ích trong việc lựa chọn các cơ chế nhân quả khác, nhưng khả năng thúc đẩy sự hiểu biết của chúng ta về mạng lưới sinh hóa bị hạn chế hơn so với các phương pháp tính toán hiện có trong khoa học dữ liệu chuyên sâu đương đại. Do đó, các lý thuyết không thể dự đoán được nằm ngoài phạm vi dữ liệu hiện có, vì vậy chu kỳ công thức/kiểm tra giả thuyết về tiến bộ trong lĩnh vực nghiên cứu không thể bị bãi bỏ (4). Chúng tôi dự đoán rằng quy trình tính toán của chuyển hóa học được giới thiệu ở đây có thể khơi dậy sự quan tâm đến các vấn đề gần đây (như thế nào) và cuối cùng (tại sao) về sự đa dạng chuyển hóa, và đóng góp vào một kỷ nguyên mới của khoa học dữ liệu được hướng dẫn bởi lý thuyết. Kỷ nguyên này đã xem xét lại các lý thuyết quan trọng đã truyền cảm hứng cho các thế hệ trước.
Thí nghiệm cho ăn trực tiếp bằng thực vật được thực hiện bằng cách nuôi ấu trùng giai đoạn 2 hoặc ấu trùng giai đoạn 1 trên một lá cây nắp ấm màu nhạt của một cây hoa hồng đang nở hoa, với 10 lần lặp lại trên mỗi cây. Ấu trùng côn trùng được kẹp lại bằng kẹp, và mô lá còn lại được thu thập sau 24 và 72 giờ sau khi nhiễm bệnh, sau đó được đông lạnh nhanh và chiết xuất các chất chuyển hóa.
Mô phỏng quá trình xử lý bằng động vật ăn cỏ theo cách đồng bộ cao. Phương pháp là sử dụng bánh xe mẫu vải để đâm thủng ba hàng gai ở mỗi bên gân giữa của ba lá đã phát triển hoàn toàn của cây trong giai đoạn phát triển của vòng hoa vải, và ngay lập tức bôi dung dịch Ms pha loãng 1:5. Hoặc dùng ngón tay đeo găng để đưa S1 OS vào vết đâm thủng. Thu hoạch và xử lý lá như mô tả ở trên. Sử dụng phương pháp đã mô tả trước đó để chiết xuất các chất chuyển hóa chính và hormone thực vật (54).
Đối với ứng dụng JA ngoại sinh, ba lá cuống của mỗi trong sáu cây hoa hồng đang nở hoa của mỗi loài được xử lý bằng 20μl hỗn hợp lanolin chứa 150μg MeJA (Lan + MeJA), và 20μl lanolin kết hợp với xử lý vết thương (Lan + W), hoặc sử dụng 20μl lanolin nguyên chất làm đối chứng. Lá được thu hoạch 72 giờ sau khi xử lý, đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng và bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng.
Bốn dòng chuyển gen JA và ET, cụ thể là irAOC (36), irCOI1 (55), irACO và sETR1 (48), đã được xác định trong nhóm nghiên cứu của chúng tôi. irAOC cho thấy sự giảm mạnh nồng độ JA và JA-Ile, trong khi irCOI1 không nhạy cảm với JA. So với EV, sự tích lũy JA-Ile tăng lên. Tương tự, irACO sẽ làm giảm sản xuất ET, và so với EV, sETR1, không nhạy cảm với ET, sẽ làm tăng sản xuất ET.
Máy đo quang phổ laser quang âm (cảm biến ET thời gian thực Sensor Sense ETD-300) được sử dụng để thực hiện phép đo ET không xâm lấn. Ngay sau khi xử lý, một nửa số lá được cắt và chuyển vào lọ thủy tinh kín 4 ml, và không gian phía trên được để tích tụ trong vòng 5 giờ. Trong quá trình đo, mỗi lọ được sục khí với lưu lượng 2 lít/giờ trong 8 phút, luồng khí này trước đó đã đi qua chất xúc tác do Sensor Sense cung cấp để loại bỏ CO2 và nước.
Dữ liệu microarray ban đầu được công bố trong (35) và được lưu trữ trong Cơ sở dữ liệu toàn diện về biểu hiện gen của Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia (NCBI) (số hiệu truy cập GSE30287). Dữ liệu tương ứng với lá bị ảnh hưởng bởi phương pháp xử lý W + OSMs và đối chứng không bị hư hại đã được trích xuất cho nghiên cứu này. Cường độ thô là log2. Trước khi phân tích thống kê, đường cơ sở đã được chuyển đổi và chuẩn hóa thành phân vị thứ 75 bằng cách sử dụng gói phần mềm R.
Dữ liệu giải trình tự RNA (RNA-seq) gốc của loài Nicotiana được lấy từ Kho lưu trữ đọc ngắn NCBI (SRA), số dự án là PRJNA301787, được báo cáo bởi Zhou et al. (39) và tiến hành như mô tả trong (56). Dữ liệu thô được xử lý bởi W + W, W + OSM và W + OSS1 tương ứng với loài Nicotiana đã được chọn để phân tích trong nghiên cứu này và được xử lý theo cách sau: Đầu tiên, các bản đọc RNA-seq thô được chuyển đổi thành định dạng FASTQ. HISAT2 chuyển đổi FASTQ thành SAM và SAMtools chuyển đổi các tệp SAM thành các tệp BAM đã được sắp xếp. StringTie được sử dụng để tính toán biểu hiện gen và phương pháp biểu thị của nó là có các đoạn trên nghìn base trên một triệu đoạn phiên mã được giải trình tự.
Cột sắc ký Acclaim (150 mm x 2,1 mm; kích thước hạt 2,2 μm) được sử dụng trong phân tích và cột bảo vệ 4 mm x 4 mm đều được làm từ cùng một vật liệu. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cực cao (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 sử dụng gradient nhị phân như sau: từ 0 đến 0,5 phút, đẳng dòng 90% A [nước khử ion, 0,1% (v/v) acetonitrile và 0,05% axit formic], 10% B (Acetonitrile và 0,05% axit formic); từ 0,5 đến 23,5 phút, pha gradient lần lượt là 10% A và 90% B; từ 23,5 đến 25 phút, đẳng dòng 10% A và 90% B. Tốc độ dòng chảy là 400 μl/phút. Đối với tất cả các phân tích MS, bơm dung dịch rửa giải từ cột vào máy phân tích tứ cực và thời gian bay (qTOF) được trang bị nguồn phun điện hoạt động ở chế độ ion hóa dương (điện áp mao dẫn, 4500 V; đầu ra mao dẫn 130 V; nhiệt độ sấy 200°C; lưu lượng khí sấy 10 lít/phút).
Thực hiện phân tích mảnh MS/MS (sau đây gọi tắt là MS/MS) không liên quan hoặc không thể phân biệt được với dữ liệu để thu được thông tin cấu trúc về hồ sơ chuyển hóa tổng thể có thể phát hiện được. Khái niệm của phương pháp MS/MS không phân biệt dựa trên thực tế là bộ tứ cực có cửa sổ cách ly khối lượng rất lớn [do đó, coi tất cả các tín hiệu tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) là các mảnh]. Vì lý do này, do thiết bị Impact II không thể tạo ra độ nghiêng CE, nên một số phân tích độc lập đã được thực hiện bằng cách sử dụng các giá trị năng lượng va chạm phân ly do va chạm (CE) tăng lên. Tóm lại, trước tiên hãy phân tích mẫu bằng UHPLC-ion hóa phun điện/qTOF-MS sử dụng chế độ phổ khối đơn (điều kiện phân mảnh thấp được tạo ra bởi sự phân mảnh trong nguồn), quét từ m/z 50 đến 1500 ở tần số lặp lại 5 Hz. Sử dụng nitơ làm khí va chạm cho phân tích MS/MS và thực hiện các phép đo độc lập ở bốn điện áp phân ly do va chạm khác nhau sau đây: 20, 30, 40 và 50 eV. Trong suốt quá trình đo, bộ tứ cực có cửa sổ cách ly khối lượng lớn nhất, từ m/z 50 đến 1500. Khi thí nghiệm m/z thân trước và độ rộng cách ly được đặt thành 200, phạm vi khối lượng sẽ được phần mềm vận hành của thiết bị tự động kích hoạt và 0 Da. Quét các mảnh khối lượng như trong chế độ khối lượng đơn. Sử dụng natri formate (50 ml isopropanol, 200 μl axit formic và 1 ml dung dịch NaOH 1M) để hiệu chuẩn khối lượng. Sử dụng thuật toán hiệu chuẩn độ chính xác cao của Bruker, tệp dữ liệu được hiệu chuẩn sau khi chạy phổ trung bình trong một khoảng thời gian nhất định. Sử dụng chức năng xuất của phần mềm Phân tích Dữ liệu v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Đức) để chuyển đổi các tệp dữ liệu thô sang định dạng NetCDF. Bộ dữ liệu MS/MS đã được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu chuyển hóa học mở MetaboLights (www.ebi.ac.uk) với mã số truy cập MTBLS1471.
Việc lắp ráp MS/MS có thể được thực hiện thông qua phân tích tương quan giữa tín hiệu MS1 và tín hiệu chất lượng MS/MS cho năng lượng va chạm thấp và cao cùng với các quy tắc mới được triển khai. Tập lệnh R được sử dụng để thực hiện phân tích tương quan về sự phân bố tiền chất thành sản phẩm, và tập lệnh C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) được sử dụng để triển khai các quy tắc.
Để giảm thiểu lỗi dương tính giả do nhiễu nền và lỗi tương quan giả do chỉ phát hiện một số đặc điểm m/z nhất định trong một vài mẫu, chúng tôi sử dụng hàm “filled peak” của gói R XCMS (để hiệu chỉnh nhiễu nền) nhằm thay thế cường độ “NA” (đỉnh không được phát hiện). Khi sử dụng hàm fill peak, vẫn còn nhiều giá trị cường độ “0” trong tập dữ liệu sẽ ảnh hưởng đến phép tính tương quan. Sau đó, chúng tôi so sánh kết quả xử lý dữ liệu thu được khi sử dụng hàm fill peak và khi không sử dụng hàm fill peak, tính toán giá trị nhiễu nền dựa trên giá trị ước tính hiệu chỉnh trung bình, rồi thay thế các giá trị cường độ 0 này bằng giá trị nền đã tính toán. Chúng tôi cũng chỉ xem xét các đặc điểm có cường độ vượt quá ba lần giá trị nền và coi chúng là “đỉnh thực”. Đối với các phép tính PCC, chỉ xem xét các tín hiệu m/z của tiền chất mẫu (MS1) và tập dữ liệu mảnh vỡ có ít nhất tám đỉnh thực.
Nếu cường độ của đặc điểm chất lượng tiền chất trong toàn bộ mẫu có tương quan đáng kể với cường độ giảm của cùng đặc điểm chất lượng đó khi chịu năng lượng va chạm thấp hoặc cao, và đặc điểm đó không được CAMERA dán nhãn là đỉnh đồng vị, thì nó có thể được xác định rõ hơn. Sau đó, bằng cách tính toán tất cả các cặp tiền chất-sản phẩm có thể có trong vòng 3 giây (khoảng thời gian lưu giữ ước tính cho sự lưu giữ đỉnh), phân tích tương quan được thực hiện. Chỉ khi giá trị m/z thấp hơn giá trị tiền chất và sự phân mảnh MS/MS xảy ra ở cùng vị trí mẫu trong tập dữ liệu với tiền chất mà nó được tạo ra, thì nó mới được coi là một mảnh.
Dựa trên hai quy tắc đơn giản này, chúng tôi loại trừ các mảnh vỡ được chỉ định có giá trị m/z lớn hơn m/z của tiền chất đã được xác định, và dựa trên vị trí mẫu nơi tiền chất xuất hiện và mảnh vỡ được chỉ định. Cũng có thể chọn các đặc điểm chất lượng được tạo ra bởi nhiều mảnh vỡ trong nguồn được tạo ra ở chế độ MS1 làm tiền chất ứng cử viên, do đó tạo ra các hợp chất MS/MS dư thừa. Để giảm sự dư thừa dữ liệu này, nếu độ tương đồng NDP của các phổ vượt quá 0,6 và chúng thuộc về sắc ký đồ “pcgroup” được chú thích bởi CAMERA, chúng tôi sẽ hợp nhất chúng. Cuối cùng, chúng tôi hợp nhất tất cả bốn kết quả CE liên quan đến tiền chất và các mảnh vỡ thành phổ tổng hợp đã được giải mã cuối cùng bằng cách chọn đỉnh có cường độ cao nhất trong số tất cả các đỉnh ứng cử viên có cùng giá trị m/z ở các năng lượng va chạm khác nhau. Các bước xử lý tiếp theo dựa trên khái niệm phổ tổng hợp và có tính đến các điều kiện CE khác nhau cần thiết để tối đa hóa xác suất phân mảnh, bởi vì một số mảnh vỡ chỉ có thể được phát hiện dưới một năng lượng va chạm cụ thể.
RDPI (30) được sử dụng để tính toán khả năng cảm ứng của hồ sơ chuyển hóa. Sự đa dạng của phổ chuyển hóa (chỉ số Hj) được lấy từ sự phong phú của tiền chất MS/MS bằng cách sử dụng entropy Shannon của phân bố tần số MS/MS bằng phương trình sau được mô tả bởi Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) trong đó Pij tương ứng với tần số tương đối của MS/MS thứ i trong mẫu thứ j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Độ đặc hiệu chuyển hóa (chỉ số Si) được định nghĩa là độ tương đồng về biểu hiện của một MS/MS nhất định so với tần suất xuất hiện giữa các mẫu được xem xét. Độ đặc hiệu MS/MS được tính bằng công thức Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Sử dụng công thức sau để đo chỉ số δj đặc hiệu cho hệ chuyển hóa của mỗi mẫu j và giá trị trung bình của độ đặc hiệu MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Các phổ MS/MS được ghép thành từng cặp, và độ tương đồng được tính toán dựa trên hai điểm số. Đầu tiên, sử dụng phương pháp NDP chuẩn (còn được gọi là phương pháp tương quan cosin), sử dụng phương trình sau để tính điểm độ tương đồng giữa các phân đoạn phổ: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 trong đó S1 và S2 tương ứng. Đối với phổ 1 và phổ 2, cũng như WS1, i và WS2, i biểu thị trọng số dựa trên cường độ đỉnh mà sự khác biệt của đỉnh chung thứ i giữa hai phổ nhỏ hơn 0,01 Da. Trọng số được tính như sau: W = [cường độ đỉnh] m [chất lượng] n, m = 0,5, n = 2, theo đề xuất của MassBank.
Một phương pháp chấm điểm thứ hai đã được triển khai, liên quan đến việc phân tích NL được chia sẻ giữa MS/MS. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã sử dụng 52 danh sách NL thường gặp trong quá trình phân mảnh MS song song và NL cụ thể hơn (tệp dữ liệu S1) đã được chú thích trước đó cho phổ MS/MS của các chất chuyển hóa thứ cấp của loài Nepenthes suy yếu (9, 26). Tạo một vectơ nhị phân gồm 1 và 0 cho mỗi MS/MS, tương ứng với sự hiện diện và không tồn tại của một số NL. Dựa trên độ tương đồng khoảng cách Euclidean, điểm số tương đồng NL được tính toán cho mỗi cặp vectơ NL nhị phân.
Để thực hiện phân cụm kép, chúng tôi đã sử dụng gói R DiffCoEx, dựa trên phần mở rộng của Phân tích đồng biểu hiện gen có trọng số (WGCNA). Sử dụng ma trận điểm NDP và NL của phổ MS/MS, chúng tôi đã sử dụng DiffCoEx để tính toán ma trận tương quan so sánh. Phân cụm nhị phân được thực hiện bằng cách đặt tham số “cutreeDynamic” thành method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T và minClusterSize = 10. Mã nguồn R của DiffCoEx được tải xuống từ tệp bổ sung 1 của Tesson et al. (57); Gói phần mềm R WGCNA cần thiết có thể được tìm thấy tại https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Để thực hiện phân tích mạng phân tử MS/MS, chúng tôi đã tính toán khả năng kết nối phổ theo cặp dựa trên các loại tương đồng NDP và NL, và sử dụng phần mềm Cytoscape để trực quan hóa cấu trúc mạng bằng cách sử dụng bố cục hữu cơ trong ứng dụng mở rộng thuật toán bố cục CyFilescape yFiles.
Sử dụng phần mềm R phiên bản 3.0.1 để thực hiện phân tích thống kê dữ liệu. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng phân tích phương sai hai chiều (ANOVA), tiếp theo là kiểm định hậu hoc Tukey's honestly significant difference (HSD). Để phân tích sự khác biệt giữa nhóm được xử lý bằng động vật ăn cỏ và nhóm đối chứng, phân bố hai phía của hai nhóm mẫu có cùng phương sai được phân tích bằng kiểm định t của Student.
Để xem tài liệu bổ sung cho bài viết này, vui lòng truy cập http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Đây là bài báo được truy cập mở, phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Creative Commons Ghi công phi thương mại, cho phép sử dụng, phân phối và sao chép trên mọi phương tiện, miễn là mục đích sử dụng cuối cùng không nhằm mục đích thương mại và giả định rằng tác phẩm gốc là chính xác. Tài liệu tham khảo.
Lưu ý: Chúng tôi chỉ yêu cầu bạn cung cấp địa chỉ email để người mà bạn giới thiệu đến trang này biết rằng bạn muốn họ xem email đó và đó không phải là thư rác. Chúng tôi sẽ không thu thập bất kỳ địa chỉ email nào.
Câu hỏi này được sử dụng để kiểm tra xem bạn có phải là khách truy cập hay không và ngăn chặn việc gửi thư rác tự động.
Lý thuyết thông tin cung cấp một thước đo chung để so sánh các hệ chuyển hóa đặc biệt và dự đoán các lý thuyết phòng thủ trong các bài kiểm tra.
Lý thuyết thông tin cung cấp một thước đo chung để so sánh các hệ chuyển hóa đặc biệt và dự đoán các lý thuyết phòng thủ trong các bài kiểm tra.
©2021 Hiệp hội vì sự tiến bộ của khoa học Hoa Kỳ. mọi quyền được bảo lưu. AAAS là đối tác của HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef và COUNTER. Khoa học nâng cao ISSN 2375-2548.