Trước đây, chúng tôi đã báo cáo rằng nồng độ trong huyết thanh của chất chuyển hóa tryptophan có nguồn gốc từ ruột là axit indole-3-propionic (IPA) thấp hơn ở bệnh nhân xơ gan. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã điều tra hệ gen biểu hiện và hệ gen methyl hóa DNA trong gan của người béo phì liên quan đến nồng độ IPA trong huyết thanh, cũng như vai trò của IPA trong việc gây ra sự bất hoạt kiểu hình của tế bào hình sao gan (HSC) trong ống nghiệm.
Nghiên cứu bao gồm 116 bệnh nhân béo phì không mắc đái tháo đường type 2 (T2DM) (tuổi trung bình 46,8 ± 9,3 năm; chỉ số BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) đã trải qua phẫu thuật giảm béo tại Trung tâm Phẫu thuật Giảm béo Kuopio (KOBS). Nồng độ IPA trong máu được đo bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), phân tích transcriptome gan được thực hiện bằng phương pháp giải trình tự RNA toàn phần, và phân tích methyl hóa DNA được thực hiện bằng chip Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Tế bào hình sao gan người (LX-2) được sử dụng cho các thí nghiệm trong ống nghiệm.
Nồng độ IPA trong huyết thanh tương quan với sự biểu hiện của các gen liên quan đến các con đường apoptosis, mitophagic và tuổi thọ trong gan. Gen AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) là gen tương tác phong phú và chiếm ưu thế nhất trong hồ sơ phiên mã và methyl hóa DNA của gan. Điều trị bằng IPA gây ra apoptosis, làm giảm hô hấp ty thể và làm thay đổi hình thái tế bào và động lực học ty thể bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các gen được biết là điều hòa xơ hóa, apoptosis và sự sống sót của tế bào LX-2.
Tóm lại, những dữ liệu này ủng hộ quan điểm rằng IPA có tiềm năng tác dụng điều trị và có thể gây ra hiện tượng apoptosis (chết tế bào theo chương trình) và chuyển đổi kiểu hình tế bào HSC sang trạng thái không hoạt động, từ đó mở rộng khả năng ức chế xơ gan bằng cách can thiệp vào quá trình hoạt hóa tế bào HSC và chuyển hóa ty thể.
Tỷ lệ béo phì và hội chứng chuyển hóa ngày càng tăng có liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh gan nhiễm mỡ do chuyển hóa (MASLD); bệnh này ảnh hưởng đến 25% đến 30% dân số nói chung [1]. Hậu quả chính của nguyên nhân MASLD là xơ gan, một quá trình động đặc trưng bởi sự tích tụ liên tục của chất nền ngoại bào dạng sợi (ECM) [2]. Các tế bào chính tham gia vào quá trình xơ gan là tế bào hình sao gan (HSC), chúng thể hiện bốn kiểu hình đã biết: không hoạt động, hoạt động, bất hoạt và lão hóa [3, 4]. HSC có thể được hoạt hóa và chuyển biệt hóa từ dạng không hoạt động thành các tế bào giống nguyên bào sợi tăng sinh với nhu cầu năng lượng cao, với sự biểu hiện tăng lên của actin cơ trơn α (α-SMA) và collagen loại I (Col-I) [5, 6]. Trong quá trình đảo ngược xơ gan, các HSC hoạt động sẽ bị loại bỏ thông qua quá trình apoptosis hoặc bất hoạt. Các quá trình này bao gồm việc giảm điều hòa các gen gây xơ hóa và điều hòa các gen hỗ trợ sự sống còn (chẳng hạn như các con đường tín hiệu NF-κB và PI3K/Akt) [7, 8], cũng như những thay đổi về động lực và chức năng của ty thể [9].
Nồng độ trong huyết thanh của chất chuyển hóa tryptophan indole-3-propionic acid (IPA), được sản xuất trong ruột, đã được phát hiện là giảm ở các bệnh chuyển hóa ở người bao gồm MASLD [10–13]. IPA có liên quan đến lượng chất xơ trong chế độ ăn, được biết đến với tác dụng chống oxy hóa và chống viêm, và làm giảm kiểu hình viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) do chế độ ăn gây ra trên cơ thể sống và trong ống nghiệm [11–14]. Một số bằng chứng đến từ nghiên cứu trước đây của chúng tôi, cho thấy nồng độ IPA trong huyết thanh thấp hơn ở bệnh nhân xơ gan so với bệnh nhân béo phì không bị xơ gan trong Nghiên cứu Phẫu thuật Bariatric Kuopio (KOBS). Hơn nữa, chúng tôi đã chỉ ra rằng điều trị bằng IPA có thể làm giảm biểu hiện của các gen là dấu hiệu kinh điển của sự bám dính tế bào, di chuyển tế bào và hoạt hóa tế bào gốc tạo máu trong mô hình tế bào hình sao gan người (LX-2) và là một chất chuyển hóa có khả năng bảo vệ gan [15]. Tuy nhiên, cơ chế IPA gây thoái hóa xơ gan bằng cách kích hoạt quá trình apoptosis của tế bào HSC và năng lượng sinh học của ty thể vẫn chưa rõ ràng.
Tại đây, chúng tôi chứng minh rằng IPA trong huyết thanh có liên quan đến sự biểu hiện của các gen được làm giàu trong các con đường apoptosis, mitophagy và tuổi thọ ở gan của những người béo phì nhưng không mắc bệnh tiểu đường loại 2 (KOBS). Hơn nữa, chúng tôi nhận thấy rằng IPA có thể gây ra sự thanh thải và thoái hóa các tế bào gốc tạo máu (HSC) đã hoạt hóa thông qua con đường bất hoạt. Những kết quả này tiết lộ một vai trò mới của IPA, biến nó thành một mục tiêu điều trị tiềm năng để thúc đẩy sự thoái triển xơ gan.
Một nghiên cứu trước đây trong nhóm KOBS cho thấy bệnh nhân xơ gan có nồng độ IPA lưu hành thấp hơn so với bệnh nhân không bị xơ gan [15]. Để loại trừ tác động gây nhiễu tiềm tàng của bệnh tiểu đường loại 2, chúng tôi đã tuyển chọn 116 bệnh nhân béo phì không mắc bệnh tiểu đường loại 2 (tuổi trung bình ± độ lệch chuẩn: 46,8 ± 9,3 năm; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Bảng 1) từ nghiên cứu KOBS đang diễn ra làm quần thể nghiên cứu [16]. Tất cả những người tham gia đều đã ký giấy đồng ý tham gia nghiên cứu và đề cương nghiên cứu đã được Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Quận Bắc Savo phê duyệt theo Tuyên bố Helsinki (54/2005, 104/2008 và 27/2010).
Các mẫu sinh thiết gan được lấy trong quá trình phẫu thuật bariatric và được các nhà bệnh lý học giàu kinh nghiệm đánh giá về mặt mô học theo các tiêu chí đã được mô tả trước đây [17, 18]. Các tiêu chí đánh giá được tóm tắt trong Bảng bổ sung S1 và đã được mô tả trước đây [19].
Các mẫu huyết thanh lúc đói được phân tích bằng sắc ký lỏng-khối phổ không định hướng (LC-MS) để phân tích chuyển hóa (n = 116). Các mẫu được phân tích bằng hệ thống UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Đức) như đã mô tả trước đây19. Việc xác định isopropyl alcohol (IPA) dựa trên thời gian lưu và so sánh phổ MS/MS với các tiêu chuẩn tinh khiết. Cường độ tín hiệu IPA (diện tích đỉnh) được xem xét trong tất cả các phân tích tiếp theo [20].
Trình tự RNA toàn bộ gan được thực hiện bằng Illumina HiSeq 2500 và dữ liệu được xử lý trước như đã mô tả trước đây [19, 21, 22]. Chúng tôi đã thực hiện phân tích biểu hiện khác biệt có mục tiêu của các bản sao ảnh hưởng đến chức năng/sinh tổng hợp ty thể bằng cách sử dụng 1957 gen được chọn từ cơ sở dữ liệu MitoMiner 4.0 [ 23 ]. Phân tích methylation DNA gan được thực hiện bằng cách sử dụng Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) bằng phương pháp tương tự như đã mô tả trước đây [24, 25].
Tế bào hình sao gan người (LX-2) được Giáo sư Stefano Romeo cung cấp và được nuôi cấy, duy trì trong môi trường DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Để chọn liều IPA thích hợp, tế bào LX-2 được xử lý với các nồng độ IPA khác nhau (10 μM, 100 μM và 1 mM; Sigma, 220027) trong môi trường DMEM/F12 trong 24 giờ. Hơn nữa, để nghiên cứu khả năng của IPA trong việc bất hoạt tế bào HSC, tế bào LX-2 được xử lý đồng thời với 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) và 1 mM IPA trong môi trường không chứa huyết thanh trong 24 giờ. Đối với nhóm chứng sử dụng dung dịch vận chuyển tương ứng, 4 nM HCl chứa 0,1% BSA được dùng để điều trị bằng TGF-β1 và 0,05% DMSO được dùng để điều trị bằng IPA, và cả hai được sử dụng cùng nhau cho liệu pháp kết hợp.
Quá trình apoptosis được đánh giá bằng cách sử dụng Bộ dụng cụ phát hiện apoptosis FITC Annexin V với 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Mã số sản phẩm 640922) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, tế bào LX-2 (1 × 10⁵ tế bào/giếng) được nuôi cấy qua đêm trong đĩa 12 giếng và sau đó được xử lý với nhiều liều IPA hoặc IPA và TGF-β1. Ngày hôm sau, các tế bào trôi nổi và bám dính được thu thập, xử lý bằng trypsin, rửa bằng PBS, huyền phù lại trong dung dịch đệm liên kết Annexin V và ủ với FITC-Annexin V và 7-AAD trong 15 phút.
Các ty thể trong tế bào sống được nhuộm màu để xác định hoạt động oxy hóa bằng cách sử dụng Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Đối với các xét nghiệm MTR, tế bào LX-2 được ủ ở mật độ bằng nhau với IPA và TGF-β1. Sau 24 giờ, các tế bào sống được xử lý bằng trypsin, rửa bằng PBS, và sau đó được ủ với 100 μM MTR trong môi trường không có huyết thanh ở 37 °C trong 20 phút như đã mô tả trước đây [ 26 ]. Để phân tích hình thái tế bào sống, kích thước tế bào và độ phức tạp của tế bào chất được phân tích bằng cách sử dụng các thông số tán xạ phía trước (FSC) và tán xạ bên (SSC) tương ứng.
Tất cả dữ liệu (30.000 sự kiện) được thu thập bằng NovoCyte Quanteon (Agilent) và được phân tích bằng phần mềm NovoExpress® 1.4.1 hoặc FlowJo V.10.
Tốc độ tiêu thụ oxy (OCR) và tốc độ axit hóa ngoại bào (ECAR) được đo trong thời gian thực bằng cách sử dụng Máy phân tích dòng ngoại bào Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) được trang bị Seahorse XF Cell Mito Stress theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, 2 × 104 tế bào LX-2/giếng được gieo lên đĩa nuôi cấy tế bào XF96. Sau khi ủ qua đêm, các tế bào được xử lý bằng isopropanol (IPA) và TGF-β1 (Phương pháp bổ sung 1). Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm Seahorse XF Wave, bao gồm Trình tạo báo cáo thử nghiệm kiểu hình năng lượng tế bào Seahorse XF. Từ đó, Chỉ số sức khỏe sinh năng lượng (BHI) được tính toán [27].
Tổng RNA được phiên mã thành cDNA. Để biết các phương pháp cụ thể, xem tài liệu tham khảo [15]. Mức độ mRNA của protein axit ribosomal 60S P0 (RPLP0) và cyclophilin A1 (PPIA) của người được sử dụng làm gen đối chứng. Hệ thống PCR thời gian thực QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Hà Lan) được sử dụng với bộ kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) hoặc bộ kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), và mức độ biểu hiện gen tương đối được tính toán bằng cách sử dụng các thông số chu kỳ giá trị Ct so sánh (ΔΔCt) và phương pháp ∆∆Ct. Chi tiết về các mồi được cung cấp trong Bảng bổ sung S2 và S3.
DNA nhân (ncDNA) và DNA ty thể (mtDNA) được chiết xuất bằng bộ kit DNeasy blood and tissue (Qiagen) như đã mô tả trước đây [28]. Lượng mtDNA tương đối được tính bằng cách tính tỷ lệ của từng vùng mtDNA mục tiêu so với trung bình hình học của ba vùng DNA nhân (mtDNA/ncDNA), như được trình bày chi tiết trong Phương pháp bổ sung 2. Chi tiết về các mồi cho mtDNA và ncDNA được cung cấp trong Bảng bổ sung S4.
Các tế bào sống được nhuộm bằng Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) để hình dung mạng lưới ty thể giữa các tế bào và bên trong tế bào. Tế bào LX-2 (1 × 104 tế bào/giếng) được nuôi cấy trên lam kính trong các đĩa nuôi cấy đáy kính tương ứng (Ibidi GmbH, Martinsried, Đức). Sau 24 giờ, các tế bào LX-2 sống được ủ với 100 μM MTR trong 20 phút ở 37 °C và nhân tế bào được nhuộm bằng DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) như đã mô tả trước đây [29]. Mạng lưới ty thể được quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Đức) được trang bị mô-đun confocal Zeiss LSM 800 ở 37 °C trong môi trường ẩm với 5% CO2 sử dụng vật kính 63×NA 1.3. Chúng tôi đã thu được mười hình ảnh chuỗi Z cho mỗi loại mẫu. Mỗi chuỗi Z chứa 30 phần, mỗi phần có độ dày 9,86 μm. Đối với mỗi mẫu, hình ảnh của mười trường nhìn khác nhau đã được thu thập bằng phần mềm ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Đức) và phân tích hình thái ty thể được thực hiện bằng phần mềm ImageJ (v1.54d) [30, 31] theo các thông số được nêu chi tiết trong Phương pháp bổ sung 3.
Các tế bào được cố định bằng dung dịch glutaraldehyde 2% trong dung dịch đệm phosphate 0,1 M, tiếp theo là cố định bằng dung dịch osmium tetroxide 1% (Sigma Aldrich, MO, USA), khử nước dần bằng acetone (Merck, Darmstadt, Đức), và cuối cùng được nhúng trong nhựa epoxy. Các lát cắt siêu mỏng được chuẩn bị và nhuộm bằng dung dịch uranyl acetate 1% (Merck, Darmstadt, Đức) và dung dịch chì citrate 1% (Merck, Darmstadt, Đức). Hình ảnh siêu cấu trúc được thu प्राप्त bằng kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Nhật Bản) ở điện áp gia tốc 80 kV.
Hình thái của tế bào LX-2 được xử lý bằng IPA trong 24 giờ được phân tích bằng kính hiển vi tương phản pha ở độ phóng đại 50x sử dụng kính hiển vi ánh sáng ngược Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 và AxioCam MRm, Jena, Đức).
Dữ liệu lâm sàng được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn hoặc trung vị (khoảng tứ phân vị: IQR). Phân tích phương sai một chiều (đối với biến liên tục) hoặc kiểm định χ² (đối với biến phân loại) được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa ba nhóm nghiên cứu. Tỷ lệ dương tính giả (FDR) được sử dụng để hiệu chỉnh cho việc kiểm định đa biến, và các gen có FDR < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Phân tích tương quan Spearman được sử dụng để tương quan giữa sự methyl hóa DNA CpG với cường độ tín hiệu IPA, với các giá trị p danh nghĩa (p < 0,05) được báo cáo.
Phân tích đường dẫn tín hiệu được thực hiện bằng công cụ phân tích tập hợp gen trực tuyến (WebGestalt) cho 268 bản sao (p danh nghĩa < 0,01), 119 bản sao liên quan đến ty thể (p danh nghĩa < 0,05) và 4350 vị trí CpG trong số 3093 bản sao gan có liên quan đến nồng độ IPA trong huyết thanh. Công cụ Venny DB (phiên bản 2.1.0) có sẵn miễn phí được sử dụng để tìm các gen trùng lặp, và StringDB (phiên bản 11.5) được sử dụng để trực quan hóa tương tác protein-protein.
Đối với thí nghiệm LX-2, các mẫu được kiểm tra tính chuẩn bằng phép thử D'Agostino-Pearson. Dữ liệu được thu thập từ ít nhất ba lần lặp lại sinh học và được phân tích bằng ANOVA một chiều với phép thử hậu kiểm Bonferroni. Giá trị p nhỏ hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, và số lượng thí nghiệm được chỉ ra trong mỗi hình. Tất cả các phân tích và biểu đồ được thực hiện bằng phần mềm thống kê GraphPad Prism 8 dành cho Windows (GraphPad Software Inc., phiên bản 8.4.3, San Diego, Hoa Kỳ).
Đầu tiên, chúng tôi đã điều tra mối liên hệ giữa nồng độ IPA trong huyết thanh với các bản sao mã gen ở gan, toàn cơ thể và ty thể. Trong hồ sơ bản sao mã gen tổng thể, gen có liên quan mạnh nhất với nồng độ IPA trong huyết thanh là MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3); trong hồ sơ bản sao mã gen liên quan đến ty thể, gen có liên quan mạnh nhất là AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Tệp bổ sung 1 và Tệp bổ sung 2).
Sau đó, chúng tôi đã phân tích các bản sao toàn cầu (n = 268; p < 0,01) và các bản sao liên quan đến ty thể (n = 119; p < 0,05), cuối cùng xác định apoptosis là con đường chính tắc quan trọng nhất (p = 0,0089). Đối với các bản sao ty thể liên quan đến nồng độ IPA trong huyết thanh, chúng tôi tập trung vào apoptosis (FDR = 0,00001), mitophagy (FDR = 0,00029) và các con đường tín hiệu TNF (FDR = 0,000006) (Hình 1A, Bảng 2 và Hình bổ sung 1A-B).
Phân tích chồng chéo các bản sao toàn cầu, bản sao liên quan đến ty thể và sự methyl hóa DNA trong gan người liên quan đến nồng độ IPA trong huyết thanh. A thể hiện 268 bản sao toàn cầu, 119 bản sao liên quan đến ty thể và bản sao methyl hóa DNA được ánh xạ đến 3092 vị trí CpG liên quan đến nồng độ IPA trong huyết thanh (giá trị p < 0,01 đối với bản sao toàn cầu và bản sao methyl hóa DNA, và giá trị p < 0,05 đối với bản sao ty thể). Các bản sao chồng chéo chính được hiển thị ở giữa (AKT1 và YKT6). B Bản đồ tương tác của 13 gen có điểm tương tác cao nhất (0,900) với các gen khác được xây dựng từ 56 gen chồng chéo (vùng đường màu đen) có liên quan đáng kể đến nồng độ IPA trong huyết thanh bằng công cụ trực tuyến StringDB. Màu xanh lá cây: Các gen được ánh xạ đến thành phần tế bào Gene Ontology (GO): ty thể (GO:0005739). AKT1 là protein có điểm số cao nhất (0,900) về tương tác với các protein khác dựa trên dữ liệu (dựa trên khai thác văn bản, thí nghiệm, cơ sở dữ liệu và biểu hiện đồng thời). Các nút mạng đại diện cho các protein, và các cạnh đại diện cho các kết nối giữa các protein.
Vì các chất chuyển hóa của hệ vi sinh vật đường ruột có thể điều chỉnh thành phần biểu sinh thông qua quá trình methyl hóa DNA [32], chúng tôi đã điều tra xem liệu nồng độ IPA trong huyết thanh có liên quan đến quá trình methyl hóa DNA ở gan hay không. Chúng tôi nhận thấy rằng hai vị trí methyl hóa chính liên quan đến nồng độ IPA trong huyết thanh nằm gần vùng giàu proline-serine 3 (C19orf55) và thành viên 6 của họ protein sốc nhiệt B (nhỏ) (HSPB6) (Tệp bổ sung 3). Quá trình methyl hóa DNA của 4350 CpG (p < 0,01) có tương quan với nồng độ IPA trong huyết thanh và được làm giàu trong các con đường điều hòa tuổi thọ (p = 0,006) (Hình 1A, Bảng 2 và Hình bổ sung 1C).
Để hiểu rõ các cơ chế sinh học underlying mối liên hệ giữa nồng độ IPA huyết thanh, các bản sao toàn cầu, các bản sao liên quan đến ty thể và sự methyl hóa DNA trong gan người, chúng tôi đã thực hiện phân tích chồng chéo các gen được xác định trong phân tích đường dẫn trước đó (Hình 1A). Kết quả phân tích làm giàu đường dẫn của 56 gen chồng chéo (bên trong đường màu đen trong Hình 1A) cho thấy đường dẫn apoptosis (p = 0,00029) làm nổi bật hai gen chung cho cả ba phân tích: AKT1 và YKT6 (đồng đẳng v-SNARE của YKT6), như được thể hiện trong biểu đồ Venn (Hình bổ sung 2 và Hình 1A). Điều thú vị là, chúng tôi nhận thấy rằng AKT1 (cg19831386) và YKT6 (cg24161647) có tương quan dương với nồng độ IPA huyết thanh (Tệp bổ sung 3). Để xác định các tương tác protein tiềm năng giữa các sản phẩm gen, chúng tôi đã chọn 13 gen có điểm vùng chung cao nhất (0,900) trong số 56 gen chồng chéo làm đầu vào và xây dựng bản đồ tương tác. Theo mức độ tin cậy (độ tin cậy biên), gen AKT1 có điểm số cao nhất (0,900) đứng đầu (Hình 1B).
Dựa trên phân tích con đường, chúng tôi nhận thấy rằng apoptosis là con đường chính, vì vậy chúng tôi đã điều tra xem liệu việc điều trị bằng IPA có ảnh hưởng đến apoptosis của HSC trong ống nghiệm hay không. Trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng các liều IPA khác nhau (10 μM, 100 μM và 1 mM) không độc hại đối với tế bào LX-2 [15]. Nghiên cứu này cho thấy rằng việc điều trị bằng IPA ở nồng độ 10 μM và 100 μM làm tăng số lượng tế bào sống và tế bào hoại tử. Tuy nhiên, so với nhóm đối chứng, khả năng sống của tế bào giảm ở nồng độ IPA 1 mM, trong khi tỷ lệ hoại tử tế bào vẫn không thay đổi (Hình 2A, B). Tiếp theo, để tìm nồng độ tối ưu để gây ra apoptosis trong tế bào LX-2, chúng tôi đã thử nghiệm IPA ở các nồng độ 10 μM, 100 μM và 1 mM trong 24 giờ (Hình 2A-E và Hình bổ sung 3A-B). Điều thú vị là, IPA 10 μM và 100 μM làm giảm tỷ lệ apoptosis (%), tuy nhiên, IPA 1 mM làm tăng apoptosis giai đoạn muộn và tỷ lệ apoptosis (%) so với nhóm đối chứng và do đó được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Hình 2A–D).
IPA gây ra hiện tượng apoptosis ở tế bào LX-2. Phương pháp nhuộm kép Annexin V và 7-AAD được sử dụng để định lượng tỷ lệ apoptosis và hình thái tế bào bằng phương pháp cytometry dòng chảy. Tế bào BA được ủ với 10 μM, 100 μM và 1 mM IPA trong 24 giờ hoặc với F–H TGF-β1 (5 ng/ml) và 1 mM IPA trong môi trường không có huyết thanh trong 24 giờ. A: tế bào sống (Annexin V -/ 7AAD-); B: tế bào hoại tử (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: giai đoạn sớm (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: giai đoạn muộn (Annexin V+/7AAD+); E, H: tỷ lệ phần trăm tổng số tế bào apoptosis giai đoạn sớm và muộn trong tỷ lệ apoptosis (%). Dữ liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 3 thí nghiệm độc lập. Các phép so sánh thống kê được thực hiện bằng phương pháp ANOVA một chiều với kiểm định hậu hoc Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Như chúng tôi đã chỉ ra trước đây, 5 ng/ml TGF-β1 có thể gây ra sự hoạt hóa HSC bằng cách tăng biểu hiện của các gen đánh dấu cổ điển [15]. Các tế bào LX-2 được xử lý kết hợp với 5 ng/ml TGF-β1 và 1 mM IPA (Hình 2E–H). Xử lý bằng TGF-β1 không làm thay đổi tỷ lệ apoptosis, tuy nhiên, việc điều trị kết hợp với IPA làm tăng apoptosis muộn và tỷ lệ apoptosis (%) so với xử lý bằng TGF-β1 (Hình 2E–H). Những kết quả này cho thấy 1 mM IPA có thể thúc đẩy apoptosis trong tế bào LX-2 một cách độc lập với sự cảm ứng của TGF-β1.
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của IPA đến hô hấp ty thể trong tế bào LX-2. Kết quả cho thấy 1 mM IPA làm giảm các thông số tốc độ tiêu thụ oxy (OCR): hô hấp không do ty thể, hô hấp cơ bản và tối đa, rò rỉ proton và sản xuất ATP so với nhóm đối chứng (Hình 3A, B), trong khi chỉ số sức khỏe sinh năng lượng (BHI) không thay đổi.
IPA làm giảm hô hấp ty thể trong tế bào LX-2. Đường cong hô hấp ty thể (OCR) được trình bày dưới dạng các thông số hô hấp ty thể (hô hấp không phải ty thể, hô hấp cơ bản, hô hấp tối đa, rò rỉ proton, tạo ATP, SRC và BHI). Tế bào A và B được ủ với 10 μM, 100 μM và 1 mM IPA trong 24 giờ. Tế bào C và D được ủ với TGF-β1 (5 ng/ml) và 1 mM IPA trong môi trường không có huyết thanh trong 24 giờ. Tất cả các phép đo đều được chuẩn hóa theo hàm lượng DNA bằng bộ kit CyQuant. BHI: chỉ số sức khỏe sinh năng lượng; SRC: khả năng dự trữ hô hấp; OCR: tốc độ tiêu thụ oxy. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD), n = 5 thí nghiệm độc lập. So sánh thống kê được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) và kiểm định hậu hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; và ***p < 0,001
Để hiểu rõ hơn về tác động của IPA lên hồ sơ năng lượng sinh học của tế bào LX-2 được hoạt hóa bởi TGF-β1, chúng tôi đã phân tích quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ty thể bằng OCR (Hình 3C,D). Kết quả cho thấy điều trị bằng TGF-β1 có thể làm giảm hô hấp tối đa, khả năng dự trữ hô hấp (SRC) và BHI so với nhóm đối chứng (Hình 3C,D). Ngoài ra, phương pháp điều trị kết hợp làm giảm hô hấp cơ bản, rò rỉ proton và sản xuất ATP, nhưng SRC và BHI cao hơn đáng kể so với nhóm chỉ được điều trị bằng TGF-β1 (Hình 3C,D).
Chúng tôi cũng đã thực hiện “Kiểm tra kiểu hình năng lượng tế bào” do phần mềm Seahorse cung cấp (Hình bổ sung 4A–D). Như thể hiện trong Hình bổ sung 3B, cả tiềm năng chuyển hóa OCR và ECAR đều giảm sau khi điều trị bằng TGF-β1, tuy nhiên, không có sự khác biệt nào được quan sát thấy ở nhóm điều trị kết hợp và nhóm điều trị bằng IPA so với nhóm đối chứng. Hơn nữa, cả mức độ OCR cơ bản và mức độ căng thẳng đều giảm sau khi điều trị kết hợp và điều trị bằng IPA so với nhóm đối chứng (Hình bổ sung 4C). Điều thú vị là, một mô hình tương tự đã được quan sát thấy với liệu pháp kết hợp, trong đó không có sự thay đổi nào về mức độ ECAR cơ bản và mức độ căng thẳng so với điều trị bằng TGF-β1 (Hình bổ sung 4C). Trong tế bào HSC, sự giảm phosphoryl hóa oxy hóa ty thể và khả năng của liệu pháp kết hợp để phục hồi SCR và BHI sau khi tiếp xúc với điều trị bằng TGF-β1 không làm thay đổi tiềm năng chuyển hóa (OCR và ECAR). Tóm lại, những kết quả này cho thấy IPA có thể làm giảm năng lượng sinh học trong tế bào gốc tạo máu (HSC), cho thấy IPA có thể tạo ra cấu hình năng lượng thấp hơn, làm chuyển dịch kiểu hình HSC theo hướng bất hoạt (Hình bổ sung 4D).
Tác dụng của IPA lên động lực học ty thể đã được nghiên cứu bằng cách định lượng ba chiều hình thái ty thể và các kết nối mạng lưới cũng như nhuộm MTR (Hình 4 và Hình bổ sung 5). Hình 4 cho thấy, so với nhóm đối chứng, điều trị bằng TGF-β1 làm giảm diện tích bề mặt trung bình, số lượng nhánh, tổng chiều dài nhánh và số lượng điểm nối nhánh (Hình 4A và B) và thay đổi tỷ lệ ty thể từ hình cầu sang hình thái trung gian (Hình 4C). Chỉ điều trị bằng IPA làm giảm thể tích ty thể trung bình và thay đổi tỷ lệ ty thể từ hình cầu sang hình thái trung gian so với nhóm đối chứng (Hình 4A). Ngược lại, độ cầu, chiều dài nhánh trung bình và hoạt động ty thể được đánh giá bằng MTR phụ thuộc vào điện thế màng ty thể (Hình 4A và E) vẫn không thay đổi và các thông số này không khác biệt giữa các nhóm. Tóm lại, những kết quả này cho thấy điều trị bằng TGF-β1 và IPA dường như điều chỉnh hình dạng và kích thước ty thể cũng như độ phức tạp của mạng lưới trong tế bào LX-2 sống.
IPA làm thay đổi động lực học ty thể và lượng DNA ty thể trong tế bào LX-2. A. Hình ảnh hiển vi confocal đại diện của tế bào LX-2 sống được ủ với TGF-β1 (5 ng/ml) và 1 mM IPA trong 24 giờ trong môi trường không có huyết thanh, cho thấy mạng lưới ty thể được nhuộm bằng Mitotracker™ Red CMXRos và nhân tế bào được nhuộm màu xanh lam bằng DAPI. Tất cả dữ liệu đều chứa ít nhất 15 hình ảnh cho mỗi nhóm. Chúng tôi đã thu được 10 hình ảnh Z-stack cho mỗi loại mẫu. Mỗi chuỗi trục Z chứa 30 lát cắt, mỗi lát có độ dày 9,86 μm. Thanh tỷ lệ: 10 μm. B. Các đối tượng đại diện (chỉ ty thể) được xác định bằng cách áp dụng ngưỡng thích ứng cho hình ảnh. Phân tích định lượng và so sánh các kết nối mạng lưới hình thái ty thể được thực hiện cho tất cả các tế bào trong mỗi nhóm. C. Tần suất tỷ lệ hình dạng ty thể. Giá trị gần 0 cho thấy hình dạng hình cầu, và giá trị gần 1 cho thấy hình dạng dạng sợi. D. Hàm lượng DNA ty thể (mtDNA) được xác định như mô tả trong phần Vật liệu và Phương pháp. E. Phân tích Mitotracker™ Red CMXRos được thực hiện bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (30.000 sự kiện) như mô tả trong phần Vật liệu và Phương pháp. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 3 thí nghiệm độc lập. So sánh thống kê được thực hiện bằng phương pháp ANOVA một chiều và kiểm định hậu hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Sau đó, chúng tôi đã phân tích hàm lượng mtDNA trong tế bào LX-2 như một chỉ số về số lượng ty thể. So với nhóm đối chứng, hàm lượng mtDNA tăng lên ở nhóm được điều trị bằng TGF-β1 (Hình 4D). So với nhóm được điều trị bằng TGF-β1, hàm lượng mtDNA giảm xuống ở nhóm điều trị kết hợp (Hình 4D), cho thấy IPA có thể làm giảm hàm lượng mtDNA và có thể cả số lượng ty thể cũng như hô hấp ty thể (Hình 3C). Hơn nữa, IPA dường như làm giảm hàm lượng mtDNA trong điều trị kết hợp nhưng không ảnh hưởng đến hoạt động ty thể do MTR điều hòa (Hình 4A–C).
Chúng tôi đã nghiên cứu mối liên hệ giữa IPA với mức độ mRNA của các gen liên quan đến xơ hóa, apoptosis, sự sống sót và động lực học ty thể trong tế bào LX-2 (Hình 5A–D). So với nhóm đối chứng, nhóm được điều trị bằng TGF-β1 cho thấy sự gia tăng biểu hiện của các gen như chuỗi α2 collagen loại I (COL1A2), actin cơ trơn α (αSMA), metalloproteinase ma trận 2 (MMP2), chất ức chế metalloproteinase mô 1 (TIMP1) và gen giống dynamin 1 (DRP1), cho thấy sự gia tăng xơ hóa và hoạt hóa. Hơn nữa, so với nhóm đối chứng, điều trị bằng TGF-β1 làm giảm mức độ mRNA của thụ thể pregnane X hạt nhân (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, chất ức chế α tế bào B, chất tăng cường peptide nhẹ gen yếu tố hạt nhân κ (NFκB1A) và chất ức chế tiểu đơn vị β kinase yếu tố hạt nhân κB (IKBKB) (Hình 5A–D). So với điều trị bằng TGF-β1, điều trị kết hợp TGF-β1 và IPA làm giảm biểu hiện của COL1A2 và MMP2, nhưng làm tăng mức độ mRNA của PXR, TIMP1, u lympho tế bào B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β và IKBKB. Điều trị bằng IPA làm giảm đáng kể sự biểu hiện của MMP2, protein liên kết Bcl-2 X (BAX), AKT1, protein teo thị giác 1 (OPA1) và protein hợp nhất ty thể 2 (MFN2), trong khi sự biểu hiện của CASP8, NFκB1A, NFκB1B và IKBKB tăng lên so với nhóm đối chứng. Tuy nhiên, không có sự khác biệt nào được tìm thấy trong sự biểu hiện của caspase-3 (CASP3), yếu tố hoạt hóa peptidase gây apoptosis 1 (APAF1), protein hợp nhất ty thể 1 (MFN1) và protein phân chia 1 (FIS1). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy điều trị bằng IPA điều chỉnh sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ hóa, apoptosis, sự sống sót và động lực học ty thể. Dữ liệu của chúng tôi cho thấy điều trị bằng IPA làm giảm xơ hóa trong tế bào LX-2; đồng thời, nó kích thích sự sống sót bằng cách chuyển dịch kiểu hình sang trạng thái bất hoạt.
IPA điều chỉnh sự biểu hiện của các gen liên quan đến nguyên bào sợi, apoptosis, khả năng sống sót và động lực học ty thể trong tế bào LX-2. Biểu đồ cột hiển thị sự biểu hiện mRNA so với đối chứng nội sinh (RPLP0 hoặc PPIA) sau khi tế bào LX-2 được kích thích bằng TGF-β1 và IPA trong môi trường không có huyết thanh trong 24 giờ. A biểu thị nguyên bào sợi, B biểu thị tế bào apoptosis, C biểu thị tế bào sống sót và D biểu thị sự biểu hiện gen động lực học ty thể. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD), n = 3 thí nghiệm độc lập. So sánh thống kê được thực hiện bằng phương pháp ANOVA một chiều và kiểm định hậu hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Tiếp theo, sự thay đổi về kích thước tế bào (FSC-H) và độ phức tạp của tế bào chất (SSC-H) được đánh giá bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (Hình 6A,B), và sự thay đổi về hình thái tế bào sau khi điều trị bằng IPA được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi tương phản pha (Hình bổ sung 6A-B). Đúng như dự đoán, các tế bào trong nhóm được điều trị bằng TGF-β1 tăng kích thước so với nhóm đối chứng (Hình 6A,B), cho thấy sự giãn nở điển hình của lưới nội chất thô (ER*) và thể thực bào (P), cho thấy sự hoạt hóa tế bào gốc tạo máu (HSC) (Hình bổ sung 6A). Tuy nhiên, so với nhóm được điều trị bằng TGF-β1, kích thước tế bào, độ phức tạp của tế bào chất (Hình 6A,B) và hàm lượng ER* giảm ở nhóm điều trị kết hợp TGF-β1 và IPA (Hình bổ sung 6A). Hơn nữa, việc điều trị bằng IPA làm giảm kích thước tế bào, độ phức tạp của tế bào chất (Hình 6A,B), hàm lượng P và ER* (Hình bổ sung 6A) so với nhóm đối chứng. Ngoài ra, hàm lượng tế bào chết theo chương trình tăng lên sau 24 giờ điều trị bằng IPA so với nhóm đối chứng (mũi tên trắng, Hình bổ sung 6B). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy 1 mM IPA có thể kích thích quá trình chết theo chương trình của tế bào gốc tạo máu (HSC) và đảo ngược những thay đổi về các thông số hình thái tế bào do TGF-β1 gây ra, từ đó điều chỉnh kích thước và độ phức tạp của tế bào, điều này có thể liên quan đến sự bất hoạt của HSC.
IPA làm thay đổi kích thước tế bào và độ phức tạp của bào tương trong tế bào LX-2. Hình ảnh đại diện của phân tích cytometry dòng chảy. Phân tích sử dụng chiến lược phân vùng đặc hiệu cho tế bào LX-2: SSC-A/FSC-A để xác định quần thể tế bào, FSC-H/FSC-A để xác định các tế bào kép, và SSC-H/FSC-H để phân tích kích thước và độ phức tạp của tế bào. Các tế bào được ủ với TGF-β1 (5 ng/ml) và 1 mM IPA trong môi trường không chứa huyết thanh trong 24 giờ. Tế bào LX-2 được phân bố vào góc phần tư dưới bên trái (SSC-H-/FSC-H-), góc phần tư trên bên trái (SSC-H+/FSC-H-), góc phần tư dưới bên phải (SSC-H-/FSC-H+), và góc phần tư trên bên phải (SSC-H+/FSC-H+) để phân tích kích thước tế bào và độ phức tạp của bào tương. B. Hình thái tế bào được phân tích bằng phương pháp đo lưu lượng tế bào sử dụng FSC-H (tán xạ phía trước, kích thước tế bào) và SSC-H (tán xạ bên, độ phức tạp của tế bào chất) (30.000 sự kiện). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 3 thí nghiệm độc lập. So sánh thống kê được thực hiện bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) và kiểm định hậu hoc Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 và ****p < 0,0001
Các chất chuyển hóa trong ruột như IPA đã trở thành một chủ đề nghiên cứu nóng hổi, ​​cho thấy rằng các mục tiêu mới có thể được phát hiện trong hệ vi sinh vật đường ruột. Do đó, thật thú vị khi IPA, một chất chuyển hóa mà chúng tôi đã liên kết với bệnh xơ gan ở người [15], đã được chứng minh là một hợp chất chống xơ gan tiềm năng trong các mô hình động vật [13, 14]. Ở đây, chúng tôi lần đầu tiên chứng minh mối liên hệ giữa IPA huyết thanh và phiên mã học gan toàn cầu và sự methyl hóa DNA ở những người béo phì không mắc bệnh tiểu đường loại 2 (T2D), làm nổi bật quá trình apoptosis, mitophagy và tuổi thọ, cũng như một gen ứng cử viên tiềm năng AKT1 điều chỉnh cân bằng nội môi của gan. Một điểm mới khác của nghiên cứu này là chúng tôi đã chứng minh sự tương tác của việc điều trị bằng IPA với quá trình apoptosis, hình thái tế bào, sinh năng lượng và động lực học ty thể trong tế bào LX-2, cho thấy phổ năng lượng thấp hơn làm dịch chuyển kiểu hình HSC về phía bất hoạt, khiến IPA trở thành một ứng cử viên tiềm năng để cải thiện bệnh xơ gan.
Chúng tôi nhận thấy rằng apoptosis, mitophagy và tuổi thọ là những con đường chính tắc quan trọng nhất được làm giàu trong các gen gan liên quan đến IPA huyết thanh lưu thông. Sự gián đoạn của hệ thống kiểm soát chất lượng ty thể (MQC) có thể dẫn đến rối loạn chức năng ty thể, mitophagy và apoptosis, do đó thúc đẩy sự xuất hiện của MASLD[33, 34]. Do đó, chúng ta có thể suy đoán rằng IPA có thể tham gia vào việc duy trì động lực tế bào và tính toàn vẹn của ty thể thông qua apoptosis, mitophagy và tuổi thọ ở gan. Dữ liệu của chúng tôi cho thấy hai gen phổ biến trong cả ba xét nghiệm: YKT6 và AKT1. Điều đáng chú ý là YKT6 là một protein SNARE tham gia vào quá trình hợp nhất màng tế bào. Nó đóng vai trò trong autophagy và mitophagy bằng cách tạo thành một phức hợp khởi đầu với STX17 và SNAP29 trên autophagosome, do đó thúc đẩy sự hợp nhất của autophagosome và lysosome[35]. Hơn nữa, mất chức năng YKT6 dẫn đến suy giảm quá trình tự thực bào ty thể [36], trong khi sự tăng cường biểu hiện của YKT6 có liên quan đến sự tiến triển của ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), cho thấy sự gia tăng khả năng sống sót của tế bào [37]. Mặt khác, AKT1 là gen tương tác quan trọng nhất và đóng vai trò quan trọng trong các bệnh về gan, bao gồm con đường tín hiệu PI3K/AKT, chu kỳ tế bào, di chuyển tế bào, tăng sinh, bám dính tiêu điểm, chức năng ty thể và tiết collagen [38–40]. Con đường tín hiệu PI3K/AKT được hoạt hóa có thể kích hoạt các tế bào gốc tạo máu (HSC), là những tế bào chịu trách nhiệm sản xuất chất nền ngoại bào (ECM), và sự rối loạn điều hòa của nó có thể góp phần vào sự xuất hiện và tiến triển của xơ gan [40]. Ngoài ra, AKT là một trong những yếu tố sống sót của tế bào quan trọng ức chế quá trình apoptosis tế bào phụ thuộc p53, và sự hoạt hóa AKT có thể liên quan đến việc ức chế apoptosis tế bào gan [41, 42]. Các kết quả thu được cho thấy IPA có thể tham gia vào quá trình apoptosis liên quan đến ty thể gan bằng cách ảnh hưởng đến quyết định của tế bào gan giữa việc bước vào apoptosis hoặc sống sót. Những tác động này có thể được điều hòa bởi các gen ứng cử viên AKT và/hoặc YKT6, vốn rất quan trọng đối với sự cân bằng nội môi của gan.
Kết quả của chúng tôi cho thấy 1 mM IPA gây ra hiện tượng apoptosis và làm giảm hô hấp ty thể trong tế bào LX-2 độc lập với việc điều trị bằng TGF-β1. Điều đáng chú ý là apoptosis là một con đường chính để giải quyết xơ hóa và kích hoạt tế bào gốc tạo máu (HSC), đồng thời cũng là một sự kiện quan trọng trong phản ứng sinh lý có thể đảo ngược của xơ gan [4, 43]. Hơn nữa, sự phục hồi BHI trong tế bào LX-2 sau khi điều trị kết hợp đã cung cấp những hiểu biết mới về vai trò tiềm năng của IPA trong việc điều hòa sinh năng lượng ty thể. Trong điều kiện nghỉ ngơi và không hoạt động, các tế bào tạo máu thường sử dụng quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ty thể để sản xuất ATP và có hoạt động trao đổi chất thấp. Mặt khác, sự kích hoạt HSC làm tăng hô hấp và sinh tổng hợp ty thể để bù đắp cho nhu cầu năng lượng khi bước vào trạng thái đường phân [44]. Việc IPA không ảnh hưởng đến tiềm năng trao đổi chất và ECAR cho thấy con đường đường phân ít được ưu tiên hơn. Tương tự, một nghiên cứu khác cho thấy 1 mM IPA có thể điều chỉnh hoạt động chuỗi hô hấp ty thể trong tế bào cơ tim, dòng tế bào gan người (Huh7) và tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVEC); Tuy nhiên, không tìm thấy tác dụng của IPA đối với quá trình đường phân trong tế bào cơ tim, cho thấy IPA có thể ảnh hưởng đến sinh năng lượng của các loại tế bào khác [45]. Do đó, chúng tôi suy đoán rằng 1 mM IPA có thể hoạt động như một chất tách hóa học nhẹ, vì nó có thể làm giảm đáng kể biểu hiện gen gây xơ hóa, hình thái tế bào và sinh năng lượng ty thể mà không làm thay đổi lượng mtDNA [46]. Các chất tách ty thể có thể ức chế xơ hóa do nuôi cấy và hoạt hóa HSC [47] và giảm sản xuất ATP ty thể được điều chỉnh hoặc gây ra bởi một số protein nhất định như protein tách cặp (UCP) hoặc translocase nucleotide adenine (ANT). Tùy thuộc vào loại tế bào, hiện tượng này có thể bảo vệ tế bào khỏi apoptosis và/hoặc thúc đẩy apoptosis [46]. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để làm rõ vai trò của IPA như một chất làm gián đoạn quá trình hoạt hóa ty thể trong việc vô hiệu hóa tế bào gốc tạo máu.
Sau đó, chúng tôi đã điều tra xem liệu những thay đổi trong hô hấp ty thể có được phản ánh trong hình thái ty thể ở các tế bào LX-2 sống hay không. Điều thú vị là, việc điều trị bằng TGF-β1 làm thay đổi tỷ lệ ty thể từ hình cầu sang hình dạng trung gian, với sự giảm phân nhánh ty thể và tăng biểu hiện của DRP1, một yếu tố quan trọng trong quá trình phân chia ty thể [48]. Hơn nữa, sự phân mảnh ty thể có liên quan đến độ phức tạp của mạng lưới tổng thể, và sự chuyển đổi từ hợp nhất sang phân chia là rất quan trọng đối với sự hoạt hóa tế bào gốc tạo máu (HSC), trong khi sự ức chế phân chia ty thể dẫn đến hiện tượng chết tế bào theo chương trình của HSC [49]. Do đó, kết quả của chúng tôi cho thấy rằng việc điều trị bằng TGF-β1 có thể gây ra sự giảm độ phức tạp của mạng lưới ty thể với sự giảm phân nhánh, điều này phổ biến hơn trong quá trình phân chia ty thể liên quan đến các tế bào gốc tạo máu (HSC) được hoạt hóa. Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng IPA có thể thay đổi tỷ lệ ty thể từ hình cầu sang hình dạng trung gian, do đó làm giảm biểu hiện của OPA1 và MFN2. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc giảm biểu hiện OPA1 có thể gây ra sự giảm điện thế màng ty thể và kích hoạt hiện tượng chết tế bào theo chương trình [50]. MFN2 được biết là có vai trò trung gian trong quá trình hợp nhất ty thể và apoptosis[51]. Các kết quả thu được cho thấy rằng việc kích thích tế bào LX-2 bằng TGF-β1 và/hoặc IPA dường như điều chỉnh hình dạng và kích thước ty thể, cũng như trạng thái hoạt hóa và độ phức tạp của mạng lưới.
Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng phương pháp điều trị kết hợp TGFβ-1 và IPA có thể làm giảm mtDNA và các thông số hình thái tế bào bằng cách điều chỉnh biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến xơ hóa, apoptosis và sự sống còn trong các tế bào tránh apoptosis. Thật vậy, IPA làm giảm mức độ biểu hiện mRNA của AKT1 và các gen xơ hóa quan trọng như COL1A2 và MMP2, nhưng làm tăng mức độ biểu hiện của CASP8, có liên quan đến apoptosis. Kết quả của chúng tôi cho thấy sau khi điều trị bằng IPA, biểu hiện BAX giảm và biểu hiện mRNA của các tiểu đơn vị thuộc họ TIMP1, BCL-2 và NF-κB tăng lên, cho thấy IPA có thể kích thích các tín hiệu sống còn trong các tế bào gốc tạo máu (HSC) tránh apoptosis. Những phân tử này có thể hoạt động như các tín hiệu thúc đẩy sự sống còn trong các tế bào gốc tạo máu được hoạt hóa, có thể liên quan đến việc tăng biểu hiện các protein chống apoptosis (như Bcl-2), giảm biểu hiện BAX gây apoptosis và sự tương tác phức tạp giữa TIMP và NF-κB [5, 7]. IPA phát huy tác dụng thông qua PXR, và chúng tôi nhận thấy rằng điều trị kết hợp với TGF-β1 và IPA làm tăng mức độ biểu hiện mRNA của PXR, cho thấy sự ức chế hoạt hóa HSC. Tín hiệu PXR được hoạt hóa được biết là ức chế hoạt hóa HSC cả trong cơ thể sống và trong ống nghiệm [52, 53]. Kết quả của chúng tôi cho thấy IPA có thể tham gia vào việc loại bỏ các HSC được hoạt hóa bằng cách thúc đẩy quá trình apoptosis, giảm xơ hóa và chuyển hóa ty thể, và tăng cường các tín hiệu sống sót, đây là những quá trình điển hình chuyển đổi kiểu hình HSC được hoạt hóa thành kiểu hình không hoạt hóa. Một lời giải thích khả dĩ khác cho cơ chế và vai trò tiềm năng của IPA trong apoptosis là nó loại bỏ các ty thể bị rối loạn chức năng chủ yếu thông qua quá trình tự thực ty thể (con đường nội tại) và con đường tín hiệu TNF ngoại sinh (Bảng 1), liên kết trực tiếp với con đường tín hiệu sống sót NF-κB (Hình bổ sung 7). Điều thú vị là, các gen được làm giàu liên quan đến IPA có khả năng tạo ra các tín hiệu thúc đẩy apoptosis và thúc đẩy sự sống sót trong con đường apoptosis [54], cho thấy rằng IPA có thể thúc đẩy con đường apoptosis hoặc sự sống sót bằng cách tương tác với các gen này. Tuy nhiên, cách IPA gây ra apoptosis hoặc sự sống sót trong quá trình hoạt hóa HSC và các con đường cơ chế của nó vẫn chưa rõ ràng.
IPA là một chất chuyển hóa vi sinh được hình thành từ tryptophan trong chế độ ăn uống thông qua hệ vi sinh vật đường ruột. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nó có đặc tính chống viêm, chống oxy hóa và điều hòa biểu sinh trong môi trường ruột.[55] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng IPA có thể điều chỉnh chức năng hàng rào ruột và giảm căng thẳng oxy hóa, điều này có thể góp phần vào các tác dụng sinh lý cục bộ của nó.[56] Trên thực tế, IPA được vận chuyển đến các cơ quan đích thông qua hệ tuần hoàn, và vì IPA có cấu trúc chất chuyển hóa chính tương tự với tryptophan, serotonin và các dẫn xuất indole, nên IPA thực hiện các tác động chuyển hóa dẫn đến các số phận chuyển hóa cạnh tranh.[52] IPA có thể cạnh tranh với các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ tryptophan để giành các vị trí liên kết trên các enzyme hoặc thụ thể, có khả năng làm gián đoạn các con đường chuyển hóa bình thường. Điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải nghiên cứu thêm về dược động học và dược lực học của nó để hiểu rõ hơn về cửa sổ điều trị của nó.[57] Vẫn còn phải xem liệu điều này cũng có thể xảy ra ở tế bào gốc tạo máu (HSC) hay không.
Chúng tôi thừa nhận rằng nghiên cứu của chúng tôi có một số hạn chế. Để kiểm tra cụ thể các mối liên hệ liên quan đến IPA, chúng tôi đã loại trừ những bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường loại 2 (T2DM). Chúng tôi thừa nhận rằng điều này hạn chế khả năng áp dụng rộng rãi các phát hiện của chúng tôi đối với những bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường loại 2 và bệnh gan tiến triển. Mặc dù nồng độ sinh lý của IPA trong huyết thanh người là 1–10 μM [11, 20], nhưng nồng độ 1 mM IPA đã được chọn dựa trên nồng độ không độc hại cao nhất [15] và tỷ lệ apoptosis cao nhất, không có sự khác biệt về tỷ lệ phần trăm quần thể tế bào hoại tử. Mặc dù mức IPA vượt quá mức sinh lý đã được sử dụng trong nghiên cứu này, hiện tại vẫn chưa có sự đồng thuận về liều lượng IPA hiệu quả [52]. Mặc dù kết quả của chúng tôi có ý nghĩa, nhưng số phận chuyển hóa rộng hơn của IPA vẫn là một lĩnh vực nghiên cứu tích cực. Hơn nữa, các phát hiện của chúng tôi về mối liên hệ giữa nồng độ IPA trong huyết thanh và sự methyl hóa DNA của các bản sao gan không chỉ thu được từ tế bào gốc tạo máu (HSC) mà còn từ mô gan. Chúng tôi chọn sử dụng tế bào LX-2 của người dựa trên những phát hiện trước đây của chúng tôi từ phân tích transcriptome cho thấy IPA có liên quan đến sự hoạt hóa tế bào gốc tạo máu (HSC) [15], và HSC là những tế bào chính tham gia vào quá trình tiến triển của xơ gan. Gan bao gồm nhiều loại tế bào, vì vậy các mô hình tế bào khác như hệ thống nuôi cấy đồng thời tế bào gan-HSC-tế bào miễn dịch kết hợp với hoạt hóa caspase và phân mảnh DNA cũng như cơ chế hoạt động bao gồm mức độ protein nên được xem xét để nghiên cứu vai trò của IPA và sự tương tác của nó với các loại tế bào gan khác.