Cảm ơn bạn đã truy cập nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng phiên bản trình duyệt mới nhất (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, trang web này sẽ không bao gồm các kiểu định dạng hoặc JavaScript.
Hydro sunfua (H2S) có nhiều tác động sinh lý và bệnh lý đối với cơ thể người. Natri hydrosunfua (NaHS) được sử dụng rộng rãi như một công cụ dược lý để đánh giá tác động của H2S trong các thí nghiệm sinh học. Mặc dù sự mất H2S từ dung dịch NaHS chỉ diễn ra trong vài phút, nhưng dung dịch NaHS đã được sử dụng làm hợp chất cung cấp H2S trong nước uống trong một số nghiên cứu trên động vật. Nghiên cứu này điều tra xem liệu nước uống có nồng độ NaHS 30 μM được pha trong bình nước của chuột có thể duy trì ổn định trong ít nhất 12-24 giờ hay không, như một số tác giả đã đề xuất. Chuẩn bị dung dịch NaHS (30 μM) trong nước uống và đổ ngay vào bình nước của chuột. Các mẫu được thu thập từ đầu và bên trong bình nước ở các thời điểm 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 và 24 giờ để đo hàm lượng sunfua bằng phương pháp xanh metylen. Ngoài ra, chuột đực và chuột cái được tiêm NaHS (30 μM) trong hai tuần và nồng độ sulfide trong huyết thanh được đo hai ngày một lần trong tuần đầu tiên và vào cuối tuần thứ hai. Dung dịch NaHS trong mẫu lấy từ đầu chai nước không ổn định; nó giảm 72% và 75% sau 12 và 24 giờ tương ứng. Trong các mẫu lấy từ bên trong chai nước, sự giảm NaHS không đáng kể trong vòng 2 giờ; tuy nhiên, nó giảm 47% và 72% sau 12 và 24 giờ tương ứng. Việc tiêm NaHS không ảnh hưởng đến nồng độ sulfide trong huyết thanh của chuột đực và chuột cái. Kết luận, dung dịch NaHS được pha từ nước uống không nên được sử dụng để cung cấp H2S vì dung dịch này không ổn định. Phương pháp này sẽ khiến động vật tiếp xúc với lượng NaHS không đều và nhỏ hơn dự kiến.
Hydro sunfua (H2S) đã được sử dụng như một chất độc từ năm 1700; tuy nhiên, vai trò tiềm năng của nó như một phân tử tín hiệu sinh học nội sinh đã được Abe và Kimura mô tả vào năm 1996. Trong ba thập kỷ qua, nhiều chức năng của H2S trong các hệ thống khác nhau của con người đã được làm sáng tỏ, dẫn đến nhận thức rằng các phân tử cho H2S có thể có ứng dụng lâm sàng trong điều trị hoặc quản lý một số bệnh; xem Chirino et al. để biết bài đánh giá gần đây.
Natri hydrosulfua (NaHS) đã được sử dụng rộng rãi như một công cụ dược lý để đánh giá tác dụng của H2S trong nhiều nghiên cứu nuôi cấy tế bào và động vật5,6,7,8. Tuy nhiên, NaHS không phải là chất cho H2S lý tưởng vì nó nhanh chóng chuyển hóa thành H2S/HS- trong dung dịch, dễ bị nhiễm polysulfua, và dễ bị oxy hóa và bay hơi4,9. Trong nhiều thí nghiệm sinh học, NaHS được hòa tan trong nước, dẫn đến sự bay hơi thụ động và mất H2S10,11,12, quá trình oxy hóa tự phát của H2S11,12,13 và quang phân14. Sulfua trong dung dịch ban đầu bị mất rất nhanh do sự bay hơi của H2S11. Trong một bình chứa mở, thời gian bán hủy (t1/2) của H2S là khoảng 5 phút, và nồng độ của nó giảm khoảng 13% mỗi phút10. Mặc dù quá trình mất hydro sunfua từ dung dịch NaHS chỉ diễn ra trong vài phút, một số nghiên cứu trên động vật đã sử dụng dung dịch NaHS làm nguồn cung cấp hydro sunfua trong nước uống trong khoảng thời gian từ 1 đến 21 tuần, thay thế dung dịch chứa NaHS sau mỗi 12-24 giờ.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Thực hành này không phù hợp với các nguyên tắc nghiên cứu khoa học, vì liều lượng thuốc nên dựa trên việc sử dụng chúng ở các loài khác, đặc biệt là con người.27
Nghiên cứu tiền lâm sàng trong y sinh học nhằm mục đích cải thiện chất lượng chăm sóc bệnh nhân hoặc kết quả điều trị. Tuy nhiên, kết quả của hầu hết các nghiên cứu trên động vật vẫn chưa được áp dụng cho con người28,29,30. Một trong những lý do dẫn đến thất bại trong việc áp dụng này là do thiếu sự chú trọng đến chất lượng phương pháp luận của các nghiên cứu trên động vật30. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là điều tra xem liệu dung dịch NaHS 30 μM được pha trong bình nước của chuột/chuột cống có thể duy trì ổn định trong nước uống trong 12–24 giờ hay không, như đã được khẳng định hoặc đề xuất trong một số nghiên cứu.
Tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu này đều được tiến hành theo hướng dẫn đã công bố về chăm sóc và sử dụng động vật thí nghiệm ở Iran31. Tất cả các báo cáo thí nghiệm trong nghiên cứu này cũng tuân theo hướng dẫn ARRIVE32. Ủy ban Đạo đức của Viện Khoa học Nội tiết, Đại học Khoa học Y tế Shahid Beheshti, đã phê duyệt tất cả các quy trình thí nghiệm trong nghiên cứu này.
Kẽm axetat dihydrat (CAS: 5970-45-6) và sắt(III) clorua khan (CAS: 7705-08-0) được mua từ Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Pháp). Natri hydrosulfua hydrat (CAS: 207683-19-0) và N,N-dimethyl-p-phenylenediamine (DMPD) (CAS: 535-47-0) được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Isoflurane được mua từ Piramal (Bethlehem, PA, Hoa Kỳ). Axit clohydric (HCl) được mua từ Merck (Darmstadt, Đức).
Chuẩn bị dung dịch NaHS (30 μM) trong nước uống và đổ ngay vào bình nước của chuột. Nồng độ này được chọn dựa trên nhiều ấn phẩm sử dụng NaHS làm nguồn H2S; xem phần Thảo luận. NaHS là một phân tử ngậm nước có thể chứa lượng nước ngậm khác nhau (tức là NaHS•xH2O); theo nhà sản xuất, tỷ lệ phần trăm NaHS được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là 70,7% (tức là NaHS•1,3 H2O), và chúng tôi đã tính đến giá trị này trong các phép tính của mình, trong đó chúng tôi sử dụng khối lượng phân tử là 56,06 g/mol, là khối lượng phân tử của NaHS khan. Nước ngậm (còn được gọi là nước kết tinh) là các phân tử nước tạo nên cấu trúc tinh thể33. Các chất ngậm nước có các tính chất vật lý và nhiệt động học khác nhau so với các chất khan34.
Trước khi thêm NaHS vào nước uống, hãy đo độ pH và nhiệt độ của dung môi. Ngay lập tức đổ dung dịch NaHS vào bình nước của chuột trong lồng động vật. Lấy mẫu từ đầu ống và từ bên trong bình nước ở các thời điểm 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 và 24 giờ để đo hàm lượng sunfua. Phép đo sunfua được thực hiện ngay sau mỗi lần lấy mẫu. Chúng tôi lấy mẫu từ đầu ống vì một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng kích thước lỗ nhỏ của ống nước có thể giảm thiểu sự bay hơi H2S15,19. Vấn đề này dường như cũng áp dụng cho dung dịch trong bình. Tuy nhiên, điều này không đúng với dung dịch ở cổ bình nước, nơi có tốc độ bay hơi cao hơn và bị tự oxy hóa; trên thực tế, động vật đã uống nước này trước.
Chuột Wistar đực và cái được sử dụng trong nghiên cứu. Chuột được nuôi trong lồng polypropylene (2–3 con chuột mỗi lồng) trong điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ 21–26 °C, độ ẩm 32–40%) với 12 giờ chiếu sáng (7 giờ sáng đến 7 giờ tối) và 12 giờ tối (7 giờ tối đến 7 giờ sáng). Chuột được uống nước máy tự do và được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (Công ty Khorak Dam Pars, Tehran, Iran). Chuột Wistar cái (n=10, trọng lượng cơ thể: 190–230 g) và đực (n=10, trọng lượng cơ thể: 320–370 g) cùng độ tuổi (6 tháng) được chia ngẫu nhiên thành nhóm đối chứng và nhóm điều trị bằng NaHS (30 μM) (n=5 con mỗi nhóm). Để xác định cỡ mẫu, chúng tôi đã sử dụng phương pháp KISS (Keep It Simple, Stupid), kết hợp kinh nghiệm trước đây và phân tích sức mạnh thống kê35. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành một nghiên cứu thí điểm trên 3 con chuột và xác định mức sulfide tổng trung bình trong huyết thanh và độ lệch chuẩn (8,1 ± 0,81 μM). Sau đó, xem xét độ mạnh 80% và giả định mức ý nghĩa 5% hai phía, chúng tôi đã xác định cỡ mẫu sơ bộ (n = 5 dựa trên các tài liệu trước đó) tương ứng với cỡ hiệu ứng chuẩn hóa là 2,02 với giá trị được xác định trước do Festing đề xuất để tính toán cỡ mẫu của động vật thí nghiệm35. Sau khi nhân giá trị này với độ lệch chuẩn (2,02 × 0,81), cỡ hiệu ứng có thể phát hiện được dự đoán (1,6 μM) là 20%, mức này có thể chấp nhận được. Điều này có nghĩa là n = 5/nhóm là đủ để phát hiện sự thay đổi trung bình 20% giữa các nhóm. Chuột được chia ngẫu nhiên thành nhóm đối chứng và nhóm được điều trị bằng NaSH bằng cách sử dụng chức năng ngẫu nhiên của phần mềm Excel 36 (Hình bổ sung 1). Việc che giấu thông tin được thực hiện ở cấp độ kết quả, và các nhà nghiên cứu thực hiện các phép đo sinh hóa không biết về sự phân nhóm.
Nhóm chuột NaHS thuộc cả hai giới được điều trị bằng dung dịch NaHS 30 μM pha trong nước uống trong 2 tuần; dung dịch mới được cung cấp mỗi 24 giờ, trong thời gian đó trọng lượng cơ thể được đo. Mẫu máu được lấy từ đầu đuôi của tất cả chuột dưới gây mê bằng isoflurane hai ngày một lần vào cuối tuần thứ nhất và thứ hai. Mẫu máu được ly tâm ở 3000 g trong 10 phút, huyết thanh được tách ra và bảo quản ở -80°C để đo nồng độ urê huyết thanh, creatinine (Cr) và tổng sulfide sau đó. Nồng độ urê huyết thanh được xác định bằng phương pháp urease enzym, và nồng độ creatinine huyết thanh được xác định bằng phương pháp quang phổ Jaffe sử dụng bộ dụng cụ thương mại (Công ty Man, Tehran, Iran) và máy phân tích tự động (Selectra E, số sê-ri 0-2124, Hà Lan). Hệ số biến thiên trong và giữa các lần đo đối với urê và Cr nhỏ hơn 2,5%.
Phương pháp xanh metylen (MB) được sử dụng để đo tổng lượng sunfua trong nước uống và huyết thanh chứa NaHS; MB là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để đo sunfua trong dung dịch khối lượng lớn và mẫu sinh học11,37. Phương pháp MB có thể được sử dụng để ước tính tổng lượng sunfua38 và đo sunfua vô cơ dưới dạng H2S, HS- và S2 trong pha nước39. Trong phương pháp này, lưu huỳnh được kết tủa dưới dạng kẽm sunfua (ZnS) khi có mặt kẽm axetat11,38. Kết tủa bằng kẽm axetat là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tách sunfua khỏi các chất tạo màu khác11. ZnS được hòa tan lại bằng HCl11 trong điều kiện axit mạnh. Sunfua phản ứng với DMPD theo tỷ lệ mol 1:2 trong phản ứng được xúc tác bởi sắt(III) clorua (Fe3+ đóng vai trò là chất oxy hóa) để tạo thành thuốc nhuộm MB, được phát hiện bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 670 nm40,41. Giới hạn phát hiện của phương pháp MB xấp xỉ 1 μM11.
Trong nghiên cứu này, 100 μL mỗi mẫu (dung dịch hoặc huyết thanh) được thêm vào một ống nghiệm; sau đó thêm 200 μL kẽm axetat (1% w/v trong nước cất), 100 μL DMPD (20 mM trong HCl 7,2 M) và 133 μL FeCl3 (30 mM trong HCl 1,2 M). Hỗn hợp được ủ ở 37°C trong bóng tối trong 30 phút. Dung dịch được ly tâm ở 10.000 g trong 10 phút, và độ hấp thụ của dịch nổi được đọc ở bước sóng 670 nm bằng máy đọc vi phiến (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Nồng độ sunfua được xác định bằng cách sử dụng đường cong hiệu chuẩn của NaHS (0–100 μM) trong ddH2O (Hình bổ sung 2). Tất cả các dung dịch được sử dụng cho các phép đo đều được pha chế mới. Hệ số biến thiên trong và giữa các lần đo đối với phép đo sulfide lần lượt là 2,8% và 3,4%. Chúng tôi cũng xác định tổng lượng sulfide thu hồi được từ nước uống và mẫu huyết thanh có chứa natri thiosulfate bằng phương pháp mẫu tăng cường42. Tỷ lệ thu hồi đối với nước uống và mẫu huyết thanh có chứa natri thiosulfate lần lượt là 91 ± 1,1% (n = 6) và 93 ± 2,4% (n = 6).
Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism phiên bản 8.0.2 dành cho Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Phép kiểm t-test cặp đôi được sử dụng để so sánh nhiệt độ và độ pH của nước uống trước và sau khi thêm NaHS. Sự mất H2S trong dung dịch chứa NaHS được tính bằng phần trăm giảm so với mức hấp thụ ban đầu, và để đánh giá xem sự mất mát này có ý nghĩa thống kê hay không, chúng tôi đã thực hiện phân tích phương sai một chiều lặp lại (one-way repeated-measures ANOVA) tiếp theo là phép kiểm so sánh đa bội Dunnett. Trọng lượng cơ thể, urê huyết thanh, creatinin huyết thanh và tổng sulfua huyết thanh theo thời gian được so sánh giữa chuột đối chứng và chuột được điều trị bằng NaHS thuộc các giới tính khác nhau bằng cách sử dụng phân tích phương sai hai chiều hỗn hợp (between-within) (two-way mixed ANOVA) tiếp theo là phép kiểm hậu kiểm Bonferroni. Giá trị P hai phía < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
Độ pH của nước uống là 7,60 ± 0,01 trước khi thêm NaHS và 7,71 ± 0,03 sau khi thêm NaHS (n = 13, p = 0,0029). Nhiệt độ của nước uống là 26,5 ± 0,2 và giảm xuống 26,2 ± 0,2 sau khi thêm NaHS (n = 13, p = 0,0128). Chuẩn bị dung dịch NaHS 30 μM trong nước uống và đựng trong chai nước. Dung dịch NaHS không ổn định và nồng độ của nó giảm dần theo thời gian. Khi lấy mẫu từ cổ chai nước, quan sát thấy sự giảm đáng kể (68,0%) trong giờ đầu tiên, và hàm lượng NaHS trong dung dịch giảm 72% và 75% sau 12 và 24 giờ tương ứng. Trong các mẫu thu được từ chai nước, sự giảm nồng độ NaHS không đáng kể trong vòng 2 giờ đầu, nhưng sau 12 và 24 giờ, nồng độ này đã giảm lần lượt 47% và 72%. Dữ liệu này cho thấy tỷ lệ phần trăm NaHS trong dung dịch 30 μM pha trong nước uống đã giảm xuống còn khoảng một phần tư giá trị ban đầu sau 24 giờ, bất kể vị trí lấy mẫu (Hình 1).
Độ ổn định của dung dịch NaHS (30 μM) trong nước uống ở bình dành cho chuột cống/chuột nhắt. Sau khi pha chế dung dịch, các mẫu được lấy từ đầu vòi và bên trong bình nước. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 6/nhóm). * và #, P < 0,05 so với thời điểm 0. Hình ảnh bình nước cho thấy đầu vòi (có miệng) và thân bình. Thể tích đầu vòi xấp xỉ 740 μL.
Nồng độ NaHS trong dung dịch 30 μM mới pha là 30,3 ± 0,4 μM (khoảng: 28,7–31,9 μM, n = 12). Tuy nhiên, sau 24 giờ, nồng độ NaHS giảm xuống giá trị thấp hơn (trung bình: 3,0 ± 0,6 μM). Như thể hiện trong Hình 2, nồng độ NaHS mà chuột tiếp xúc không ổn định trong suốt thời gian nghiên cứu.
Trọng lượng cơ thể của chuột cái tăng lên đáng kể theo thời gian (từ 205,2 ± 5,2 g đến 213,8 ​​± 7,0 g ở nhóm đối chứng và từ 204,0 ± 8,6 g đến 211,8 ± 7,5 g ở nhóm được điều trị bằng NaHS); tuy nhiên, việc điều trị bằng NaHS không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể (Hình 3). Trọng lượng cơ thể của chuột đực cũng tăng lên đáng kể theo thời gian (từ 338,6 ± 8,3 g đến 352,4 ± 6,0 g ở nhóm đối chứng và từ 352,4 ± 5,9 g đến 363,2 ± 4,3 g ở nhóm được điều trị bằng NaHS); tuy nhiên, việc điều trị bằng NaHS không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể (Hình 3).
Sự thay đổi trọng lượng cơ thể ở chuột cái và chuột đực sau khi dùng NaHS (30 μM). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM) và được so sánh bằng phân tích phương sai hai chiều hỗn hợp (trong-giữa) với kiểm định hậu hoc Bonferroni. n = 5 con mỗi giới tính trong mỗi nhóm.
Nồng độ urê và creatine phosphate trong huyết thanh ở nhóm chuột đối chứng và nhóm chuột được điều trị bằng NaSH tương đương nhau trong suốt nghiên cứu. Hơn nữa, việc điều trị bằng NaSH không ảnh hưởng đến nồng độ urê và creatinechrome trong huyết thanh (Bảng 1).
Nồng độ sulfide tổng cộng trong huyết thanh ở mức cơ bản tương đương nhau giữa nhóm đối chứng và nhóm được điều trị bằng NaHS ở chuột đực (8,1 ± 0,5 μM so với 9,3 ± 0,2 μM) và chuột cái (9,1 ± 1,0 μM so với 6,1 ± 1,1 μM). Việc sử dụng NaHS trong 14 ngày không ảnh hưởng đến nồng độ sulfide tổng cộng trong huyết thanh ở cả chuột đực và chuột cái (Hình 4).
Sự thay đổi nồng độ sunfua tổng cộng trong huyết thanh ở chuột đực và chuột cái sau khi dùng NaHS (30 μM). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM) và được so sánh bằng phân tích phương sai hai chiều hỗn hợp (trong cùng một nhóm) với kiểm định hậu hoc Bonferroni. Mỗi giới tính, n = 5/nhóm.
Kết luận chính của nghiên cứu này là nước uống có chứa NaHS không ổn định: chỉ khoảng một phần tư tổng hàm lượng sulfide ban đầu có thể được phát hiện sau 24 giờ lấy mẫu từ đầu và bên trong bình nước của chuột. Hơn nữa, chuột tiếp xúc với nồng độ NaHS không ổn định do sự mất H2S trong dung dịch NaHS, và việc thêm NaHS vào nước uống không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, urê huyết thanh và crom creatine, hoặc tổng lượng sulfide huyết thanh.
Trong nghiên cứu này, tốc độ mất H2S từ dung dịch NaHS 30 μM được pha trong nước uống là khoảng 3% mỗi giờ. Trong dung dịch đệm (natri sunfua 100 μM trong PBS 10 mM, pH 7,4), nồng độ sunfua được báo cáo là giảm 7% theo thời gian trong 8 giờ¹¹. Trước đây, chúng tôi đã bảo vệ việc tiêm NaHS vào phúc mạc bằng cách báo cáo rằng tốc độ mất sunfua từ dung dịch NaHS 54 μM trong nước uống là khoảng 2,3% mỗi giờ (4%/giờ trong 12 giờ đầu và 1,4%/giờ trong 12 giờ cuối sau khi pha chế)⁸. Các nghiên cứu trước đó⁴³ đã tìm thấy sự mất H2S liên tục từ dung dịch NaHS, chủ yếu do bay hơi và oxy hóa. Ngay cả khi không thêm bọt khí, sunfua trong dung dịch gốc cũng nhanh chóng bị mất do sự bay hơi của H2S¹¹. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong quá trình pha loãng, kéo dài khoảng 30–60 giây, khoảng 5–10% H2S bị mất do bay hơi6. Để ngăn chặn sự bay hơi của H2S từ dung dịch, các nhà nghiên cứu đã thực hiện một số biện pháp, bao gồm khuấy nhẹ dung dịch12, phủ dung dịch gốc bằng màng nhựa6 và giảm thiểu sự tiếp xúc của dung dịch với không khí, vì tốc độ bay hơi của H2S phụ thuộc vào giao diện không khí-chất lỏng.13 Quá trình oxy hóa tự phát của H2S chủ yếu xảy ra do các ion kim loại chuyển tiếp, đặc biệt là sắt(III), là các tạp chất trong nước.13 Quá trình oxy hóa H2S dẫn đến sự hình thành các polysulfua (các nguyên tử lưu huỳnh liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị)11. Để tránh quá trình oxy hóa, các dung dịch chứa H2S được pha chế trong dung môi đã khử oxy44,45 và sau đó được sục khí argon hoặc nitơ trong 20–30 phút để đảm bảo khử oxy hoàn toàn.11,12,37,44,45,46 Axit diethylenetriaminepentaacetic (DTPA) là một chất tạo phức kim loại (10–4 M) ngăn ngừa quá trình tự oxy hóa HS- trong dung dịch hiếu khí. Trong trường hợp không có DTPA, tốc độ tự oxy hóa của HS- xấp xỉ 50% trong khoảng 3 giờ ở 25°C37,47. Hơn nữa, vì quá trình oxy hóa 1e-sulfide được xúc tác bởi tia cực tím, dung dịch cần được bảo quản trên đá và tránh ánh sáng11.
Như thể hiện trong Hình 5, NaHS phân ly thành Na+ và HS-6 khi hòa tan trong nước; sự phân ly này được xác định bởi pK1 của phản ứng, phụ thuộc vào nhiệt độ: pK1 = 3,122 + 1132/T, trong đó T nằm trong khoảng từ 5 đến 30°C và được đo bằng độ Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- có pK2 cao (pK2 = 19), vì vậy ở pH < 96,49, S2- không được hình thành hoặc được hình thành với lượng rất nhỏ. Ngược lại, HS- hoạt động như một bazơ và nhận H+ từ phân tử H2O, và H2O hoạt động như một axit và được chuyển hóa thành H2S và OH-.
Sự hình thành khí H2S hòa tan trong dung dịch NaHS (30 µM). aq, dung dịch nước; g, khí; l, chất lỏng. Tất cả các phép tính đều giả định rằng độ pH của nước = 7,0 và nhiệt độ nước = 20 °C. Được tạo bằng BioRender.com.
Mặc dù có bằng chứng cho thấy dung dịch NaHS không ổn định, một số nghiên cứu trên động vật đã sử dụng dung dịch NaHS trong nước uống như một hợp chất cung cấp H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 với thời gian can thiệp từ 1 đến 21 tuần (Bảng 2). Trong các nghiên cứu này, dung dịch NaHS được thay mới sau mỗi 12 giờ, 15, 17, 18, 24, 25 giờ hoặc 24 giờ, 19, 20, 21, 22, 23 giờ. Kết quả của chúng tôi cho thấy chuột tiếp xúc với nồng độ thuốc không ổn định do mất H2S từ dung dịch NaHS, và hàm lượng NaHS trong nước uống của chuột dao động đáng kể trong 12 hoặc 24 giờ (xem Hình 2). Hai trong số các nghiên cứu này báo cáo rằng nồng độ H2S trong nước vẫn ổn định trong hơn 24 giờ22 hoặc chỉ quan sát thấy sự mất mát 2–3% H2S trong hơn 12 giờ15, nhưng họ không cung cấp dữ liệu hỗ trợ hoặc chi tiết đo lường. Hai nghiên cứu đã chỉ ra rằng đường kính nhỏ của chai nước có thể giảm thiểu sự bay hơi H2S15,19. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi cho thấy điều này chỉ có thể làm chậm sự mất H2S từ chai nước trong 2 giờ chứ không phải 12–24 giờ. Cả hai nghiên cứu đều lưu ý rằng chúng tôi giả định rằng nồng độ NaHS trong nước uống không thay đổi vì chúng tôi không quan sát thấy sự thay đổi màu sắc của nước; do đó, quá trình oxy hóa H2S bởi không khí không đáng kể19,20. Điều đáng ngạc nhiên là phương pháp chủ quan này đánh giá sự ổn định của NaHS trong nước thay vì đo lường sự thay đổi nồng độ của nó theo thời gian.
Sự mất H2S trong dung dịch NaHS có liên quan đến độ pH và nhiệt độ. Như đã lưu ý trong nghiên cứu của chúng tôi, việc hòa tan NaHS trong nước dẫn đến sự hình thành dung dịch kiềm50. Khi NaHS được hòa tan trong nước, sự hình thành khí H2S hòa tan phụ thuộc vào giá trị pH6. Độ pH của dung dịch càng thấp, tỷ lệ NaHS tồn tại dưới dạng phân tử khí H2S càng lớn và lượng sunfua bị mất khỏi dung dịch nước càng nhiều11. Không có nghiên cứu nào trong số này báo cáo độ pH của nước uống được sử dụng làm dung môi cho NaHS. Theo khuyến nghị của WHO, được hầu hết các quốc gia áp dụng, độ pH của nước uống nên nằm trong khoảng 6,5–8,551. Trong phạm vi pH này, tốc độ oxy hóa tự phát của H2S tăng lên khoảng mười lần13. Việc hòa tan NaHS trong nước ở phạm vi pH này sẽ dẫn đến nồng độ khí H2S hòa tan từ 1 đến 22,5 μM, điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc theo dõi độ pH của nước trước khi hòa tan NaHS. Ngoài ra, phạm vi nhiệt độ được báo cáo trong nghiên cứu trên (18–26 °C) sẽ dẫn đến sự thay đổi nồng độ khí H2S hòa tan trong dung dịch khoảng 10%, vì sự thay đổi nhiệt độ làm thay đổi pK1, và những thay đổi nhỏ trong pK1 có thể có tác động đáng kể đến nồng độ khí H2S hòa tan48. Thêm vào đó, thời gian dài của một số nghiên cứu (5 tháng)22, trong đó dự kiến ​​có sự biến đổi nhiệt độ lớn, cũng làm trầm trọng thêm vấn đề này.
Tất cả các nghiên cứu, ngoại trừ một nghiên cứu21, đều sử dụng dung dịch NaHS 30 μM trong nước uống. Để giải thích liều lượng sử dụng (tức là 30 μM), một số tác giả chỉ ra rằng NaHS trong pha nước tạo ra nồng độ khí H2S chính xác như nhau và phạm vi sinh lý của H2S là từ 10 đến 100 μM, vì vậy liều lượng này nằm trong phạm vi sinh lý15,16. Những người khác giải thích rằng 30 μM NaHS có thể duy trì mức H2S trong huyết tương ở mức sinh lý, tức là 5–300 μM19,20. Chúng tôi xem xét nồng độ NaHS trong nước là 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), được sử dụng trong một số nghiên cứu để nghiên cứu tác động của H2S. Chúng ta có thể tính toán rằng nồng độ khí H2S hòa tan là 14,7 μM, bằng khoảng 50% nồng độ NaHS ban đầu. Giá trị này tương tự với giá trị được tính toán bởi các tác giả khác trong cùng điều kiện13,48.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, việc sử dụng NaHS không làm thay đổi trọng lượng cơ thể; kết quả này phù hợp với kết quả của các nghiên cứu khác trên chuột đực22,23 và chuột cống đực18; Tuy nhiên, hai nghiên cứu báo cáo rằng NaSH đã phục hồi trọng lượng cơ thể bị giảm ở chuột cống bị cắt bỏ thận24,26, trong khi các nghiên cứu khác không báo cáo tác dụng của việc sử dụng NaSH đối với trọng lượng cơ thể15,16,17,19,20,21,25. Hơn nữa, trong nghiên cứu của chúng tôi, việc sử dụng NaSH không ảnh hưởng đến nồng độ urê và crom trong huyết thanh, điều này phù hợp với kết quả của một báo cáo khác25.
Nghiên cứu cho thấy việc bổ sung NaHS vào nước uống trong 2 tuần không ảnh hưởng đến tổng nồng độ sulfide trong huyết thanh ở chuột đực và chuột cái. Phát hiện này phù hợp với kết quả của Sen et al. (16): điều trị 8 tuần với 30 μM NaHS trong nước uống không ảnh hưởng đến nồng độ sulfide trong huyết tương ở chuột đối chứng; tuy nhiên, họ báo cáo rằng biện pháp can thiệp này đã khôi phục lại mức H2S giảm trong huyết tương của chuột bị cắt bỏ thận. Li et al. (22) cũng báo cáo rằng điều trị với 30 μM NaHS trong nước uống trong 5 tháng đã làm tăng nồng độ sulfide tự do trong huyết tương ở chuột già khoảng 26%. Các nghiên cứu khác chưa báo cáo những thay đổi về sulfide lưu thông sau khi bổ sung NaHS vào nước uống.
Bảy nghiên cứu đã báo cáo việc sử dụng Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 nhưng không cung cấp thêm chi tiết về nước kết tinh, và năm nghiên cứu không đề cập đến nguồn NaHS được sử dụng trong phương pháp điều chế của họ17,18,24,25,26. NaHS là một phân tử ngậm nước và hàm lượng nước kết tinh của nó có thể thay đổi, điều này ảnh hưởng đến lượng NaHS cần thiết để pha chế dung dịch có nồng độ mol nhất định. Ví dụ, hàm lượng NaHS trong nghiên cứu của chúng tôi là NaHS•1,3 H2O. Do đó, nồng độ NaHS thực tế trong các nghiên cứu này có thể thấp hơn so với nồng độ được báo cáo.
“Làm thế nào một hợp chất có thời gian tồn tại ngắn như vậy lại có tác dụng lâu dài đến thế?” Pozgay và cộng sự21 đã đặt câu hỏi này khi đánh giá tác dụng của NaHS đối với bệnh viêm đại tràng ở chuột. Họ hy vọng rằng các nghiên cứu trong tương lai sẽ có thể trả lời câu hỏi này và suy đoán rằng dung dịch NaHS có thể chứa nhiều polysulfua ổn định hơn ngoài H2S và disulfua đóng vai trò trung gian trong tác dụng của NaHS21. Một khả năng khác là nồng độ rất thấp của NaHS còn lại trong dung dịch cũng có thể có tác dụng có lợi. Trên thực tế, Olson và cộng sự đã cung cấp bằng chứng cho thấy nồng độ H2S ở mức micromolar trong máu là không sinh lý và nên ở mức nanomolar hoặc hoàn toàn không có13. H2S có thể hoạt động thông qua quá trình sulfat hóa protein, một biến đổi sau dịch mã có thể đảo ngược ảnh hưởng đến chức năng, độ ổn định và vị trí của nhiều protein52,53,54. Trên thực tế, trong điều kiện sinh lý, khoảng 10% đến 25% nhiều protein gan bị sulfat hóa53. Cả hai nghiên cứu đều thừa nhận sự phân hủy nhanh chóng của NaHS19,23 nhưng đáng ngạc nhiên là lại nêu rằng “chúng tôi đã kiểm soát nồng độ NaHS trong nước uống bằng cách thay thế nó hàng ngày.”23 Một nghiên cứu vô tình nêu rằng “NaHS là chất cung cấp H2S tiêu chuẩn và thường được sử dụng trong thực hành lâm sàng để thay thế chính H2S.”18
Thảo luận ở trên cho thấy NaHS bị mất khỏi dung dịch do bay hơi, oxy hóa và quang phân, do đó một số đề xuất được đưa ra để giảm thiểu sự mất H2S khỏi dung dịch. Thứ nhất, sự bay hơi của H2S phụ thuộc vào giao diện khí-lỏng13 và độ pH của dung dịch11; do đó, để giảm thiểu sự mất mát do bay hơi, cổ chai nước có thể được làm càng nhỏ càng tốt như đã mô tả trước đó15,19, và độ pH của nước có thể được điều chỉnh đến giới hạn trên chấp nhận được (tức là 6,5–8,551) để giảm thiểu sự mất mát do bay hơi11. Thứ hai, quá trình oxy hóa tự phát của H2S xảy ra do tác động của oxy và sự hiện diện của các ion kim loại chuyển tiếp trong nước uống13, vì vậy việc khử oxy trong nước uống bằng argon hoặc nitơ44,45 và sử dụng chất tạo phức kim loại37,47 có thể làm giảm quá trình oxy hóa sunfua. Thứ ba, để ngăn chặn sự phân hủy quang học của H2S, chai nước có thể được bọc bằng giấy nhôm; Thực hành này cũng áp dụng cho các vật liệu nhạy cảm với ánh sáng như streptozotocin55. Cuối cùng, các muối sunfua vô cơ (NaHS, Na2S và CaS) có thể được dùng bằng đường uống thay vì hòa tan trong nước uống như đã báo cáo trước đây56,57,58; các nghiên cứu đã chỉ ra rằng natri sunfua phóng xạ được dùng bằng đường uống cho chuột được hấp thụ tốt và phân bố đến hầu hết các mô59. Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu đã dùng muối sunfua vô cơ bằng đường tiêm phúc mạc; tuy nhiên, phương pháp này hiếm khi được sử dụng trong môi trường lâm sàng60. Mặt khác, đường uống là phương pháp dùng thuốc phổ biến nhất và được ưa chuộng nhất ở người61. Do đó, chúng tôi khuyến nghị đánh giá tác dụng của các chất cho H2S ở loài gặm nhấm bằng cách cho uống qua đường miệng.
Một hạn chế là chúng tôi đã đo sulfide trong dung dịch nước và huyết thanh bằng phương pháp MB. Các phương pháp đo sulfide bao gồm chuẩn độ iốt, quang phổ, phương pháp điện hóa (đo điện thế, đo dòng điện, phương pháp đo điện lượng và phương pháp đo cường độ dòng điện) và sắc ký (sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao), trong đó phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp quang phổ MB62. Một hạn chế của phương pháp MB để đo H2S trong mẫu sinh học là nó đo tất cả các hợp chất chứa lưu huỳnh chứ không phải H2S tự do63 vì nó được thực hiện trong điều kiện axit, dẫn đến việc chiết xuất lưu huỳnh từ nguồn sinh học64. Tuy nhiên, theo Hiệp hội Y tế Công cộng Hoa Kỳ, MB là phương pháp tiêu chuẩn để đo sulfide trong nước65. Do đó, hạn chế này không ảnh hưởng đến kết quả chính của chúng tôi về tính không ổn định của các dung dịch chứa NaHS. Hơn nữa, trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ thu hồi các phép đo sulfide trong mẫu nước và huyết thanh chứa NaHS lần lượt là 91% và 93%. Những giá trị này phù hợp với các phạm vi đã được báo cáo trước đó (77–92)66, cho thấy độ chính xác phân tích chấp nhận được42. Điều đáng chú ý là chúng tôi đã sử dụng cả chuột đực và chuột cái theo hướng dẫn của Viện Y tế Quốc gia (NIH) để tránh quá phụ thuộc vào các nghiên cứu trên động vật chỉ có chuột đực trong các nghiên cứu tiền lâm sàng67 và để bao gồm cả chuột đực và chuột cái bất cứ khi nào có thể68. Điểm này đã được những người khác nhấn mạnh69,70,71.
Tóm lại, kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng dung dịch NaHS được pha chế từ nước uống không thể được sử dụng để tạo ra H2S do tính không ổn định của chúng. Phương pháp sử dụng này sẽ khiến động vật tiếp xúc với nồng độ NaHS không ổn định và thấp hơn mức dự kiến; do đó, các phát hiện này có thể không áp dụng được cho con người.
Các bộ dữ liệu được sử dụng và/hoặc phân tích trong nghiên cứu hiện tại có sẵn từ tác giả liên hệ khi có yêu cầu hợp lý.
Szabo, K. Dòng thời gian nghiên cứu về hydro sunfua (H2S): từ chất độc môi trường đến chất trung gian sinh học. Sinh hóa và Dược lý 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. và Kimura, H. Vai trò có thể có của hydro sunfua như một chất điều hòa thần kinh nội sinh. Tạp chí Khoa học Thần kinh, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. và Papapetropoulos, A. Vai trò sinh lý của hydro sunfua trong tế bào, mô và cơ quan của động vật có vú. Tạp chí Sinh lý học và Sinh học Phân tử 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, và Kashfi, K. Triển vọng ngày càng phát triển của các hệ thống phân phối tế bào cho oxit nitric và hydro sunfua: một kỷ nguyên mới của y học cá nhân hóa. Sinh hóa và Dược lý 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Sử dụng lâu dài chất cho hydro sunfua giải phóng chậm có thể ngăn ngừa tổn thương thiếu máu/tái tưới máu cơ tim. Báo cáo khoa học 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM và Hermann, A. Sự phosphoryl hóa kênh BK điều chỉnh độ nhạy cảm với hydro sunfua (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM và Hermann, A. Hydrogen sulfide tăng cường hoạt động của kênh kali hoạt hóa bởi canxi (BK) trong tế bào khối u tuyến yên của chuột. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Hydrogen sulfide enhances the protective effect of nitrite against myocardial ischemia-reperfusion injury in type 2 diabetic rats. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Xu hướng hóa học chất cho H2S và tác động của nó đến bệnh tim mạch. Chất chống oxy hóa 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, và Olson, KR (2012). Sự mất mát thụ động của hydro sunfua trong các thí nghiệm sinh học. Hóa sinh phân tích 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Các khía cạnh hóa học của phép đo hydro sunfua trong các mẫu sinh lý. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Xác định hydro sunfua trong nước tự nhiên bằng phương pháp quang phổ. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Huấn luyện thực hành về hóa học và sinh học của hydro sunfua. “Chất chống oxy hóa.” Tín hiệu Redox. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).