Phân loại protein trong con đường bài tiết là rất cần thiết để duy trì sự phân vùng tế bào và cân bằng nội môi. Bên cạnh sự phân loại qua trung gian vỏ, vai trò của lipid trong việc phân loại kinesin trong quá trình vận chuyển bài tiết là một câu hỏi cơ bản lâu đời vẫn chưa được giải đáp. Ở đây, chúng tôi thực hiện chụp ảnh thời gian thực độ phân giải cao đa màu đồng thời 3D để chứng minh trên cơ thể sống rằng các protein được tổng hợp mới và cố định bằng glycosylphosphatidylinositol với các phần lipid ceramide rất dài được tập hợp lại và phân loại vào các vị trí thoát lưới nội chất chuyên biệt, khác với vị trí được sử dụng bởi các protein xuyên màng. Ngoài ra, chúng tôi chỉ ra rằng chiều dài chuỗi ceramide trong màng lưới nội chất rất quan trọng đối với tính chọn lọc phân loại này. Nghiên cứu của chúng tôi cung cấp bằng chứng trực tiếp đầu tiên trên cơ thể sống để phân loại các protein dựa trên chiều dài chuỗi lipid thành các vị trí xuất khẩu chọn lọc trong con đường bài tiết.
Trong tế bào nhân chuẩn, các protein được tổng hợp trong lưới nội chất (ER) sau đó được phân loại trong quá trình vận chuyển qua con đường bài tiết để đưa đến đích tế bào thích hợp (1). Ngoài việc phân loại qua lớp phủ, từ lâu người ta đã suy đoán rằng một số lipid nhất định cũng có thể đóng vai trò là điểm thoát chọn lọc bằng cách tập hợp chúng thành các vùng màng cụ thể mà các protein cụ thể (2-5). Tuy nhiên, vẫn còn thiếu bằng chứng trực tiếp trong cơ thể sống để chứng minh cơ chế dựa trên lipid khả thi này. Để giải quyết vấn đề cơ bản này, chúng tôi đã nghiên cứu ở nấm men cách các protein neo glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-AP) được xuất khẩu khác nhau từ ER. GPI-AP là một loại protein bề mặt tế bào liên kết lipid (6, 7). GPI-AP là một protein được tiết ra gắn vào lớp ngoài của màng plasma thông qua phần glycolipid (neo GPI). Chúng chấp nhận neo GPI như là các sửa đổi sau dịch mã bảo tồn trong lòng ER (8). Sau khi gắn kết, GPI-AP đi qua bộ máy Golgi (5, 9) từ ER đến màng tế bào. Sự hiện diện của các neo GPI khiến GPI-AP được vận chuyển riêng biệt với các protein tiết qua màng (bao gồm các protein màng tế bào khác) dọc theo con đường bài tiết (5, 9, 10). Trong tế bào nấm men, GPI-AP được tách ra khỏi các protein tiết khác trong lưới nội chất, sau đó được đóng gói vào các túi đặc biệt được bao bọc bởi phức hợp protein vỏ II (COPII) (6, 7). Các yếu tố quyết định quá trình phân loại này trong quá trình xuất khẩu ER vẫn chưa rõ ràng, nhưng người ta suy đoán rằng cơ chế này có thể cần lipid, đặc biệt là sự tái cấu trúc cấu trúc của phần lipid của neo GPI (5, 8). Trong nấm men, quá trình tái cấu trúc lipid GPI bắt đầu ngay sau khi GPI gắn vào, và trong nhiều trường hợp, nó khiến ceramide liên kết với axit béo bão hòa chuỗi dài 26 carbon (C26:0) (11, 12). Ceramide C26 là loại ceramide chính được sản xuất bởi tế bào nấm men cho đến nay. Nó được tổng hợp trong ER và phần lớn được xuất khẩu đến bộ máy Golgi thông qua các túi COPII (13). Việc xuất khẩu GPI-AP từ ER đặc biệt yêu cầu quá trình tổng hợp ceramide liên tục (14, 15), và ngược lại, sự chuyển đổi ceramide thành inositol phosphate ceramide (IPC) trong bộ máy Golgi phụ thuộc vào quá trình tổng hợp neo GPI (16). Các nghiên cứu sinh lý học với màng nhân tạo đã chỉ ra rằng các ceramide có chuỗi acyl rất dài có thể kết hợp lại để tạo thành các vùng có trật tự với các đặc tính vật lý độc đáo (17, 18). Những dữ liệu này dẫn đến giả thuyết rằng ceramide C26 và GPI-AP với ceramide C26 sử dụng các đặc tính vật lý của chúng để kết hợp thành các vùng có trật tự hoặc các vùng trong môi trường lipid màng ER tương đối lộn xộn. Nó chủ yếu bao gồm các glycerolipid ngắn và không bão hòa (C16:1 và C18:1) (19, 20). Các vùng này sẽ được tập trung chọn lọc vào các vị trí thoát ER cụ thể (ERES), nơi ceramide và GPI-AP dựa trên ceramide có thể được vận chuyển đồng thời đến Golgi trong cùng một túi COPII chuyên dụng (5).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã trực tiếp kiểm tra cơ chế dựa trên lipid này bằng cách sử dụng kính hiển vi hình ảnh thời gian thực confocal siêu phân giải (SCLIM), một kỹ thuật kính hiển vi tiên tiến có thể đồng thời quan sát các protein được gắn nhãn huỳnh quang. Hình ảnh ba màu và ba chiều (3D) có độ phân giải và tốc độ cực cao trong tế bào sống (21, 22).
Đầu tiên, chúng tôi áp dụng công nghệ SCLIM để xác định rõ hơn cách GPI-AP bình thường với nhóm ceramide C26 được sàng lọc từ các protein tiết qua màng sau khi rời khỏi ER ở S. cerevisiae. Để kiểm tra sự phân loại của ER, chúng tôi đã sử dụng một hệ thống di truyền có thể trực tiếp hình dung được hàng hóa mới được tổng hợp đi vào ERES trong cơ thể sống (7, 23). Là hàng hóa, chúng tôi đã chọn GPI-AP dựa trên ceramide C26 Gas1 được gắn nhãn bằng protein huỳnh quang xanh (GFP) và protein tiết qua màng Mid2 được gắn nhãn bằng protein huỳnh quang cận hồng ngoại (iRFP), cả hai đều nhắm mục tiêu vào màng huyết tương (24–26). Trong đột biến nhạy cảm với nhiệt độ sec31-1, hai hàng hóa này được biểu hiện dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng galactose và dấu hiệu ERES cấu thành. Ở nhiệt độ cực cao (37°C), do đột biến sec31-1 ảnh hưởng đến chức năng của thành phần vỏ COPII Sec31 để ức chế sự nảy mầm COPII và xuất khẩu ER, hàng hóa mới được tổng hợp tích tụ tại ER (23). Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ thấp (24°C), các tế bào đột biến sec31-1 phục hồi từ vùng tiết và lượng chất tổng hợp mới tích lũy bắt đầu được xuất ra khỏi ER. Hình ảnh CLIM cho thấy hầu hết Gas1-GFP và Mid2-iRFP mới được tổng hợp vẫn tích lũy trong ER của các tế bào đột biến sec31-1 sau khi ủ ở 37°C và sau đó được giải phóng ở 24°C trong 5 phút (Hình 1). Vì Mid2-iRFP được phân bố trên toàn bộ màng ER, còn Gas1-GFP tập trung và tụ lại ở vùng màng ER không liên tục, nên sự phân bố của chúng hoàn toàn khác nhau (Hình 1, A đến C và Video S1). Ngoài ra, như thể hiện trong Hình 1D, cụm Gas1-GFP không có Mid2-iRFP. Những kết quả này cho thấy GPI-AP và các protein xuyên màng đã được tách ra thành các vùng màng ER khác nhau từ sớm. Cụm Gas1-GFP nằm liền kề với một ERES cụ thể được đánh dấu bằng protein vỏ COPII Sec13 của mCherry (Hình 1, E và F, và video S1) (23).
Tế bào sec31-1 biểu hiện các chất tiết do galactose gây ra, một chuỗi acyl dài (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, màu xanh lá cây) và protein xuyên màng Mid2-iRFP (TMP, màu xanh lam). Việc gắn nhãn ERES mang tính xây dựng Sec13-mCherry (ERES, màu đỏ tươi) được ủ ở 37°C trong 30 phút, sau đó chuyển sang 24°C và chụp ảnh bằng SCLIM 5 phút sau đó. (A đến C) cho thấy hình ảnh 2D đơn hoặc kết hợp tiêu biểu của một mặt phẳng (A), hình ảnh chiếu 2D của 10 mặt cắt z (B) hoặc hình ảnh bán cầu tế bào 3D của các chất vận chuyển và dấu ấn ERES (C). Thanh tỷ lệ 1μm (A và B). Đơn vị tỷ lệ là 0,551μm (C). Gas1-GFP được phát hiện trong các vùng hoặc cụm ER riêng biệt, trong khi Mid2-iRFP được phát hiện và phân bố khắp màng ER (C). (D) Biểu đồ thể hiện cường độ huỳnh quang tương đối của Gas1-GFP và Mid2-iRFP trong cụm Gas1-GFP dọc theo đường mũi tên màu trắng (bên trái). AU, đơn vị tùy ý. (E và F) thể hiện hình ảnh 3D kết hợp các thành phần và dấu hiệu ERES. Các cụm Gas1-GFP được phát hiện gần ERES cụ thể. Đơn vị tỷ lệ là 0,551μm. (F) Mũi tên liền màu trắng đánh dấu cụm Gas1-GFP liên kết với ERES. Các bảng ở giữa và bên phải hiển thị hình ảnh 3D phóng to được hợp nhất và chế độ xem xoay của cụm Gas1-GFP được chọn.
Mối quan hệ không gian gần gũi giữa cụm Gas1-GFP và một ERES cụ thể cho thấy Gas1-GFP có thể đi vào ERES chọn lọc, khác với tính chọn lọc mà Mid2-iRFP sử dụng để rời khỏi ER. Để giải quyết khả năng này, chúng tôi đã định lượng tỷ lệ ERES chỉ chứa một hoặc hai loại hàng hóa (Hình 2, A đến C). Chúng tôi nhận thấy rằng hầu hết các ERES (70%) chỉ chứa một loại hàng hóa. Hình ảnh phía dưới của Hình 2C cho thấy hai ví dụ điển hình về ERES chỉ chứa Gas1-GFP (Hình 1) hoặc chỉ chứa Mid2-iRFP (Hình 2). Ngược lại, khoảng 20% ​​ERES chứa hai loại hàng hóa chồng chéo trong cùng một khu vực. Người ta thấy rằng một số ERES (10%) chứa hai loại hàng hóa, nhưng chúng được phân lập ở các khu vực khác nhau rõ rệt. Do đó, phân tích thống kê này cho thấy rằng sau khi được xuất ra khỏi ER, GPI-AP Gas1-GFP và hàng hóa xuyên màng Mid2-iRFP được phân chia vào các ERES khác nhau (Hình 2D). Hiệu quả phân loại này rất nhất quán với phân tích sinh hóa trước đó (6) và xác định hình thái (7). Chúng ta cũng có thể quan sát hành vi của hàng hóa bị cách ly đi vào ERES (Hình 2E và Video S2). Hình 2E cho thấy chỉ một phần nhỏ Gas1-GFP (bảng 3) hoặc Mid2-iRFP (bảng 4) đi vào ERES từ một phía và bị giới hạn trong một khu vực riêng biệt. Bảng 5 của Hình 2E cho thấy Gas1-GFP và Mid2-iRFP đôi khi được tìm thấy trong cùng một ERES, nhưng chúng đi vào từ các phía khác nhau và tập trung ở các vùng riêng biệt có thể đại diện cho các túi COPII khác nhau. Chúng tôi cũng xác nhận rằng sự phân tách và phân loại Gas1 GPI-AP dựa trên ceramide C26 được quan sát là ERES chọn lọc là đặc hiệu vì một hàng hóa tiết qua màng khác, protein màng huyết tương gắn thẻ GFP Axl2 (27), cho thấy hành vi tương tự như Mid2-iRFP. (Hình S1 và Video S3). Axl2-GFP mới được tổng hợp được phân bố khắp màng ER giống như Mid2-iRFP (Hình S1, A và B), và cùng định vị với Mid2-iRFP trong hầu hết các ERES (Hình S1, B đến D). Bảng 1 và 2 của Hình 1. S1C cho thấy hai ví dụ điển hình về ERES, nơi hai chất vận chuyển xuyên màng chồng chéo lên nhau. Trong những trường hợp này, cả hai chất đều cùng đi vào ERES (Hình S1E, Bảng 3 và Video S3).
Các tế bào sec31-1 biểu hiện các chất tiết cảm ứng galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, màu xanh lá cây) và Mid2-iRFP (TMP, màu xanh lam) và chất đánh dấu ERES cấu thành Sec13-mCherry (ERES, màu đỏ tươi) được đặt ở 37°C. Sau khi ủ trong 30 phút ở 37°C, chuyển sang 24°C để giải phóng sự ức chế tiết, và chụp ảnh bằng SCLIM sau 20 phút. (A đến C) Hình ảnh chiếu 2D đại diện (A; thang đo, 1μm) hoặc hình ảnh bán cầu tế bào 3D (B và C; đơn vị thang đo, 0,456μm) của vật chất cần vận chuyển và 10 mặt cắt z được đánh dấu bằng ERES. Bảng dưới trong (B) và bảng trong (C) hiển thị hình ảnh đã được xử lý để chỉ hiển thị các vật chất có trong ERES (màu đỏ tươi) [Gas1-GFP (màu xám) và Mid2-iRFP (màu xanh lam nhạt)]. (C) Mũi tên mở: ERES chỉ mang một mảnh hàng hóa (1 đến 4). Mũi tên màu xám: ERES chứa hàng hóa được phân tách (5). Mũi tên màu trắng liền nét: ERES chứa hàng hóa cùng vị trí. Bên dưới: ERES đơn lẻ được chọn chỉ chứa Gas1-GFP (1) hoặc Mid2-iRFP (2). Thanh tỷ lệ, 100 nm. (D) Định lượng ảnh hiển vi được mô tả trong (C). Tỷ lệ phần trăm trung bình của ERES chỉ chứa một hàng hóa (Gas1-GFP hoặc Mid2-iRFP), hàng hóa được phân tách và hàng hóa chồng chéo. Trong ba thí nghiệm độc lập, n=432 trong 54 tế bào. Thanh lỗi = độ lệch chuẩn. Kiểm định t không ghép cặp hai phía. *** P = 0,0002. (E) Hình ảnh 3D của ERES được chọn chứa hàng hóa bị cách ly được đánh dấu bằng (C). Gas1-GFP (màu xanh lá cây) (3) hoặc Mid2-iRFP (màu xanh lam) (4) đi vào ERES (màu đỏ tươi) từ một phía và bị giới hạn trong một khu vực nhỏ bên trong ERES. Đôi khi, cả hai loại hàng hóa đều đi vào cùng một ERES (5) từ cùng một phía và bị giam giữ trong một khu vực biệt lập bên trong ERES. Thanh tỷ lệ, 100 nm.
Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra giả thuyết rằng ceramide chuỗi acyl dài (C26) có trong màng ER thúc đẩy sự tập hợp và phân loại cụ thể của Gas1 vào ERES chọn lọc. Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã sử dụng chủng nấm men GhLag1 đã được sửa đổi, trong đó hai enzyme tổng hợp ceramide nội sinh Lag1 và Lac1 được thay thế bằng GhLag1 (đồng đẳng Lag1 của bông), dẫn đến một chủng nấm men có chuỗi Ceramide màng tế bào ngắn hơn so với kiểu hoang dã (Hình 3A) (28). Phân tích khối phổ (MS) cho thấy rằng trong các chủng kiểu hoang dã, 95% tổng lượng ceramide là ceramide chuỗi rất dài (C26), trong khi ở GhLag1, 85% ceramide là ceramide chuỗi rất dài (C18 và C16), chỉ có 2% ceramide là ceramide chuỗi rất dài (C26). Mặc dù ceramide C18 và C16 là các ceramide chính được phát hiện trong màng GhLag1 cho đến nay, phân tích MS cũng xác nhận rằng neo GPI của Gas1-GFP được biểu hiện trong chủng GhLag1 chứa ceramide C26, có chất lượng tương đương với lipid kiểu hoang dã (Hình 3A) (26). Do đó, điều này có nghĩa là enzyme tái cấu trúc ceramide Cwh43 có tính chọn lọc cao đối với ceramide C26, như được thể hiện trong Hình 26, nó ưu tiên kết hợp neo GPI từ một lượng nhỏ ceramide C26 trong chủng GhLag1. S2 (29). Tuy nhiên, màng tế bào của GhLag1 về cơ bản chỉ chứa ceramide C18-C16, trong khi Gas1-GFP vẫn có ceramide C26. Thực tế này làm cho chủng này trở thành một công cụ lý tưởng để giải quyết cụ thể vấn đề về chiều dài chuỗi acyl của ceramide màng trong ER. Vai trò giả định của lớp và phân loại. Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu khả năng tích tụ thành cụm của C26 Gas1-GFP trong GhLag1 với alen đột biến nhạy cảm với nhiệt độ của sec31-1 thông qua kính hiển vi huỳnh quang thông thường, trong đó chỉ có chuỗi dài (C18-C16) tồn tại trong Ceramide màng ER (Hình 3). Chúng tôi quan sát thấy rằng trong sec31-1, hầu hết Gas1-GFP tập trung thành cụm, trong khi Gas1-GFP trong sec31-1 GhLag1 với màng ER ceramide dài (C18-C16) chủ yếu không tập trung thành cụm và phân bố trên toàn bộ màng ER. Chính xác hơn, vì sự tập trung dựa trên ceramide C26 có liên quan chặt chẽ đến ERES cụ thể (Hình 1), chúng tôi tiếp theo đã điều tra xem liệu quá trình này có liên quan đến chức năng của cơ chế protein xuất khẩu ER hay không. GPI-AP sử dụng hệ thống COPII đặc biệt để xuất khẩu ER, được điều chỉnh tích cực bởi sự tái cấu trúc cấu trúc của Ted1 đối với phần glycan của neo GPI (30, 31). GPI-glycan tái tổ hợp sau đó được nhận diện bởi phức hợp thụ thể vận chuyển xuyên màng p24, từ đó tuyển chọn Lst1, một dạng đồng phân cụ thể của tiểu đơn vị liên kết vận chuyển COPII chính Sec24, tạo thành các túi COPII giàu GPI-AP là cần thiết (31-33). Do đó, chúng tôi đã xây dựng một đột biến kép kết hợp việc xóa các protein đơn lẻ này (thành phần phức hợp p24 Emp24, enzyme tái cấu trúc GPI-glycan Ted1 và tiểu đơn vị COPII cụ thể Lst1) với chủng đột biến sec31-1 và nghiên cứu xem liệu chúng có thể hình thành cụm Gas1-GFP hay không (Hình 3). Chúng tôi quan sát thấy rằng ở sec31-1emp24Δ và sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP chủ yếu không tập trung và phân bố khắp màng ER, như đã thấy trước đây ở sec31-1 GhLag1, trong khi ở sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP tương tự như sec31-1. Những kết quả này cho thấy rằng ngoài sự hiện diện của ceramide C26 trong màng ER, sự tập trung của Gas1-GFP cũng cần liên kết với phức hợp p24, và không yêu cầu sự tuyển dụng Lst1 cụ thể. Sau đó, chúng tôi đã khám phá khả năng chiều dài chuỗi ceramide trong màng ER có thể điều chỉnh sự liên kết của Gas1-GFP với p24. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng sự hiện diện của ceramide C18-C16 trong màng không ảnh hưởng đến GPI-glycan được tái cấu trúc bởi phức hợp p24 (Hình S3 và S4, A và B) hoặc khả năng liên kết với GPI-AP và xuất khẩu GPI-AP. Tuyển dụng phân nhóm COPII Lst1 (Hình S4C). Do đó, sự tập hợp phụ thuộc vào ceramide C26 không yêu cầu tương tác protein với các cơ chế protein xuất khẩu ER khác nhau, mà hỗ trợ một cơ chế phân loại thay thế được thúc đẩy bởi chiều dài lipid. Sau đó, chúng tôi đã phân tích xem chiều dài chuỗi acyl ceramide trong màng ER có quan trọng đối với việc phân loại hiệu quả Gas1-GFP như là ERES chọn lọc hay không. Vì Gas1 trong chủng GhLag1 với ceramide chuỗi ngắn rời khỏi ER và đi vào màng huyết tương (Hình S5), chúng tôi tin rằng nếu sự phân loại được thúc đẩy bởi chiều dài của chuỗi acyl ceramide, Gas1 trong chủng GhLag1 có thể được định hướng lại và vượt qua các hàng hóa ERES có cùng màng.
(A) Màng tế bào của GhLag1 chủ yếu chứa các ceramide C18-C16 ngắn hơn, trong khi neo GPI của Gas1-GFP vẫn có IPC C26 giống như tế bào kiểu hoang dã. Phía trên: Phân tích chiều dài chuỗi acyl của ceramide trong màng tế bào của chủng kiểu hoang dã (Wt) và chủng GhLag1p bằng phương pháp phổ khối lượng (MS). Dữ liệu biểu thị phần trăm tổng số ceramide. Trung bình của ba thí nghiệm độc lập. Thanh lỗi = độ lệch chuẩn. Kiểm định t không ghép cặp hai phía. **** P < 0,0001. Bảng dưới: Phân tích MS về chiều dài chuỗi acyl của IPC có trong neo GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) được biểu hiện trong chủng kiểu hoang dã và chủng GhLag1p. Dữ liệu biểu thị phần trăm tổng tín hiệu IPC. Trung bình của năm thí nghiệm độc lập. Thanh lỗi = độ lệch chuẩn. Kiểm định t không ghép cặp hai phía. ns, không quan trọng. P = 0,9134. (B) Ảnh hiển vi huỳnh quang của các tế bào sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ và sec31-1lst1Δ biểu hiện Gas1-GFP cảm ứng bởi galactose được ủ ở 37°C trong 30 phút và chuyển xuống 24°C để thực hiện kính hiển vi huỳnh quang thông thường. Mũi tên trắng: Cụm Gas1-GFP trong lưới nội chất. Mũi tên mở: Gas1-GFP không tập trung được phân bố trên toàn bộ màng lưới nội chất, cho thấy đặc điểm nhuộm vòng nhân đặc trưng của lưới nội chất. Thanh tỷ lệ, 5μm. (C) Định lượng ảnh hiển vi được mô tả trong (B). Tỷ lệ phần trăm trung bình của các tế bào có cấu trúc Gas1-GFP dạng chấm. Trong ba thí nghiệm độc lập, n≥300 tế bào. Thanh lỗi = độ lệch chuẩn. Kiểm định t không ghép cặp hai phía. **** P ＜0,0001.
Để giải quyết trực tiếp vấn đề này, chúng tôi đã thực hiện hình ảnh hóa SCLIM của Gas1-GFP và Mid2-iRFP trong GhLag1 với alen đột biến nhạy cảm với nhiệt độ sec31-1 (Hình 4 và Video S4). Sau khi ER được giữ ở 37°C và sau đó được giải phóng ở 24°C, hầu hết Gas1-GFP mới được tổng hợp không tập trung thành cụm và phân bố khắp màng ER, như quan sát được bằng kính hiển vi thông thường (Hình 4, A và B). Ngoài ra, một tỷ lệ lớn ERES (67%) bao gồm hai loại hàng hóa cùng nằm trong đó (Hình 4D). Bảng 1 và 2 của Hình 4C cho thấy hai ví dụ điển hình về ERES với Gas1-GFP và Mid2-GFP chồng chéo nhau. Thêm vào đó, cả hai loại hàng hóa đều được tuyển vào cùng một ERES (Hình 4E, bảng 3 và video S4). Do đó, kết quả của chúng tôi cho thấy chiều dài của chuỗi acyl ceramide trong màng ER là một yếu tố quan trọng quyết định sự tập hợp và phân loại protein ER.
Tế bào Sec31-1 GhLag1 biểu hiện các chất tiết do galactose gây ra, Gas1-GFP (GPI-AP, màu xanh lá cây) và Mid2-iRFP (TMP, màu xanh lam) và Sec13-mCherry được gắn nhãn ERES (ERES, màu đỏ tươi). Ủ ở 37°C. Tiếp tục trong 30 phút, giảm xuống 24°C để giải phóng các chất tiết, và chụp ảnh bằng SCLIM sau 20 phút. (A đến C) Hình ảnh chiếu 2D đại diện (A; thang đo, 1μm) hoặc hình ảnh bán cầu tế bào 3D (B và C; đơn vị thang đo, 0,45μm) của 10 mặt cắt z được đánh dấu bởi chất vận chuyển và ERES. Bảng dưới trong (B) và bảng trong (C) hiển thị hình ảnh đã được xử lý để chỉ hiển thị các chất vận chuyển có trong ERES (màu đỏ tươi) [Gas1-GFP (màu xám) và Mid2-iRFP (màu xanh lam nhạt)]. (C) Mũi tên màu trắng: ERES, chất vận chuyển chồng lên nhau. Mũi tên mở: ERES chỉ chứa một mục. Bảng dưới: ERES được chọn có hàng hóa chồng chéo (1 và 2) được đánh dấu trong (C). Thanh tỷ lệ, 100 nm. (D) Định lượng ảnh hiển vi được mô tả trong (C). Trong các đơn vị sec31-1 và sec31-1 GhLag1, chỉ có một hàng hóa (Gas1-GFP hoặc Mid2-iRFP) được bao gồm, và tỷ lệ phần trăm trung bình của ERES đối với hàng hóa riêng lẻ và hàng hóa chồng chéo. Trong ba thí nghiệm độc lập, n = 432 trong 54 tế bào (sec31-1) và n = 430 trong 47 tế bào (sec31-1 GhLag1). Thanh lỗi = độ lệch chuẩn. Kiểm định t không ghép cặp hai phía. *** P = 0,0002 (sec31-1) và ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Hình ảnh 3D của ERES được chọn với hàng hóa chồng chéo (3) được đánh dấu trong (C). Gas1-GFP (màu xanh lá cây) và Mid2-iRFP (màu xanh lam) tiếp cận ERES (màu đỏ tươi) từ cùng một phía và nằm trong cùng một khu vực bị giới hạn bởi ERES. Thanh tỷ lệ, 100 nm.
Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng trực tiếp in vivo cho thấy các protein dựa trên lipid được phân loại vào các vị trí xuất khẩu chọn lọc trong con đường bài tiết, và tiết lộ tầm quan trọng của chiều dài chuỗi acyl đối với tính chọn lọc phân loại. Sử dụng kỹ thuật kính hiển vi tiên tiến và mạnh mẽ gọi là SCLIM, chúng tôi đã chứng minh Gas1-GFP mới được tổng hợp (một GPI-AP màng huyết tương chính với phần lipid ceramide có chuỗi acyl rất dài (C26)) trong nấm men. Các vùng tập trung trong ER riêng biệt được liên kết với ERES cụ thể, trong khi các protein tiết xuyên màng được phân bố khắp màng ER (Hình 1). Ngoài ra, hai loại hàng hóa này đi vào các ERES khác nhau một cách chọn lọc (Hình 2). Khi chiều dài chuỗi acyl của ceramide tế bào trong màng giảm từ C26 xuống C18-C16, cụm Gas1-GFP bị phân tán vào vùng ER riêng biệt, và Gas1-GFP được định tuyến lại để rời khỏi ER cùng với protein xuyên màng thông qua cùng một ERES (Hình 3 và Hình 4).
Mặc dù GPI-AP sử dụng cơ chế protein chuyên biệt để thoát khỏi ER, chúng tôi nhận thấy rằng sự phân tách phụ thuộc vào ceramide C26 không dựa vào các tương tác protein khác biệt có thể dẫn đến sự chuyên biệt hóa ERES (Hình S4 và S5). Thay vào đó, phát hiện của chúng tôi ủng hộ một cơ chế phân loại thay thế được thúc đẩy bởi sự tập hợp protein dựa trên lipid và sự loại trừ tiếp theo của các chất vận chuyển khác. Quan sát của chúng tôi chỉ ra rằng vùng hoặc cụm Gas1-GFP liên kết với một ERES cụ thể thiếu protein tiết xuyên màng Mid2-iRFP, điều này cho thấy cụm GPI-AP phụ thuộc vào ceramide C26 sẽ tạo điều kiện cho chúng đi vào ERES liên quan, đồng thời loại trừ các chất tiết xuyên màng đi vào ERES cụ thể này (Hình 1 và 2). Ngược lại, sự hiện diện của ceramide C18-C16 trong màng ER không làm cho GPI-AP hình thành các vùng hoặc cụm, do đó chúng không loại trừ hoặc thay thế các protein tiết xuyên màng vào cùng một ERES (Hình 3 và 4). Do đó, chúng tôi đề xuất rằng ceramide C26 thúc đẩy quá trình phân tách và phân loại bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho việc tập hợp các protein liên kết với các ERES cụ thể.
Làm thế nào để đạt được sự tập hợp phụ thuộc vào ceramide C26 này vào một khu vực ER cụ thể? Xu hướng phân tách theo chiều ngang của ceramide màng có thể khiến GPI-AP và ceramide C26 hình thành các lipid nhỏ và được sắp xếp tức thời trong môi trường lipid không đều hơn của màng ER chứa các glycerolipid ngắn hơn và không bão hòa. Các cụm chất lượng (17, 18). Những cụm nhỏ tạm thời này có thể được hợp nhất thêm thành các cụm lớn hơn, ổn định hơn sau khi liên kết với phức hợp p24 (34). Phù hợp với điều này, chúng tôi đã chỉ ra rằng C26 Gas1-GFP cần tương tác với phức hợp p24 để tạo thành các cụm lớn hơn có thể nhìn thấy (Hình 3). Phức hợp p24 là một oligomer dị hợp tử bao gồm bốn protein xuyên màng p24 khác nhau trong nấm men (35), cung cấp khả năng liên kết đa hóa trị, có thể dẫn đến liên kết chéo các cụm GPI-AP nhỏ, do đó tạo ra các cụm ổn định lớn hơn (34). Sự tương tác giữa các miền ngoại bào protein của GPI-AP cũng có thể góp phần vào sự kết tụ của chúng, như đã được chứng minh trong quá trình vận chuyển Golgi của chúng trong các tế bào biểu mô phân cực của động vật có vú (36). Tuy nhiên, khi ceramide C18-C16 có mặt trong màng ER, khi phức hợp p24 liên kết với Gas1-GFP, các cụm lớn riêng biệt sẽ không được hình thành. Cơ chế cơ bản có thể phụ thuộc vào các đặc tính vật lý và hóa học cụ thể của ceramide chuỗi acyl dài. Các nghiên cứu sinh lý học về màng nhân tạo cho thấy rằng mặc dù cả ceramide chuỗi acyl dài (C24) và ngắn (C18-C16) đều có thể gây ra sự phân tách pha, nhưng chỉ ceramide chuỗi acyl dài (C24) mới có thể thúc đẩy độ cong cao và uốn cong màng để định hình lại màng. Thông qua tham chiếu lẫn nhau (17, 37, 38). Người ta đã chứng minh rằng xoắn ốc xuyên màng của TMED2, đồng đẳng của Emp24 ở người, tương tác chọn lọc với sphingomyelin dựa trên ceramide C18 trong các thùy tế bào chất (39). Sử dụng mô phỏng động lực học phân tử (MD), chúng tôi nhận thấy rằng cả ceramide C18 và C26 đều tích tụ xung quanh các thùy tế bào chất của xoắn ốc xuyên màng Emp24, và chúng có những ưu tiên tương tự (Hình S6). Điều đáng chú ý là điều này cho thấy rằng xoắn ốc xuyên màng của Emp24 có thể dẫn đến sự phân bố lipid không đối xứng trong màng. Đây là một kết quả gần đây dựa trên các tế bào động vật có vú. Các mô phỏng MD tương tự cũng cho thấy sự hiện diện của lipid ether (40). Do đó, chúng tôi suy đoán rằng ceramide C26 trong hai thùy của ER26 được làm giàu cục bộ. Khi GPI-AP trong các thùy lòng ống liên kết trực tiếp với p24 đa hóa trị và sự tích tụ ceramide C26 xung quanh p24 trong các thùy tế bào chất, nó có thể thúc đẩy sự kết tụ protein đi kèm và độ cong màng được tạo ra thông qua các ngón tay (41), khiến GPI-AP tách ra thành các vùng riêng biệt liền kề với ERES, điều này cũng có lợi cho các vùng cong cao của màng ER (42). Các báo cáo trước đây đã ủng hộ cơ chế được đề xuất (43, 44). Sự liên kết đa hóa trị của oligolectin, mầm bệnh hoặc kháng thể với glycosphingolipid (GSL) dựa trên ceramide trên màng huyết tương kích hoạt sự kết tụ GSL lớn, tăng cường sự phân tách pha và gây ra biến dạng màng và nội hóa (44). Iwabuchi et al. (43) Người ta thấy rằng khi có mặt các chuỗi acyl dài (C24) nhưng không có chuỗi acyl ngắn (C16), phối tử đa hóa trị liên kết với GSL lactosylceramide gây ra sự hình thành các cụm lớn và lõm màng, và quá trình truyền tín hiệu trung gian Lyn trong tế bào chất trên các lá được xen kẽ bởi các chuỗi acyl trong bạch cầu trung tính liên kết.
Trong các tế bào biểu mô phân cực của động vật có vú, nồng độ của mạng lưới chống Golgi (TGN) ở mức màng plasma đỉnh kiểm soát sự phân tách và phân loại GPI-AP (10, 45). Sự tập hợp này được thúc đẩy bởi sự oligomer hóa GPI-AP (36), nhưng nó cũng có thể phụ thuộc vào chiều dài chuỗi ceramide mà chúng ta tìm thấy ở nấm men. Mặc dù GPI-AP của động vật có vú có neo dựa trên lipid ether, và cấu trúc hóa học của nó rất khác với ceramide chuỗi acyl rất dài, một nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng cả hai lipid đều có các tính chất và chức năng vật lý và hóa học tương tự về mặt tiến hóa (40). Do đó, phần lipid ether trong tế bào động vật có vú có thể tương tự như ceramide C26 trong nấm men, và vai trò của nó là liên kết với ceramide chuỗi dài trong màng để thúc đẩy sự tập hợp và phân loại GPI-AP. Mặc dù khả năng này vẫn cần được kiểm tra trực tiếp, nhưng những phát hiện trước đây ủng hộ rằng việc vận chuyển ceramide chuỗi acyl dài đến thể Golgi không được thực hiện bởi các protein vận chuyển tế bào chất, mà phụ thuộc vào quá trình tổng hợp các neo GPI giống như nấm men. Do đó, cơ chế bảo tồn tiến hóa dường như có khả năng vận chuyển đồng thời có chọn lọc ceramide chuỗi acyl rất dài và GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) trong cùng một túi vận chuyển.
Trong hệ thống tế bào biểu mô phân cực ở nấm men và động vật có vú, sự tập hợp và tách GPI-AP khỏi các protein màng huyết tương khác đều xảy ra trước khi đến bề mặt tế bào. Paladino et al. (48) phát hiện ra rằng trên TGN của tế bào biểu mô phân cực ở động vật có vú, sự tập hợp GPI-AP không chỉ cần thiết cho việc phân loại chọn lọc GPI-AP đến màng huyết tương đỉnh mà còn điều chỉnh tổ chức tập hợp của GPI-AP và hoạt động sinh học của nó trên bề mặt tế bào. Ở nấm men, nghiên cứu này cho thấy cụm GPI-AP phụ thuộc ceramide C26 trên ER có thể điều chỉnh tổ chức cụm và hoạt động chức năng của GPI-AP trên màng huyết tương (24, 49). Phù hợp với mô hình này, tế bào GhLag1 dị ứng với chất ức chế GPI hoặc thuốc ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của thành tế bào (28), và nhu cầu về các cụm Gas1-GFP chức năng (49) của ceramide đầu được chiếu trong quá trình giao phối của tế bào nấm men cho thấy hậu quả sinh lý có thể xảy ra của lỗi GPI-AP ở tế bào hLag1. Tuy nhiên, việc kiểm tra thêm xem liệu cấu trúc chức năng của bề mặt tế bào có được lập trình từ lưới nội chất bằng phương pháp phân loại dựa trên chiều dài lipid hay không sẽ là chủ đề nghiên cứu trong tương lai của chúng tôi.
Các chủng Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong công việc này được liệt kê trong Bảng S1. Các chủng MMY1583 và MMY1635 của SCLIM để chụp ảnh tế bào sống được xây dựng trên nền W303. Các chủng này biểu hiện Sec13-mCherry với thẻ protein huỳnh quang được xây dựng bằng phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với plasmid pFA6a làm khuôn mẫu (23). Chủng biểu hiện Mid2-iRFP được gắn nhãn protein huỳnh quang dưới sự kiểm soát của promoter GAL1 được xây dựng như sau: Khuếch đại PCR trình tự iRFP-KanMx từ vector pKTiRFP-KAN (quà tặng của E. O'Shea, số plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; mã định danh tài nguyên nghiên cứu (RRID): Addgene_64687) và chèn vào đầu C của Mid2 nội sinh. Sau khi trình tự gen Mid2-iRFP được khuếch đại và nhân bản vào vùng promoter GAL1, nó được tích hợp vào vị trí Not I-Sac I của plasmid tích hợp pRS306. Plasmid pRGS7 thu được sau đó được cắt bằng enzyme Pst I để tích hợp vào locus URA3.
Gen hợp nhất Gas1-GFP được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter GAL1 trong plasmid tâm động (CEN), được xây dựng như sau. Trình tự Gas1-GFP được khuếch đại bằng PCR từ plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (quà tặng của L. Popolo) và được nhân bản vào vị trí Xma I–Xho I của plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (quà tặng của C) Miller; số plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid thu được được đặt tên là pRGS6. Gen hợp nhất Axl2-GFP cũng được biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter GAL1 của vector pBEVY-GL LEU2, và cấu trúc của nó như sau. Trình tự Axl2-GFP được khuếch đại từ plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) bằng PCR và được nhân bản vào vị trí Bam HI-Pst I của vectơ pBEVY-GL LEU2. Plasmid thu được được đặt tên là pRGS12. Trình tự của các oligonucleotide được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng S2.
Chủng vi sinh được bổ sung 0,2% adenine và 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose], môi trường giàu protein chiết xuất nấm men (YP) (1% chiết xuất nấm men và 2% protein chiết xuất nấm men (YPR)] hoặc 2% galactose [YP-galactose (YPG)] làm nguồn carbon, hoặc trong môi trường tối thiểu tổng hợp (0,15% nitơ nấm men và 0,5% amoni sulfat) để bổ sung các axit amin và bazơ cần thiết cho dinh dưỡng, và chứa 2% glucose (môi trường tối thiểu glucose tổng hợp) hoặc 2% galactose (môi trường tối thiểu galactose tổng hợp) làm nguồn carbon.
Để chụp ảnh thời gian thực, các tế bào đột biến sec31-1 nhạy cảm với nhiệt độ biểu hiện cấu trúc dưới sự điều khiển của promoter GAL1 được nuôi cấy trong môi trường YPR ở 24°C qua đêm đến giai đoạn giữa pha logarit. Sau khi cảm ứng trong môi trường YPG ở 24°C trong 1 giờ, các tế bào được ủ trong môi trường SG ở 37°C trong 30 phút, sau đó chuyển sang 24°C để giải phóng khỏi sự ức chế tiết protein. Concanavalin A được sử dụng để cố định các tế bào trên lam kính và được chụp ảnh bằng SCLIM. SCLIM là sự kết hợp giữa kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược Olympus IX-71 và thấu kính dầu khẩu độ số UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), máy quét confocal đĩa quay tốc độ cao và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu cao (Yokogawa Electric), máy quang phổ tùy chỉnh và hệ thống làm mát tùy chỉnh. Bộ khuếch đại hình ảnh của hệ thống (Hamamatsu Photonics) có thể cung cấp hệ thống thấu kính phóng đại với độ phóng đại cuối cùng là ×266,7 và camera CCD nhân electron (Hamamatsu Photonics) (21). Việc thu thập hình ảnh được thực hiện bằng phần mềm tùy chỉnh (Yokogawa Electric). Đối với hình ảnh 3D, chúng tôi đã sử dụng bộ truyền động áp điện tùy chỉnh để rung thấu kính vật kính theo chiều dọc và thu thập các bộ phận quang học cách nhau 100 nm trong một chồng. Hình ảnh Z-stack được chuyển đổi thành dữ liệu voxel 3D và hàm phân tán điểm lý thuyết được sử dụng cho kính hiển vi confocal đĩa quay được sử dụng để xử lý khử nhiễu bằng phần mềm Volocity (PerkinElmer). Bằng cách sử dụng phần mềm Volocity để tự động thiết lập ngưỡng cho phân tích vị trí đồng thời, ERES bao gồm cả hàng hóa đã được đo đạc. Phân tích quét đường thẳng được thực hiện bằng phần mềm MetaMorph (Molecular Devices).
Sử dụng phần mềm GraphPad Prism để xác định ý nghĩa thống kê. Đối với phép kiểm định t hai phía của Student và phép phân tích phương sai một chiều thông thường (ANOVA), sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có tác động đáng kể khi P < 0,05 (*).
Đối với kính hiển vi huỳnh quang của Gas1-GFP, các tế bào ở pha logarit được nuôi cấy qua đêm trong YPD và thu thập bằng phương pháp ly tâm, rửa hai lần bằng dung dịch đệm phosphat và ủ trên đá trong ít nhất 15 phút, sau đó tiến hành quan sát dưới kính hiển vi như đã mô tả trước đây (Xem 24). Kính hiển vi Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) được trang bị thấu kính vật kính, bộ lọc L5 (GFP), camera Hamamatsu và phần mềm Application Suite X (LAS X) đã được sử dụng để thu thập dữ liệu.
Các mẫu được biến tính bằng dung dịch đệm mẫu SDS ở 65°C trong 10 phút, sau đó được tách bằng điện di gel polyacrylamide SDS (PAGE). Đối với phân tích miễn dịch học, 10 μl mẫu được cho vào mỗi làn. Kháng thể chính: Sử dụng kháng thể đa dòng thỏ chống Gas1 ở độ pha loãng 1:3000, kháng thể đa dòng thỏ chống Emp24 ở độ pha loãng 1:500 và kháng thể đa dòng thỏ chống GFP (do H. Riezman tặng) ở độ pha loãng 1:3000. Kháng thể đơn dòng chuột chống Pgk1 được sử dụng ở độ pha loãng 1:5000 (do J. de la Cruz tặng). Kháng thể thứ cấp: Kháng thể miễn dịch IgG dê chống thỏ liên hợp với peroxidase cải ngựa (HRP) được sử dụng ở độ pha loãng 1:3000 (Pierce). Kháng thể IgG kháng chuột liên hợp HRP từ dê được sử dụng ở độ pha loãng 1:3000 (Pierce). Vùng đáp ứng miễn dịch được quan sát bằng phương pháp phát quang hóa học của thuốc thử SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Như mô tả trong (31), một thí nghiệm kết tủa miễn dịch tự nhiên đã được thực hiện trên phân đoạn ER được làm giàu. Tóm lại, rửa tế bào nấm men bằng dung dịch đệm TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride và hỗn hợp chất ức chế protease] ở bước sóng 600 nm (OD600) với mật độ quang học 100 hai lần. Tế bào được nghiền bằng hạt thủy tinh, sau đó loại bỏ mảnh vụn tế bào và hạt thủy tinh bằng phương pháp ly tâm. Phần dịch nổi sau đó được ly tâm ở 17.000 g trong 15 phút ở 4°C. Phần cặn được hòa tan lại trong TNE và thêm saponin digitalis đến nồng độ cuối cùng là 1%. Hỗn dịch được ủ trong 1 giờ với sự khuấy trộn ở 4°C, sau đó các thành phần không tan được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 13.000 g ở 4°C trong 60 phút. Đối với phương pháp kết tủa miễn dịch Gas1-GFP, trước tiên ủ mẫu với các hạt agarose rỗng (ChromoTek) ở 4°C trong 1 giờ, sau đó ủ với GFP-Trap_A (ChromoTek) ở 4°C trong 3 giờ. Các hạt đã được kết tủa miễn dịch được rửa năm lần với dung dịch TNE chứa 0,2% digoxigenin, rửa giải bằng dung dịch đệm mẫu SDS, tách trên gel SDS-PAGE và phân tích bằng phương pháp Western blot.
Như đã mô tả trong (31), việc xác định liên kết chéo được thực hiện trên phân đoạn ER được làm giàu. Tóm lại, phân đoạn ER được làm giàu được ủ với 0,5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 phút). Phản ứng liên kết chéo được dừng lại bằng cách thêm glycine (nồng độ cuối cùng 50 mM, 5 phút, 20°C).
Như đã mô tả trước đây (50), phân tích MS của ceramide trong các chủng hoang dã và GhLag1 đã được thực hiện. Tóm lại, các tế bào được nuôi cấy đến pha tăng trưởng theo cấp số nhân (3 đến 4 đơn vị OD600/ml) trong YPD ở 30°C, và 25×107 tế bào được thu hoạch. Quá trình trao đổi chất của chúng được làm ngừng lại bằng axit trichloroacetic. Sử dụng dung môi chiết xuất [ethanol, nước, ether, pyridine và dung dịch amoni hydroxit 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] và 1,2 nmol chất chuẩn nội C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid chất lượng). Sử dụng thuốc thử monomethylamine [methanol, nước, n-butanol và dung dịch methylamine (4:3:1:5 v/v)] để thực hiện thủy phân kiềm nhẹ dịch chiết, sau đó sử dụng n-butanol bão hòa nước để khử muối. Cuối cùng, dịch chiết được hòa tan lại trong dung môi ở chế độ dương [chloroform/methanol/nước (2:7:1) + 5 mM amoni axetat] và được bơm vào máy quang phổ khối. Phương pháp giám sát đa phản ứng (MRM) được thực hiện để xác định và định lượng các phân tử sphingolipid. Máy quang phổ khối tứ cực bậc ba TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) được trang bị nguồn ion nanoflow tự động Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) để phân tích lipid. Năng lượng va chạm được tối ưu hóa cho từng loại ceramide. Dữ liệu MS được thu thập ở chế độ dương. Đối với mỗi mẫu sinh học, tín hiệu lipid là giá trị trung vị của ba phép đo độc lập.
Như mô tả trong (31), các tế bào (800×107) biểu hiện Gas1-GFP đã được tiến hành kết tủa miễn dịch tự nhiên. Gas1-GFP tinh khiết được tách bằng SDS-PAGE và chuyển sang màng polyvinylidene fluoride (PVDF). Protein được hiển thị bằng cách nhuộm PVDF với amide black. Dải Gas1-GFP được cắt ra khỏi PVDF và rửa 5 lần bằng methanol và một lần bằng nước tinh khiết dùng cho sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS). Bằng cách ủ dải màng với 500μl dung dịch đệm NaOAc 0,3 M (pH 4,0) và 500μl hỗn hợp natri nitrit 1 M mới hòa tan ở 37°C trong 3 giờ, phần lipid được giải phóng khỏi Gas1-GFP và bị phân giải. Giải phóng inosine phosphate ceramide giữa glucosamine và inositol (51). Sau đó, dải màng được rửa bốn lần bằng nước tinh khiết LC-MS, sấy khô ở nhiệt độ phòng và bảo quản trong môi trường nitơ ở -80°C cho đến khi phân tích. Để kiểm soát, một mẫu màng PVDF trắng được sử dụng cho mỗi thí nghiệm. Lipid được chiết xuất từ ​​Gas1-GFP sau đó được phân tích bằng MS như đã mô tả (50). Tóm lại, các dải PVDF chứa lipid GPI được hòa tan lại trong 75μl dung môi khuôn âm [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM amoni axetat] và được phân tích bằng phương pháp ion hóa phun điện (ESI)-MRM/MS đối với các loài sphingolipid (TSQ Vantage). Trong trường hợp này, dữ liệu MS được thu được ở chế độ ion âm.
Như đã đề cập trước đó, phần lipid của neo GPI được tách ra khỏi GPI-AP được dán nhãn [3H]-inositol (16). Các lipid được tách bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi (55:45:10 cloroform-metanol-0,25% KCl) và được hiển thị bằng FLA-7000 (Fujifilm).
Các tế bào biểu hiện Gas1-GFP (600×107) được rửa hai lần bằng dung dịch đệm TNE, sau đó phá vỡ bằng hạt thủy tinh và ly tâm để loại bỏ mảnh vụn tế bào và hạt thủy tinh. Dịch nổi được ly tâm ở 17.000 g trong 1 giờ ở 4°C. Phần cặn được rửa trong dung dịch TNE và ủ với 1 U PI-PLC (Invitrogen) trong dung dịch TNE chứa 0,2% saponin digitalis trong 1 giờ ở 37°C. Sau khi xử lý bằng enzyme, màng tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 17.000 g ở 4°C trong 1 giờ. Để kết tủa miễn dịch Gas1-GFP, dịch nổi được ủ với GFP-Trap_A (ChromoTek) ở 4°C qua đêm. Gas1-GFP tinh khiết được tách bằng SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie brilliant blue. Vạch nhuộm Gas1-GFP được cắt ra từ vùng màu xám bao quanh ống dẫn nước, sau đó, sau khi alkyl hóa bằng iodoacetamide và khử bằng dithiothreitol, tiến hành tiêu hóa trong gel bằng trypsin. Chiết xuất và làm khô các peptide tryptic và peptide có GPI-glycan. Peptide khô được hòa tan trong 20 μl nước. Tiêm một phần (8 μl) vào LC. Cột octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; đường kính trong 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, tỉnh Aichi, Nhật Bản) được sử dụng để tách các peptide trong điều kiện gradient cụ thể. Pha động là dung môi A (0,08% axit formic) và dung môi B (0,15% axit formic trong 80% acetonitrile). Hệ thống HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) được sử dụng để rửa giải cột bằng dung môi A trong vòng 55 phút với tốc độ dòng chảy 50 μl min-1 trong 5 phút, sau đó nồng độ dung môi B được tăng lên 40%. Dung dịch rửa giải được liên tục đưa vào nguồn ion ESI, và các peptide tryptic và peptide có GPI-glycan được phân tích bằng LTQ Orbitrap XL (máy quang phổ khối bẫy ion tuyến tính lai - bẫy ion; Thermo Fisher Scientific). Trong thiết lập MS, điện áp của nguồn mao dẫn được đặt ở mức 4,5 kV, và nhiệt độ của mao dẫn truyền được giữ ở mức 300°C. Điện áp mao dẫn và điện áp thấu kính ống được đặt lần lượt là 15 V và 50 V. Dữ liệu MS được thu thập ở chế độ ion dương (độ phân giải 60.000; độ chính xác khối lượng 10 phần triệu) trong dải khối lượng 300/tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z) 3000. Dữ liệu MS/MS được thu thập thông qua bẫy ion trong LTQ Orbitrap XL [3 chữ số đầu tiên mà dữ liệu phụ thuộc vào, phân ly do va chạm (CID)].
Các mô phỏng MD được thực hiện bằng phần mềm GROMACS (52) và trường lực MARTINI 2 (53-55). Sau đó, CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) được sử dụng để xây dựng một lớp kép chứa dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) và Cer C18 hoặc DOPC và Cer C26. Cấu trúc và tọa độ của Cer C26 được lấy từ DXCE bằng cách loại bỏ các hạt thừa từ đuôi sphingosine. Sử dụng quy trình được mô tả bên dưới để cân bằng lớp kép và chạy nó, sau đó sử dụng tọa độ cuối cùng của hệ thống để xây dựng một hệ thống chứa Emp24. Miền xuyên màng của Emp24 nấm men (các dư lượng từ 173 đến 193) được xây dựng dưới dạng xoắn α bằng cách sử dụng công cụ cấu trúc phân tử visual MD (VMD) (58). Sau đó, sau khi loại bỏ các lipid chồng chéo, protein được tạo hạt thô và chèn vào lớp kép bằng CHARMM GUI. Hệ thống cuối cùng chứa 1202 DOPC và 302 Cer C26 hoặc 1197 DOPC và 295 Cer C18 và Emp24. Ion hóa hệ thống đến nồng độ 0,150M. Bốn lần lặp lại độc lập được thực hiện cho hai thành phần lớp kép.
Lớp màng lipid được cân bằng bằng quy trình CHARMM GUI, bao gồm việc tối thiểu hóa và sau đó cân bằng 405.000 bước, trong đó các ràng buộc vị trí được giảm dần và loại bỏ, và bước thời gian được tăng từ 0,005 ps lên 0,02 ps. Sau khi cân bằng, nó tạo ra 6 µs với bước thời gian là 0,02 ps. Sau khi chèn Emp24, sử dụng cùng quy trình CHARMM GUI để tối thiểu hóa và cân bằng hệ thống, sau đó chạy trong 8 giây ở chế độ sản xuất.
Đối với tất cả các hệ thống, trong quá trình cân bằng, áp suất được điều khiển bởi bộ điều áp Berendsen (59), và trong quá trình sản xuất, áp suất được điều khiển bởi bộ điều áp Parrinello-Rahman (60). Trong tất cả các trường hợp, áp suất trung bình là 1 bar và sử dụng sơ đồ ghép nối áp suất bán đẳng hướng. Trong quá trình cân bằng và sản xuất, một bộ điều nhiệt (61) với khả năng hiệu chỉnh lại tốc độ được sử dụng để ghép nối nhiệt độ của các hạt protein, lipid và dung môi tương ứng. Trong toàn bộ quá trình hoạt động, nhiệt độ mục tiêu là 310K. Tương tác không liên kết được tính toán bằng cách tạo ra một danh sách ghép nối bằng cách sử dụng sơ đồ Verlet với dung sai đệm 0,005. Thuật ngữ Coulomb được tính toán bằng cách sử dụng trường phản ứng và khoảng cách cắt là 1,1 nm. Thuật ngữ Vander Waals sử dụng sơ đồ cắt với khoảng cách cắt là 1,1 nm, và sơ đồ cắt Verlet được sử dụng cho sự trôi dạt tiềm năng (62).
Sử dụng VMD, bước sóng cắt giữa các hạt phosphat DOPC hoặc hạt ceramide AM1 và protein là 0,7 nm, và số lượng lipid tương tác với protein được tính toán. Theo công thức sau, tính toán hệ số suy giảm-làm giàu (DE) như trong (63): Hệ số DE = (lượng lipid tổng cộng trong protein 0,7) trong protein 0,7 (lượng Cer trong tổng lipid)
Giá trị được báo cáo thu được dưới dạng giá trị trung bình, và các thanh lỗi biểu thị bốn bản sao độc lập của SE. Ý nghĩa thống kê của yếu tố DE được tính bằng phép kiểm định t [(trung bình DE-yếu tố-1)/SE]. Tính giá trị P từ phân phối một phía.
Công cụ GROMACS được sử dụng để tính toán bản đồ mật độ ngang 2D của hệ thống chứa Emp24 trong 250 ns cuối của quá trình theo dõi. Để thu được bản đồ làm giàu/giảm ceramide, bản đồ mật độ của Cer được chia cho tổng của bản đồ Cer và DOPC, sau đó chia cho nồng độ Cer trong cơ thể. Thang màu của bản đồ được sử dụng giống nhau.
Để xem tài liệu bổ sung cho bài viết này, vui lòng truy cập http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Đây là bài báo được truy cập mở, phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Creative Commons Ghi công phi thương mại, cho phép sử dụng, phân phối và sao chép trên mọi phương tiện, miễn là mục đích sử dụng cuối cùng không nhằm mục đích thương mại và giả định rằng tác phẩm gốc là chính xác. Tài liệu tham khảo.
Lưu ý: Chúng tôi chỉ yêu cầu bạn cung cấp địa chỉ email để người mà bạn giới thiệu đến trang này biết rằng bạn muốn họ xem email đó và đó không phải là thư rác. Chúng tôi sẽ không thu thập bất kỳ địa chỉ email nào.
Câu hỏi này được sử dụng để kiểm tra xem bạn có phải là khách truy cập hay không và ngăn chặn việc gửi thư rác tự động.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Hình ảnh 3D độ phân giải cao thời gian thực cho thấy tầm quan trọng của chiều dài chuỗi ceramide đối với việc phân loại protein tại các vị trí đầu ra chọn lọc.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Hình ảnh 3D độ phân giải cao thời gian thực cho thấy tầm quan trọng của chiều dài chuỗi ceramide đối với việc phân loại protein tại các vị trí đầu ra chọn lọc.
©2020 Hiệp hội vì sự tiến bộ của khoa học Hoa Kỳ. mọi quyền được bảo lưu. AAAS là đối tác của HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef và COUNTER. Khoa học nâng cao ISSN 2375-2548.