Javascript hiện đang bị vô hiệu hóa trong trình duyệt của bạn. Một số tính năng của trang web này sẽ không hoạt động khi Javascript bị vô hiệu hóa.
Hãy đăng ký với thông tin cá nhân cụ thể và loại thuốc bạn quan tâm, chúng tôi sẽ đối chiếu thông tin bạn cung cấp với các bài báo trong cơ sở dữ liệu rộng lớn của mình và gửi bản PDF cho bạn ngay lập tức qua email.
Thuốc dạng hạt Ban-Lan-Gen làm giảm viêm đại tràng mãn tính tái phát do dextran natri sulfat gây ra ở chuột bằng cách điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột và phục hồi sản xuất GLP-1 có nguồn gốc từ SCFA trong ruột.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Khoa Dược, Bệnh viện Đại học Bắc Kinh Thâm Quyến, Thâm Quyến, Cộng hòa Nhân dân Trung Quốc; 2Trường Dược, Trung tâm Khoa học Y tế Đại học Thâm Quyến, Thâm Quyến, Cộng hòa Nhân dân Trung Quốc; 3Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Kỹ thuật Y học Dân tộc và Phát triển và Ứng dụng Y học Cổ truyền Trung Quốc, Bộ Giáo dục, Đại học Y khoa Quý Châu, Phòng thí nghiệm trọng điểm cấp tỉnh về Dược, Đại học Y khoa Quý Châu, Quý Dương, Cộng hòa Nhân dân Trung Quốc; 4Khoa Tiêu hóa, Bệnh viện Đại học Bắc Kinh Thâm Quyến, Thâm Quyến, Cộng hòa Nhân dân Trung Quốc; 5Trường Dược, Đại học Y khoa Quý Châu, Phòng thí nghiệm trọng điểm cấp quốc gia về Chức năng và Ứng dụng Cây thuốc, Quý Dương; 6 Khoa Y học Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Bắc Kinh Thâm Quyến, Thâm Quyến, Trung Quốc [email protected] Shen Xiangchun, Trường Dược, Đại học Y Quý Châu, Quý Châu, Cộng hòa Nhân dân Trung Quốc, 550004, Email [email protected] Mục tiêu: Liệu pháp dựa trên GLP-1 là một lựa chọn điều trị mới cho bệnh viêm ruột. Thuốc dạng hạt Ban-Lan-Gen (BLG) là một chế phẩm Đông y kháng virus đã biết, có hoạt tính chống viêm tiềm năng trong điều trị nhiều tình trạng viêm khác nhau. Tuy nhiên, tác dụng chống viêm của nó đối với viêm đại tràng và cơ chế hoạt động của nó vẫn chưa rõ ràng. PHƯƠNG PHÁP: Thiết lập mô hình viêm đại tràng mãn tính tái phát do dextran natri sulfat (DSS) gây ra ở chuột. Các chỉ số hoạt động bệnh, các dấu hiệu mô học của tổn thương và nồng độ cytokine gây viêm được thực hiện để đánh giá tác dụng bảo vệ của BLG. Tác dụng của BLG đối với hệ vi sinh vật đường ruột và ruột được đặc trưng bởi nồng độ GLP-1 trong huyết thanh và biểu hiện Gcg, GPR41 và GRP43 ở đại tràng, thành phần hệ vi sinh vật đường ruột, nồng độ SCFAs trong phân và Giải phóng GLP-1 từ tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát và sản xuất GLP-1 có nguồn gốc từ SCFA. Kết quả: Điều trị bằng BLG làm giảm đáng kể tình trạng sụt cân, chỉ số DAI, rút ​​ngắn ruột kết, tổn thương mô ruột kết và nồng độ cytokine gây viêm TNF-α, IL-1β và IL-6 trong mô ruột kết. Ngoài ra, điều trị bằng BLG có thể phục hồi đáng kể biểu hiện Gcg, GPR41 và GRP43 trong ruột kết và nồng độ GLP-1 trong huyết thanh ở chuột bị viêm đại tràng, bằng cách tăng số lượng vi khuẩn sản sinh SCFA như Akkermansia và Prevotellaceae_UCG-001, đồng thời giảm số lượng vi khuẩn như Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas và Oscillibacter. Thêm vào đó, điều trị bằng BLG có thể làm tăng đáng kể nồng độ SCFA trong phân của chuột bị viêm đại tràng. Đồng thời, các thí nghiệm trong ống nghiệm cũng cho thấy dịch chiết phân của chuột được điều trị bằng BLG có thể kích thích mạnh mẽ các tế bào biểu mô ruột kết nhỏ nguyên phát của chuột tiết ra GLP-1. Kết luận: Những phát hiện này cho thấy BLG có tác dụng chống viêm đại tràng. BLG có tiềm năng được phát triển thành một liệu pháp, ít nhất là một phần bằng cách điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột và phục hồi sản xuất GLP-1 có nguồn gốc từ SCFA trong ruột. Thuốc đầy hứa hẹn cho bệnh viêm đại tràng mãn tính tái phát. Từ khóa: viêm đại tràng, viên nén Ban-Lan-Gen, hệ vi sinh vật đường ruột, axit béo chuỗi ngắn, GLP-1
Viêm loét đại tràng (UC) là một bệnh viêm mạn tính của đại tràng và trực tràng, đặc trưng bởi tiêu chảy tái phát, đau bụng, sụt cân và phân có máu mủ nhầy.¹ Gần đây, tỷ lệ mắc UC đang gia tăng ở các quốc gia trước đây có tỷ lệ mắc thấp, bao gồm cả Trung Quốc, cùng với sự phổ biến ngày càng tăng của lối sống phương Tây.² Sự gia tăng này gây ra những vấn đề lớn cho sức khỏe cộng đồng và có những tác động nghiêm trọng đến khả năng làm việc và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Đáng chú ý, cơ chế bệnh sinh của UC vẫn chưa được làm rõ, nhưng nhìn chung người ta chấp nhận rằng yếu tố di truyền, môi trường, hệ vi sinh vật đường ruột và hệ miễn dịch đều góp phần vào sự phát triển của UC.³ Ngay cả hiện nay, vẫn chưa có cách chữa khỏi UC, và mục tiêu điều trị lâm sàng là kiểm soát các triệu chứng lâm sàng, gây ra và duy trì sự thuyên giảm, thúc đẩy quá trình lành niêm mạc và giảm tái phát. Các phương pháp điều trị kinh điển bao gồm aminosalicylat, corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch và thuốc sinh học. Tuy nhiên, những loại thuốc này không thể đạt được hiệu quả mong muốn do nhiều tác dụng phụ khác nhau.⁴ Gần đây, nhiều nghiên cứu trường hợp đã chỉ ra rằng y học cổ truyền Trung Quốc (TCM) có tiềm năng lớn trong việc hỗ trợ điều trị UC. Giảm nhẹ viêm loét đại tràng với độc tính thấp, cho thấy việc phát triển các liệu pháp Y học cổ truyền mới là một chiến lược điều trị đầy hứa hẹn cho viêm loét đại tràng.5-7​​​
Thuốc dạng hạt Banlangen (BLG) là một chế phẩm y học cổ truyền Trung Quốc được bào chế từ chiết xuất nước của rễ cây Banlangen.8 Ngoài hiệu quả kháng virus, BLG còn thể hiện hoạt tính chống viêm tiềm năng trong điều trị nhiều tình trạng viêm khác nhau.9,10 Thêm vào đó, glucosinolate (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin và glucoside đã được phân lập và xác định từ chiết xuất nước của Radix isatidis) và nucleoside (hypoxanthine, adenosine, uridine và guanosine) và các alkaloid indigo như indigo và indirubin.11,12 Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rõ ràng rằng các hợp chất adenosine, uridine và indirubin thể hiện tác dụng chống viêm đại tràng mạnh mẽ trong các mô hình viêm đại tràng khác nhau trên động vật.13-17 Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu dựa trên bằng chứng nào được thực hiện để đánh giá hiệu quả của BLG trong điều trị viêm đại tràng. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã điều tra tác dụng bảo vệ của BLG đối với bệnh viêm đại tràng tái phát mãn tính do dextran natri sulfat (DSS) gây ra ở chuột C57BL/6. Các nghiên cứu trên chuột cho thấy việc sử dụng BLG đường uống làm giảm đáng kể tình trạng viêm đại tràng mãn tính tái phát do DSS gây ra ở chuột. Viêm, và các cơ chế điều hòa của nó, có liên quan đến việc điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột và phục hồi sản xuất peptide giống glucagon-1 (GLP-1) có nguồn gốc từ ruột.
Hạt BLG (không đường, được NMPA phê duyệt Z11020357; Công ty TNHH Phát triển Công nghệ Bắc Kinh Tongrentang, Bắc Kinh, Trung Quốc; số lô: 20110966) được mua từ các hiệu thuốc. DSS (Trọng lượng phân tử: 36.000–50.000 Dalton) được mua từ MP Biologicals (Santa Ana, Hoa Kỳ). Sulfasalazine (SASP) (độ tinh khiết ≥ 98%), hematoxylin và eosin được mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Hoa Kỳ). Bộ dụng cụ xét nghiệm ELISA Luminex TNF-α, IL-1β và IL-6 chuột được mua từ R&D Systems (Minneapolis, MN, Hoa Kỳ). Axit axetic, axit propionic và axit butyric được mua từ Aladdin Industries (Thượng Hải, Trung Quốc). Axit 2-ethylbutyric được mua từ Merck KGaA (Darmstadt, Đức).
Chuột đực C57BL/6 6-8 tuần tuổi (trọng lượng cơ thể 18-22 g) được mua từ Công ty TNHH Công nghệ Động vật Thí nghiệm Bắc Kinh Wetahe (Bắc Kinh, Trung Quốc) và được nuôi trong môi trường 22 ± 2 °C với chu kỳ sáng/tối 12 giờ. Chuột được cho ăn chế độ ăn tiêu chuẩn dành cho động vật gặm nhấm và được uống nước tự do trong một tuần để thích nghi với môi trường mới. Sau đó, chuột được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm: nhóm đối chứng, nhóm mô hình DSS, nhóm điều trị SASP (200 mg/kg, đường uống) và nhóm điều trị BLG (1 g/kg, đường uống). Như thể hiện trong Hình 1A, theo nghiên cứu trước đây của chúng tôi, bệnh viêm đại tràng mãn tính tái phát thực nghiệm được gây ra ở chuột bằng ba chu kỳ DSS 1,8% trong 5 ngày, sau đó là nước cất trong 7 ngày.¹⁸ Chuột trong nhóm điều trị SASP và BLG được điều trị bằng SASP và BLG tương ứng mỗi ngày bắt đầu từ ngày 0. Theo Trong các thí nghiệm sơ bộ, liều BLG được đặt ở mức 1 g/kg. Trong khi đó, liều SASP được đặt ở mức 200 mg/kg theo tài liệu tham khảo.4 Nhóm đối chứng và nhóm mô hình DSS nhận cùng một lượng nước trong suốt thí nghiệm.
Hình 1 BLG cải thiện tình trạng viêm đại tràng tái phát mãn tính do DSS gây ra ở chuột. (A) Thiết kế thí nghiệm về viêm đại tràng tái phát mãn tính và điều trị, (B) thay đổi trọng lượng cơ thể, (C) điểm số chỉ số hoạt động bệnh (DAI), (D) chiều dài đại tràng, (E) hình ảnh đại diện của đại tràng, (F) nhuộm H&E đại tràng (độ phóng đại, ×100) và (G) điểm số mô học. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 hoặc ###p < 0,001 so với nhóm đối chứng (Con); *p < 0,05 hoặc **p < 0,01 hoặc ***p < 0,001 so với nhóm DSS.
Cân nặng, độ đặc của phân và chảy máu trực tràng được ghi nhận hàng ngày. Chỉ số hoạt động bệnh (DAI) được xác định bằng cách kết hợp điểm số của cân nặng, độ đặc của phân và chảy máu trực tràng như đã mô tả trước đây.¹⁹ Vào cuối thí nghiệm, tất cả chuột đều được gây chết và máu, phân và đại tràng được thu thập để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Mô ruột kết được cố định bằng formalin và nhúng trong paraffin. Các lát cắt dày 5 micron được tạo ra và nhuộm bằng hematoxylin-eosin (H&E), sau đó được đánh giá mù và chấm điểm như đã mô tả trước đây.¹⁹
Tổng RNA của mô ruột kết được chiết xuất bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), tiếp theo là chiết xuất cDNA bằng enzyme phiên mã ngược (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Nhật Bản). PCR định lượng được thực hiện bằng hệ thống PCR thời gian thực với SYBR Green Master (Roche, Basel, Thụy Sĩ). Các bản sao gen mục tiêu được chuẩn hóa so với β-actin và dữ liệu được phân tích bằng phương pháp 2-ΔΔCT. Trình tự mồi gen được thể hiện trong Bảng 1.
Việc phân lập và nuôi cấy tế bào biểu mô ruột kết chuột sơ cấp được thực hiện như đã mô tả trước đây.20 Tóm lại, ruột kết của chuột 6-8 tuần tuổi được cắt bỏ sau khi giết mổ bằng phương pháp cắt cổ, sau đó được mở dọc theo chiều dài, xử lý bằng dung dịch muối cân bằng Hanks (HBSS, không chứa canxi và magiê) và cắt thành các mảnh nhỏ 0,5-1 mm. Tiếp theo, mô được tiêu hóa bằng 0,4 mg/mL collagenase XI (Sigma, Poole, Anh) trong môi trường DMEM không chứa và ly tâm ở 300 xg trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Hòa tan lại cặn trong môi trường DMEM (bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò, 100 đơn vị/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin) ở 37 °C và lọc qua lưới nylon (kích thước lỗ ~250 µm). Các phần tế bào biểu mô ruột kết được đặt trong đĩa đáy thủy tinh và ủ với Axit axetic, axit propionic, axit butyric và dịch chiết phân chuột được ủ trong 2 giờ ở 37°C, 5% CO2.
Mô ruột kết được đồng nhất hóa với PBS, và nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trong mô ruột kết được phát hiện bằng bộ dụng cụ xét nghiệm ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Tương tự, nồng độ GLP-1 trong huyết thanh và môi trường nuôi cấy tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA (Bioswamp, Vũ Hán, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Tổng lượng DNA từ phân được chiết xuất bằng bộ kit chiết xuất DNA (Tiangen, Trung Quốc). Chất lượng và số lượng DNA được đo ở tỷ lệ 260 nm/280 nm và 260 nm/230 nm tương ứng. Sau đó, sử dụng mỗi DNA được chiết xuất làm khuôn mẫu, các mồi đặc hiệu 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) và 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) được sử dụng để khuếch đại vùng V3-V4 của gen 16S rRNA ở các vùng khác nhau. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Đức), định lượng bằng PCR thời gian thực và giải trình tự bằng nền tảng giải trình tự IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, Hoa Kỳ). Để phân tích tin sinh học, quá trình xử lý dữ liệu được thực hiện theo các giao thức đã được báo cáo trước đó.21,22 Tóm lại, sử dụng Cutadapt (V1.9.1) để lọc các tệp express thô. Các OTU được phân cụm bằng cách sử dụng UPARSE (phiên bản 7.0.1001) với ngưỡng tương đồng là 97%, và UCHIME được sử dụng để loại bỏ các trình tự lai ghép. Phân tích thành phần cộng đồng và phân loại được thực hiện bằng cách sử dụng bộ phân loại RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) dựa trên cơ sở dữ liệu gen RNA ribosome SILVA.
Nồng độ các axit béo chuỗi ngắn (axit axetic, axit propionic và axit butyric) được đo như mô tả trước đây bởi Tao et al., với một số sửa đổi.23 Tóm lại, 100 mg phân được hòa tan trong 0,4 mL nước khử ion, sau đó thêm 0,1 mL axit sulfuric 50% và 0,5 mL axit 2-ethylbutyric (chất chuẩn nội), rồi đồng nhất hóa và đun nóng ở 4°C. Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ C. Phần dịch nổi được chiết xuất với 0,5 mL ete và tiêm vào máy sắc ký khí (GC) để phân tích. Đối với phân tích sắc ký khí (GC), các mẫu được phân tích bằng máy sắc ký khí GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) được trang bị đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID). Quá trình tách được thực hiện bằng cột ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Trung Quốc). Dữ liệu được thu thập bằng phần mềm GC solution (Shimadzu, Inc.). Tỷ lệ chia mẫu là 10:1, khí mang là nitơ, và tốc độ dòng chảy là 6 mL/phút. Thể tích tiêm là 1 μL. Nhiệt độ đầu phun và đầu dò là 300°C. Nhiệt độ lò được giữ ở 140°C trong 13,5 phút, sau đó tăng lên đến Tăng nhiệt độ lên 250°C với tốc độ 120°C/phút; giữ nhiệt độ đó trong 5 phút.
Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Ý nghĩa thống kê của dữ liệu được đánh giá bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) tiếp theo là kiểm định khoảng đa bội Duncan. Phần mềm GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) được sử dụng cho tất cả các phép tính và p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
UC được biết đến là một bệnh viêm đại tràng mạn tính tái phát với các triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy và xuất huyết. Do đó, mô hình viêm đại tràng mạn tính tái phát do DSS gây ra ở chuột đã được thiết lập để đánh giá hiệu quả chống viêm đại tràng của BLG (Hình 1A). So với nhóm đối chứng, chuột trong nhóm mô hình DSS có trọng lượng cơ thể giảm đáng kể và chỉ số DAI cao hơn, và những thay đổi này đã được đảo ngược đáng kể sau 24 ngày điều trị bằng BLG (Hình 1B và C). Sự rút ngắn đại tràng là một dấu hiệu quan trọng của UC. Như thể hiện trong Hình 1D và E, chiều dài đại tràng của chuột được điều trị bằng DSS đã bị rút ngắn đáng kể, nhưng đã được cải thiện nhờ điều trị bằng BLG. Sau đó, phân tích mô bệnh học đã được thực hiện để đánh giá tình trạng viêm đại tràng. Hình ảnh nhuộm H&E và điểm số bệnh lý cho thấy việc sử dụng DSS đã làm gián đoạn đáng kể cấu trúc đại tràng và dẫn đến phá hủy tuyến ruột, trong khi điều trị bằng BLG đã làm giảm đáng kể sự phá hủy tuyến ruột và điểm số bệnh lý (Hình 1F và G). Đáng chú ý, tác dụng bảo vệ của BLG ở liều 1 g/Kg tương đương với tác dụng của DSS. SASP ở liều 200 mg/Kg. Nhìn chung, những phát hiện này cho thấy BLG có hiệu quả trong việc giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm đại tràng mãn tính tái phát do DSS gây ra ở chuột.
TNF-α, IL-1β và IL-6 là những dấu ấn viêm quan trọng của viêm đại tràng. Như thể hiện trong Hình 2A, DSS gây ra sự gia tăng đáng kể biểu hiện gen của TNF-α, IL-1β và IL-6 trong đại tràng so với nhóm đối chứng. Việc sử dụng BLG có thể đảo ngược đáng kể những thay đổi do DSS gây ra. Tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng ELISA để xác định nồng độ các cytokine gây viêm TNF-α, IL-1β và IL-6 trong mô đại tràng. Kết quả cũng cho thấy nồng độ TNF-α, IL-1β và IL-6 trong đại tràng tăng lên đáng kể ở chuột được điều trị bằng DSS, trong khi điều trị bằng BLG đã làm giảm sự gia tăng này (Hình 2B).
Hình 2 BLG ức chế biểu hiện gen và sản xuất các cytokine gây viêm TNF-α, IL-1β và IL-6 trong đại tràng của chuột được điều trị bằng DSS. (A) Biểu hiện gen của TNF-α, IL-1β và IL-6 trong đại tràng; (B) nồng độ protein của TNF-α, IL-1β và IL-6 trong đại tràng. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 hoặc ##p < 0,01 hoặc ###p < 0,001 so với nhóm đối chứng (Con); *p < 0,05 hoặc **p < 0,01 so với nhóm DSS.
Rối loạn hệ vi sinh đường ruột đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của viêm loét đại tràng (UC).24 Để điều tra xem BLG có điều chỉnh hệ vi sinh đường ruột của chuột được điều trị bằng DSS hay không, phương pháp giải trình tự 16S rRNA đã được thực hiện để phân tích cộng đồng vi khuẩn trong ruột. Biểu đồ Venn cho thấy ba nhóm có chung 385 OTU. Đồng thời, mỗi nhóm đều có các OTU riêng biệt (Hình 3A). Hơn nữa, chỉ số Chao1 và chỉ số Shannon được thể hiện trong Hình 3B và C cho thấy sự đa dạng cộng đồng của hệ vi sinh đường ruột đã giảm ở chuột được điều trị bằng BLG, vì chỉ số Shannon giảm đáng kể ở nhóm được điều trị bằng BLG. Phân tích thành phần chính (PCA) và phân tích tọa độ chính (PCoA) đã được sử dụng để xác định các mô hình phân cụm giữa ba nhóm và cho thấy cấu trúc cộng đồng của chuột được điều trị bằng DSS được phân tách rõ ràng sau khi điều trị bằng BLG (Hình 3D và E). Những dữ liệu này cho thấy việc điều trị bằng BLG đã ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc cộng đồng của chuột bị viêm đại tràng do DSS gây ra.
Hình 3 BLG làm thay đổi sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột ở chuột bị viêm đại tràng do DSS gây ra. (A) Biểu đồ Venn của OTU, (B) Chỉ số Chao1, (C) Chỉ số độ phong phú Shannon, (D) Biểu đồ điểm Phân tích thành phần chính (PCA) của OTU, (E) Điểm Phân tích tọa độ chính (PCoA) của OTU. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 6). **p < 0,01 so với nhóm DSS.
Để đánh giá những thay đổi cụ thể trong hệ vi sinh vật đường ruột, chúng tôi đã phân tích thành phần hệ vi sinh vật đường ruột ở tất cả các cấp độ phân loại. Như thể hiện trong Hình 4A, các ngành chính trong tất cả các nhóm là Firmicutes và Bacteroidetes, tiếp theo là Verrucomicrobia. Tỷ lệ tương đối của Firmicutes và tỷ lệ Firmicutes/Bacteroidetes tăng lên đáng kể trong cộng đồng vi sinh vật đường ruột của chuột được điều trị bằng DSS so với chuột đối chứng, và những thay đổi này đã được đảo ngược đáng kể sau khi điều trị bằng BLG. Đặc biệt, điều trị bằng BLG đã làm tăng đáng kể tỷ lệ tương đối của Verrucobacterium trong phân của chuột bị viêm đại tràng do DSS gây ra. Ở cấp độ hộ gia đình, cộng đồng vi sinh vật đường ruột bao gồm Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae và Prevotellaceae (Hình 4B). So với nhóm DSS, việc loại bỏ BLG đã làm tăng số lượng Akkermansiaceae, nhưng làm giảm số lượng Lachnospiraceae và Ruminococcaceae. Đáng chú ý, ở Ở cấp độ chi, hệ vi sinh vật trong phân chủ yếu bao gồm Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia và Prevotellaceae_UCG-001 (Hình 4C). Phát hiện này cũng cho thấy rằng việc điều trị bằng BLG đã đảo ngược hiệu quả sự mất cân bằng hệ vi sinh vật khi bị thách thức bởi DSS, đặc trưng bởi sự giảm Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas và Oscillibacter, và sự gia tăng Akkermansia và Prevotellaceae_UCG-001.
Hình 4 BLG làm thay đổi sự phong phú của hệ vi sinh vật đường ruột ở chuột bị viêm đại tràng do DSS gây ra. (A) Sự phong phú của hệ vi sinh vật đường ruột ở cấp độ ngành; (B) Sự phong phú của hệ vi sinh vật đường ruột ở cấp độ họ; (C) Sự phong phú của hệ vi sinh vật đường ruột ở cấp độ chi. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 6). #p < 0,05 hoặc ###p < 0,001 so với nhóm đối chứng (Con); *p < 0,05 hoặc **p < 0,01 hoặc ***p < 0,001 so với nhóm DSS.
Xét rằng axit béo chuỗi ngắn (SCFA) là chất chuyển hóa chính của Akkermansia và Prevotellaceae_UCG-001, trong khi axetat, propionat và butyrat là các SCFA dồi dào nhất trong lòng ruột, 25-27 chúng tôi vẫn đang trong quá trình nghiên cứu. Như thể hiện trong Hình 5, nồng độ axetat, propionat và butyrat trong phân đã giảm đáng kể ở nhóm được điều trị bằng DSS, trong khi điều trị bằng BLG có thể ngăn chặn phần lớn sự giảm này.
Hình 5. BLG làm tăng nồng độ SCFAs trong phân của chuột bị viêm đại tràng do DSS gây ra. (A) Hàm lượng axit axetic trong phân; (B) hàm lượng axit propionic trong phân; (C) hàm lượng axit butyric trong phân. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 6). #p < 0,05 hoặc ##p < 0,01 so với nhóm đối chứng (Con); *p < 0,05 hoặc **p < 0,01 so với nhóm DSS.
Chúng tôi tiếp tục tính toán hệ số tương quan Pearson giữa SCFA khác biệt ở cấp độ chi và hệ vi sinh vật trong phân. Như thể hiện trong Hình 6, Akkermansia có tương quan dương với sự sản xuất axit propionic (Pearson = 0,4866) và axit butyric (Pearson = 0,6192). Ngược lại, cả Enteromonas và Oscillobacter đều có liên quan âm với sự sản xuất acetate, với hệ số Pearson lần lượt là 0,4709 và 0,5104. Tương tự, Ruminococcaceae_UCG-014 có tương quan âm với sự sản xuất axit propionic (Pearson = 0,4508) và axit butyric (Pearson = 0,5842).
Hình 6 Phân tích tương quan Pearson giữa các SCFA khác nhau và vi khuẩn đường ruột. (A) Enteromonas với axit axetic; (B) Vi khuẩn Concussion với axit axetic; (C) Akkermansia với axit propionic; (D) Ruminococcus_UCG-014 với axit propionic; (E) Akkermansia với axit butyric; (F) Ruminococcus _UCG-014 với axit butyric.
Peptide giống glucagon-1 (GLP-1) là sản phẩm sau dịch mã đặc hiệu theo loại tế bào của proglucagon (Gcg) với đặc tính chống viêm.28 Như thể hiện trong Hình 7, DSS gây ra sự giảm đáng kể biểu hiện mRNA của Gcg. Điều trị đại tràng và BLG có thể đảo ngược đáng kể sự giảm Gcg do DSS gây ra so với nhóm đối chứng (Hình 7A). Đồng thời, nồng độ GLP-1 trong huyết thanh giảm đáng kể ở nhóm được điều trị bằng DSS, và điều trị bằng BLG có thể ngăn chặn phần lớn sự giảm này (Hình 7B). Vì axit béo chuỗi ngắn có thể kích thích tiết GLP-1 thông qua hoạt hóa thụ thể liên kết protein G 43 (GRP43) và thụ thể liên kết protein G 41 (GRP41), chúng tôi cũng đã kiểm tra GPR41 và GRP43 trong đại tràng của chuột bị viêm đại tràng và thấy rằng biểu hiện mRNA của GRP43 và GPR41 trong đại tràng giảm đáng kể sau khi gây viêm bằng DSS, và điều trị bằng BLG có thể khắc phục hiệu quả sự giảm này (Hình 7B). 7C và D).
Hình 7 BLG làm tăng nồng độ GLP-1 trong huyết thanh và biểu hiện mRNA của Gcg, GPR41 và GRP43 trong đại tràng ở chuột được điều trị bằng DSS. (A) Biểu hiện mRNA của Gcg trong mô đại tràng; (B) Nồng độ GLP-1 trong huyết thanh; (C) Biểu hiện mRNA của GPR41 trong mô đại tràng; (D) Biểu hiện mRNA của GPR43 trong mô đại tràng. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 hoặc ##p < 0,01 so với nhóm đối chứng (Con); *p < 0,05 so với nhóm DSS.
Vì điều trị bằng BLG có thể làm tăng nồng độ GLP-1 trong huyết thanh, biểu hiện mRNA Gcg ở đại tràng và nồng độ SCFA trong phân ở chuột được điều trị bằng DSS, chúng tôi đã tiếp tục kiểm tra acetate, propionate và butyrate cũng như từ chuột đối chứng (F-Con), chuột viêm đại tràng do DSS (F-Con) và chuột viêm đại tràng được điều trị bằng BLG (F-BLG) về sự giải phóng GLP-1 từ các tế bào biểu mô đại tràng nguyên phát của chuột. Như thể hiện trong Hình 8A, các tế bào biểu mô đại tràng nguyên phát của chuột được xử lý bằng axit axetic, axit propionic và axit butyric 2 mM, tương ứng, đã kích thích đáng kể sự giải phóng GLP-1, phù hợp với các nghiên cứu trước đây.29,30 Tương tự, tất cả các nhóm F-Con, F-DSS và F-BLG (tương đương với 0,25 g phân) đều kích thích mạnh mẽ sự giải phóng GLP-1 từ các tế bào biểu mô đại tràng nguyên phát của chuột. Đáng chú ý, lượng GLP-1 được giải phóng bởi các tế bào biểu mô đại tràng nguyên phát của chuột được điều trị bằng F-DSS thấp hơn nhiều so với lượng được giải phóng bởi các nhóm đối chứng (F-DSS). Các tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát được xử lý bằng F-Con và F-BLG (Hình 8B). Dữ liệu này cho thấy việc điều trị bằng BLG đã phục hồi đáng kể quá trình sản xuất GLP-1 có nguồn gốc từ SCFA ở ruột.
Hình 8. SCFA có nguồn gốc từ BLG kích thích giải phóng GLP-1 từ các tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát. (A) Axit axetic, axit propionic và axit butyric kích thích giải phóng GLP-1 từ các tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát; (B) Chiết xuất phân F-Con, F-DSS và F-BLG kích thích các tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát. Lượng GLP-1 được giải phóng. Các phần mẫu tế bào biểu mô ruột kết được đặt trong đĩa petri đáy thủy tinh và được xử lý lần lượt với 2 mM axit axetic, axit propionic, axit butyric và chiết xuất phân F-Con, F-DSS và F-BLG (tương đương với 0,25 g phân). Ủ trong 2 giờ ở 37°C, 5% CO2. Lượng GLP-1 được giải phóng từ các tế bào biểu mô ruột kết chuột nguyên phát được phát hiện bằng ELISA. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (n = 3). #p < 0,05 hoặc ##p < 0,01 so với mẫu trắng hoặc F-Con; *p < 0,05 so với F-DSS.
Các chữ viết tắt: Ace, axit axetic; Pro, axit propionic; however, axit butyric; F-Con, dịch chiết phân từ chuột đối chứng; F-DSS, dịch chiết phân từ chuột bị viêm đại tràng; F-BLG, dịch chiết phân từ đại tràng được điều trị bằng BLG của chuột bị viêm.
Được Tổ chức Y tế Thế giới liệt vào danh sách các bệnh khó điều trị, viêm loét đại tràng đang trở thành mối nguy hiểm toàn cầu; Tuy nhiên, các phương pháp hiệu quả để dự đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh viêm loét đại tràng (UC) vẫn còn hạn chế. Do đó, cần thiết phải nghiên cứu và phát triển các chiến lược điều trị mới an toàn và hiệu quả cho UC. Các chế phẩm y học cổ truyền Trung Quốc là một lựa chọn đầy hứa hẹn vì nhiều chế phẩm y học cổ truyền Trung Quốc đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị UC ở người Trung Quốc qua nhiều thế kỷ, và chúng đều là các chất hữu cơ sinh học và nguyên liệu tự nhiên, hầu hết không gây hại cho người và động vật.31,32 Nghiên cứu này nhằm mục đích tìm kiếm một chế phẩm y học cổ truyền Trung Quốc an toàn và hiệu quả để điều trị UC và khám phá cơ chế hoạt động của nó. BLG là một bài thuốc thảo dược nổi tiếng của Trung Quốc được sử dụng để điều trị cúm.8,33 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của chúng tôi và các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng chàm, một sản phẩm y học cổ truyền Trung Quốc được chế biến từ cùng nguyên liệu thô với BLG, cho thấy hiệu quả đáng kể trong điều trị UC ở người và động vật.4,34 Tuy nhiên, tác dụng chống viêm đại tràng của BLG và cơ chế tác dụng của nó vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu hiện tại, kết quả của chúng tôi cho thấy BLG làm giảm hiệu quả tình trạng viêm đại tràng do DSS gây ra, có liên quan đến sự điều hòa chức năng ruột. hệ vi sinh vật và phục hồi quá trình sản xuất GLP-1 từ ruột.
Ai cũng biết rằng viêm loét đại tràng (UC) đặc trưng bởi các giai đoạn tái phát với các triệu chứng lâm sàng điển hình, chẳng hạn như sụt cân, tiêu chảy, chảy máu trực tràng và tổn thương niêm mạc đại tràng lan rộng.35 Do đó, viêm đại tràng tái phát mãn tính được gây ra bằng cách cho chuột uống ba chu kỳ DSS 1,8% trong năm ngày, sau đó là bảy ngày uống nước. Như thể hiện trong Hình 1B, sự dao động về sụt cân và điểm DAI cho thấy việc gây ra viêm đại tràng tái phát mãn tính đã thành công. Chuột trong nhóm được điều trị bằng BLG cho thấy sự phục hồi tốt hơn từ ngày thứ 8, khác biệt đáng kể so với ngày thứ 24. Những thay đổi tương tự cũng được quan sát thấy ở điểm DAI, cho thấy sự cải thiện về tình trạng lâm sàng của viêm đại tràng. Về tổn thương đại tràng và tình trạng viêm, chiều dài đại tràng, tổn thương mô đại tràng, biểu hiện gen và sản xuất các cytokine gây viêm TNF-α, IL-1β và IL-6 trong mô đại tràng cũng được cải thiện đáng kể sau khi điều trị bằng BLG. Nhìn chung, những kết quả này chứng minh rõ ràng rằng BLG có hiệu quả trong điều trị viêm đại tràng tái phát mãn tính ở chuột.
BLG phát huy tác dụng dược lý như thế nào? Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của viêm loét đại tràng (UC), và các liệu pháp dựa trên hệ vi sinh vật và nhắm mục tiêu vào hệ vi sinh vật đã nổi lên như một chiến lược rất hấp dẫn để điều trị UC. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã chứng minh rằng điều trị bằng BLG dẫn đến những thay đổi đáng kể trong thành phần hệ vi sinh vật đường ruột, cho thấy tác dụng bảo vệ của BLG chống lại viêm đại tràng do DSS gây ra có liên quan đến việc điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột. Quan sát này phù hợp với quan điểm cho rằng việc lập trình lại sự cân bằng nội môi của hệ vi sinh vật đường ruột là một cách tiếp cận quan trọng để hiểu được hiệu quả của các chế phẩm Y học cổ truyền Trung Quốc.36,37 Đáng chú ý, Akkermansia là một loại vi khuẩn Gram âm và kỵ khí nghiêm ngặt sống trong lớp niêm mạc của ruột, phân hủy mucin, sản xuất axit propionic, kích thích sự biệt hóa tế bào hình chén và duy trì chức năng của niêm mạc.26 Nhiều dữ liệu lâm sàng và động vật cho thấy Akkermansia có liên quan mật thiết đến niêm mạc khỏe mạnh,38 và việc sử dụng Akkermansia spp. bằng đường uống. có thể cải thiện đáng kể tình trạng viêm niêm mạc.39 Dữ liệu hiện tại của chúng tôi cho thấy rằng sự phong phú tương đối của Akkermansia tăng lên đáng kể sau khi điều trị bằng BLG. Ngoài ra, Prevotellaceae_UCG-001 là một loại vi khuẩn sản sinh SCFA.27 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Prevotellaceae_UCG-001 được tìm thấy với số lượng tương đối thấp trong phân của động vật bị viêm đại tràng.40,41 Dữ liệu hiện tại của chúng tôi cũng cho thấy rằng điều trị bằng BLG có thể làm tăng đáng kể số lượng tương đối của Prevotellaceae_UCG-001 trong đại tràng của chuột được điều trị bằng DSS. Ngược lại, Oscillibacter là một loại vi khuẩn ưa nhiệt, kỵ khí nghiêm ngặt.42 báo cáo rằng số lượng tương đối của Oscillibacter tăng lên đáng kể ở chuột UC và có tương quan dương đáng kể với mức IL-6 và IL-1β cũng như điểm số bệnh lý.43,44 Đáng chú ý, điều trị bằng BLG đã làm giảm đáng kể số lượng tương đối của Oscillibacter trong phân của chuột được điều trị bằng DSS. Đáng chú ý, những vi khuẩn bị biến đổi bởi BLG này là những vi khuẩn sản sinh SCFA nhiều nhất. Nhiều nghiên cứu trước đây đã đã chứng minh tác dụng có lợi tiềm tàng của SCFAs đối với tình trạng viêm đại tràng và bảo vệ tính toàn vẹn của biểu mô ruột.45,46 Dữ liệu hiện tại của chúng tôi cũng quan sát thấy rằng nồng độ SCFA acetate, propionate và butyrate trong phân được điều trị bằng DSS đã tăng lên đáng kể ở chuột được điều trị bằng BLG. Tóm lại, những phát hiện này chứng minh rõ ràng rằng điều trị bằng BLG có thể tăng cường hiệu quả vi khuẩn sản sinh SCFA do DSS gây ra ở chuột mắc bệnh viêm đại tràng mãn tính tái phát.
GLP-1 là một incretin chủ yếu được sản xuất ở hồi tràng và đại tràng, đóng vai trò quan trọng trong việc làm chậm quá trình làm rỗng dạ dày và hạ đường huyết sau bữa ăn.47 Bằng chứng cho thấy dipeptidyl peptidase (DPP)-4, một chất chủ vận thụ thể GLP-1, và thuốc nano GLP-1 có thể làm giảm viêm ruột hiệu quả ở chuột.48-51 Như đã báo cáo trong các nghiên cứu trước đây, nồng độ SCFA cao có liên quan đến nồng độ GLP-1 trong huyết tương ở người và chuột. 52 Dữ liệu hiện tại của chúng tôi cho thấy sau khi điều trị bằng BLG, nồng độ GLP-1 trong huyết thanh và biểu hiện mRNA Gcg đã tăng lên đáng kể. Tương tự, sự tiết GLP-1 đã tăng lên đáng kể trong nuôi cấy đại tràng sau khi kích thích bằng chiết xuất phân từ chuột viêm đại tràng được điều trị bằng BLG so với kích thích bằng chiết xuất phân từ chuột viêm đại tràng được điều trị bằng DSS. SCFA ảnh hưởng đến sự giải phóng GLP-1 như thế nào? Gwen Tolhurst và cộng sự. đã báo cáo rằng SCFA có thể kích thích tiết GLP-1 thông qua GRP43 và GPR41.29 Dữ liệu hiện tại của chúng tôi cũng cho thấy rằng điều trị bằng BLG làm tăng đáng kể biểu hiện mRNA của GRP43 và GPR41 trong đại tràng của chuột được điều trị bằng DSS. Những dữ liệu này cho thấy rằng điều trị bằng BLG có thể khôi phục quá trình sản xuất GLP-1 do SCFA thúc đẩy bằng cách kích hoạt GRP43 và GPR41.
BLG là một loại thuốc không cần kê đơn (OTC) được sử dụng lâu dài tại Trung Quốc. Liều BLG tối đa dung nạp được ở chuột Kunming là 80g/kg, và không quan sát thấy độc tính cấp tính nào.53 Hiện nay, liều BLG (không đường) được khuyến cáo ở người là 9-15 g/ngày (3 lần/ngày). Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy BLG ở liều 1g/kg đã cải thiện tình trạng viêm đại tràng mãn tính tái phát do DSS gây ra ở chuột. Liều này gần với liều BLG được sử dụng trong lâm sàng. Nghiên cứu của chúng tôi cũng phát hiện ra rằng cơ chế hoạt động của nó được trung gian, ít nhất một phần, bởi sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột, cụ thể là các vi khuẩn sản sinh SCFA, chẳng hạn như Akkermansia và Prevotellaceae_UCG-001, để phục hồi sản xuất GLP-1 có nguồn gốc từ ruột. Những phát hiện này cho thấy BLG xứng đáng được xem xét thêm như một tác nhân điều trị tiềm năng cho điều trị viêm đại tràng lâm sàng. Tuy nhiên, cơ chế chính xác mà nó điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột vẫn cần được xác nhận bằng chuột thiếu vi sinh vật và cấy ghép vi khuẩn phân.
Ace, axit axetic; but, axit butyric; BLG, lá dứa; DSS, dextran natri sulfat; DAI, chỉ số hoạt động bệnh; DPP, dipeptidyl peptidase; FID, máy dò ion hóa ngọn lửa; F-Con, mẫu đối chứng; F-DSS, mẫu phân của chuột bị viêm đại tràng do DSS; F-BLG, mẫu phân của chuột bị viêm đại tràng được điều trị bằng BLG; GLP-1, peptide giống glucagon-1; Gcg, glucagon; gas chromatography, sắc ký khí; GRP43, thụ thể liên kết protein G 43; GRP41, thụ thể liên kết protein G 41; H&E, nhuộm hematoxylin-eosin; HBSS, dung dịch muối cân bằng Hanks; OTC, thuốc không kê đơn; PCA, phân tích thành phần chính; PCoA, phân tích tọa độ chính; Pro, axit propionic; SASP, sulfasalazine; SCFA, axit béo chuỗi ngắn; Chinese medicine, y học cổ truyền Trung Quốc; UC, viêm loét đại tràng.
Tất cả các quy trình thí nghiệm đều được Ủy ban Đạo đức Động vật của Trung tâm Y tế Đại học Bắc Kinh - Đại học Khoa học và Công nghệ Hồng Kông (Thâm Quyến, Trung Quốc) phê duyệt theo Hướng dẫn và Quy định về Động vật của cơ sở (mã số đạo đức A2020157).
Tất cả các tác giả đều đóng góp đáng kể vào việc hình thành ý tưởng và thiết kế, thu thập dữ liệu, hoặc phân tích và diễn giải dữ liệu; tham gia soạn thảo bài báo hoặc chỉnh sửa quan trọng nội dung trí tuệ; đồng ý gửi bản thảo đến tạp chí hiện tại; cuối cùng phê duyệt phiên bản để xuất bản; chịu trách nhiệm về mọi khía cạnh của công việc.
Công trình này được hỗ trợ bởi Quỹ Khoa học Tự nhiên Quốc gia Trung Quốc (81560676 và 81660479), dự án hạng nhất của Đại học Thâm Quyến (86000000210), Quỹ Ủy ban Đổi mới Khoa học và Công nghệ Thâm Quyến (JCYJ20210324093810026), và Quỹ Nghiên cứu Khoa học và Công nghệ Y tế tỉnh Quảng Đông (A2020157 và A2020272), Phòng thí nghiệm trọng điểm tỉnh Quý Châu do Khoa Dược, Đại học Y khoa Quý Châu tài trợ (YWZJ2020-01) và Bệnh viện Đại học Bắc Kinh tại Thâm Quyến (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Tiềm năng điều trị của triptolide như một chất chống viêm trong bệnh viêm đại tràng thực nghiệm do dextran natri sulfat gây ra ở chuột. pre-immune. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Gánh nặng toàn cầu của bệnh viêm ruột mãn tính: từ năm 2015 đến năm 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue, et al. Các ancaloit có nguồn gốc từ thực vật: những chất điều chỉnh bệnh đầy hứa hẹn trong bệnh viêm ruột. Prepharmacology. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis ức chế stress oxy hóa đại tràng và phản ứng Th1/Th17 trong viêm đại tràng do DSS gây ra ở chuột. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Hiệu quả và độ an toàn của dược liệu Trung Quốc Sophora flavescens trong điều trị viêm loét đại tràng: bằng chứng lâm sàng và cơ chế tiềm năng. Prepharmacology. 2020;11:603476. doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF.Sản phẩm tự nhiên:thuốc có hiệu quả thử nghiệm trong điều trị bệnh viêm ruột. Dược phẩm hiện hành. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Suy ngẫm về điều trị bổ trợ viêm loét đại tràng bằng y học cổ truyền Trung Quốc. Tạp chí lâm sàng về dị ứng và miễn dịch. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Hiệu quả và độ an toàn của thuốc dạng hạt Banlangen trong điều trị cúm mùa: đề cương nghiên cứu cho thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng. trial.2015;16:126. doi: 10.1186/s13063-015-0645-x