Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Phiên bản trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt chế độ tương thích trong Internet Explorer). Trong thời gian chờ đợi, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi sẽ hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Không giống như động vật có xương sống, côn trùng được cho là thiếu hormone steroid giới tính thiên về con đực. Ở Anopheles gambiae, steroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) dường như đã tiến hóa để kiểm soát sự phát triển của trứng khi được tổng hợp bởi con cái2 và để gây ra giai đoạn không giao phối khi được truyền qua đường tình dục bởi con đực3. Vì sự phát triển của trứng và giao phối là những đặc điểm sinh sản thiết yếu, việc hiểu cách muỗi Anopheles cái tích hợp các tín hiệu hormone này có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc thiết kế các chương trình kiểm soát bệnh sốt rét mới. Ở đây, chúng tôi tiết lộ rằng các chức năng sinh sản này được điều chỉnh bởi các steroid giới tính khác nhau thông qua một mạng lưới phức tạp các enzyme kích hoạt/vô hiệu hóa ecdysteroid. Chúng tôi đã xác định một ecdysone bị oxy hóa đặc hiệu ở con đực, 3-dehydro-20E (3D20E), bảo vệ nguồn gốc cha mẹ bằng cách ngăn chặn khả năng tiếp nhận tình dục của con cái sau khi truyền qua đường tình dục và được kích hoạt bằng cách khử phosphoryl hóa. Đáng chú ý, việc truyền 3D20E cũng gây ra sự biểu hiện của các gen sinh sản duy trì sự phát triển của trứng trong quá trình nhiễm Plasmodium, đảm bảo sức khỏe của con cái bị nhiễm bệnh. 20E không gây ra phản ứng tình dục, nhưng cho phép các cá thể giao phối đẻ trứng sau khi các kinase ức chế 20E bị ức chế. Việc xác định hormone steroid đặc hiệu ở con đực của côn trùng này và vai trò của nó trong việc điều chỉnh khả năng tiếp nhận tình dục, khả năng sinh sản và tương tác với Plasmodium ở con cái cho thấy tiềm năng làm giảm khả năng sinh sản của muỗi truyền bệnh sốt rét.
Số ca mắc và tử vong do sốt rét đang gia tăng trở lại4 do tình trạng kháng thuốc trừ sâu lan rộng ở muỗi Anopheles, loài muỗi duy nhất truyền ký sinh trùng sốt rét ở người. Sinh học giao phối của loài muỗi này là một mục tiêu đặc biệt hấp dẫn cho các biện pháp can thiệp kiểm soát sốt rét mới vì muỗi cái chỉ giao phối một lần5; việc làm cho sự kiện giao phối duy nhất này trở nên vô sinh sẽ có tiềm năng rất lớn trong việc giảm quần thể muỗi ngoài tự nhiên.
Phụ nữ bị mất khả năng tình dục sau khi nhận hormone steroid nồng độ cao từ nam giới. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tác nhân gây khó khăn trong việc giao phối tiếp theo là 20-hydroxyecdysone (20E), một loại hormone steroid được biết đến nhiều hơn với vai trò điều hòa chu kỳ lột xác ở giai đoạn ấu trùng. Khả năng tổng hợp và truyền 20E của con đực đã tiến hóa đặc biệt ở các loài Anopheles thuộc phân chi Cellia7, phân bố ở châu Phi và bao gồm các vật chủ truyền bệnh sốt rét nguy hiểm nhất, trong đó có Anopheles gambiae. Điều này đặc biệt đáng chú ý vì ở những loài này, con cái cũng sản xuất 20E sau mỗi bữa ăn máu, và 20E thúc đẩy chu kỳ sinh trứng (xem tài liệu tham khảo 8). Tuy nhiên, người ta biết rất ít về cách con cái tích hợp các tín hiệu từ hai nguồn ecdysone khác nhau (truyền từ con đực và kích thích hút máu) mà không ảnh hưởng đến khả năng giao phối của chính chúng. Trên thực tế, nếu 20E do con cái sản xuất gây ra sự không dung nạp tình dục, điều này sẽ dẫn đến vô sinh ở những cá thể chưa từng giao phối, một hành vi rất phổ biến ở những loài muỗi này5.
Một lời giải thích khả thi là con đực A. gambiae truyền một loại ecdysone đặc hiệu cho con đực đã được biến đổi, kích hoạt một chuỗi tín hiệu trong đường sinh sản của con cái, dẫn đến sự không ổn định trong giao phối. Tuy nhiên, mặc dù động vật có xương sống có nhiều hormone steroid, chẳng hạn như estrogen và androgen (được xem xét trong tài liệu tham khảo 9), theo hiểu biết của chúng tôi, các steroid có thiên hướng androgen chưa được xác định ở côn trùng.
Chúng tôi tiến hành xác định thành phần hormone steroid trong tuyến phụ sinh dục đực (MAG) của cá mập A. gambiae trưởng thành về mặt sinh dục để tìm kiếm các steroid có khả năng điều chỉnh. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phổ khối lượng song song (HPLC-MS/MS) thay vì phương pháp kém đặc hiệu hơn đã được sử dụng trước đây, chúng tôi đã phát hiện ecdysone (E) và 20E trong mô này, xác nhận kết quả trước đó. Tuy nhiên, mẫu chủ yếu là các steroid bị oxy hóa và phosphoryl hóa, phù hợp với công thức 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Hình 1). Các dạng khác bao gồm 3-dehydro-20E (3D20E) và 20E-22-phosphate (20E22P). Cường độ tín hiệu HPLC-MS/MS của 3D20E22P cao hơn hai bậc độ lớn so với dạng khử phosphoryl hóa của nó, 3D20E, và cao hơn ba bậc độ lớn so với E và 20E (Hình 1). Mặc dù ở các bộ phận khác của cơ thể và đường sinh dục dưới (LRT; Hình dữ liệu mở rộng 1a). Chúng tôi cũng đã phân tích ecdysteroid ở con đực và con cái mới khép kín (<1 ngày tuổi) và chỉ phát hiện 3D20E và 3D20E22P trong MAG; E, 20E và 20E22P có mặt ở cả hai giới (Hình dữ liệu mở rộng 1b). Những dữ liệu này cho thấy con đực trưởng thành của A. gambiae sản sinh ra nồng độ cao các hormone điều hòa trong MAG của chúng mà con cái không tổng hợp được.
MAG và LRT cái (bao gồm tâm nhĩ, túi tinh và buồng trứng) được mổ tách từ chuột đực chưa giao phối 4 ngày tuổi và chuột cái chưa giao phối và đã giao phối (0,5, 3 và 12 hpm). Ecdysone trong các mô này được phân tích bằng HPLC-MS/MS (trung bình ± sai số chuẩn; kiểm định t không ghép cặp, hai phía, hiệu chỉnh tỷ lệ phát hiện sai (FDR); NS, không đáng kể; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 giờ so với 0,5 giờ, P = 0,035; 12 giờ so với 3 giờ, P = 0,0015; 12 giờ so với 0,5 giờ, P = 0,030. 3D20E22P: 3 giờ so với 0,5 giờ, P = 0,25; 12 giờ so với 3 giờ, P = 0,0032; 12 giờ so với 0,5 giờ, P = 0,015). Dữ liệu được lấy từ ba lần lặp lại sinh học. Diện tích đỉnh của mỗi ecdysone cần quan tâm được tính toán và chuẩn hóa theo số lượng muỗi. Ecdysone được biểu thị bằng màu sắc như sau: E, xanh lá cây; 20E, cam; 20E22P, tím; 3D20E, xanh lam; 3D20E22P, hồng. Hình nhỏ phóng to thang đo trên trục y để hiển thị mức ecdysone thấp hơn.
Để điều tra xem 3D20E22P và 3D20E có được truyền trong quá trình giao phối hay không, chúng tôi đã mổ xẻ đường sinh dục ngoài (LRT) của con cái ở các thời điểm khác nhau sau khi giao phối. Mặc dù không tìm thấy ecdysone ở con cái chưa giao phối, chúng tôi quan sát thấy một lượng đáng kể 3D20E22P trong LRT ngay sau khi giao phối (0,5 giờ sau giao phối, hpm), giảm dần theo thời gian, trong khi nồng độ 3D20E tăng lên đáng kể (Hình 1). Sử dụng 3D20E được tổng hợp hóa học làm chuẩn, chúng tôi xác định rằng nồng độ hormone steroid này trong LRT giao phối cao hơn ít nhất 100 lần so với 20E (Bảng dữ liệu mở rộng 1). Do đó, 3D20E22P là ecdysone chính của con đực được truyền sang LRT của con cái trong quá trình giao phối, và dạng khử phosphoryl hóa của nó, 3D20E, trở nên rất dồi dào ngay sau khi giao phối. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của ecdysone thứ hai trong sinh học sau giao phối của con cái.
Sau khi tạo ra bộ dữ liệu giải trình tự RNA (RNA-seq) mới (Hình 2a), sử dụng quy trình tin sinh học được xây dựng tùy chỉnh, chúng tôi đã tìm kiếm ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO) và gen phosphatase biến đổi 20E mã hóa ecdysone (EPP) được biểu hiện trong mô sinh sản. Chúng tôi đã xác định được một gen EPP ứng cử viên và hai gen EcK tiềm năng (EcK1 và EcK2), nhưng không thể tìm thấy gen EO ứng cử viên tốt. Đáng chú ý, các gen EPP riêng lẻ được biểu hiện ở mức cao (phân vị thứ 98,9) trong MAG của Gambia nhưng không phải trong LRT của con cái (Hình 2b), trái ngược với kỳ vọng của chúng tôi vì quá trình khử phosphoryl hóa 3D20E22P đã xảy ra trong mô của con cái này. Do đó, chúng tôi tin rằng EPP của con đực có thể được truyền trong quá trình giao phối. Thực tế, chúng tôi đã sử dụng phương pháp dán nhãn đồng vị ổn định in vivo để che giấu protein của con cái sau khi giao phối, một enzyme được xác định bằng MS trong tâm nhĩ của con cái (Hình 2c và 2b). (Bảng bổ sung 1). Sự hiện diện của EPP trong MAG và LRT cái đã giao phối (nhưng không phải LRT cái chưa giao phối) cũng được xác nhận bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu (Hình 2d).
a, Một quy trình tin sinh học được xây dựng tùy chỉnh để tìm kiếm các mô sinh sản của mỗi giới tính nhằm phát hiện các gen mã hóa EcK, EO và EPP. Các số bên cạnh mũi tên cho biết số lượng ứng viên đực và cái ở mỗi bước. Phân tích này đã xác định được một gen EPP (EPP) và một gen EcK (EcK1) được biểu hiện ở con đực, và một gen EcK (EcK2) được biểu hiện ở cả hai giới nhưng không cho ra gen EO ứng viên. b, Bản đồ nhiệt so sánh biểu hiện gen ứng viên trong mô của muỗi Anopheles gambiae và Anopheles albicans chưa giao phối (V) và đang giao phối (M). Spca, thụ tinh; MAGs, tuyến phụ ở con đực; các bộ phận khác của cơ thể, bao gồm vú, cánh, chân, mô mỡ và các cơ quan nội tạng ở cả hai giới, và buồng trứng ở con cái. EcK2 được biểu hiện mạnh ở cả MAG và tâm nhĩ của Gambia, trong khi EPP chỉ được tìm thấy ở MAG. c, Phân tích proteomic về sự dịch chuyển nhóm tinh dịch của con đực vào tâm nhĩ của con cái ở 3, 12 và 24 hpm, cho thấy 67 protein phong phú nhất. Con cái được nuôi bằng chế độ ăn có chứa 15N để đánh dấu (và che giấu) tất cả các protein. Con đực không được gắn thẻ được giao phối với con cái được gắn thẻ, và LRT của con cái được mổ xẻ ở 3, 12 và 24 hpm để phân tích proteomic (xem Bảng bổ sung 1 để biết danh sách đầy đủ các protein xuất tinh). Hình nhỏ, EPP, Eck1 và EcK2 được phát hiện trong MAG của con đực chưa giao phối bằng phân tích proteomic của các mô này. d, EPP được phát hiện bằng western blot trong MAG và LRT của con cái đã giao phối, nhưng không có ở con cái hoặc con đực chưa giao phối hoặc phần còn lại của cơ thể cái. Màng được đồng thời kiểm tra bằng kháng thể chống actin (kiểm soát tải) và kháng thể chống EPP. Tất cả con đực đều chưa giao phối. Xem Hình bổ sung 1 để biết dữ liệu nguồn gel. Western blot được thực hiện hai lần với kết quả tương tự.
Hoạt tính phosphophosphatase ecdysteroid của EPP đã được xác minh sau khi ủ bằng HPLC-MS/MS với 3D20E22P được phân lập từ MAG (Hình dữ liệu mở rộng 2a). Hơn nữa, khi chúng tôi làm im lặng EPP bằng phương pháp can thiệp RNA (RNAi), chúng tôi đã phát hiện thấy sự giảm mạnh hoạt tính phosphatase trong mô sinh sản của những con đực này (Hình 3a), và những con cái giao phối với những con đực bị làm im lặng EPP cho thấy tỷ lệ 3D20E bị khử phosphate thấp hơn đáng kể (Hình 3b) mặc dù gen bị làm im lặng một phần (Hình dữ liệu mở rộng 2b,c). Ngược lại, chúng tôi không phát hiện thấy những thay đổi đáng kể trong tỷ lệ 20E22P/20E ở cùng những con muỗi này, điều này có thể cho thấy enzyme này đặc hiệu với 3D20E22P (Hình 3b).
a, Hoạt động phosphatase giảm trong MAG do ức chế EPP bằng cách sử dụng RNA EPP mạch đôi (dsEPP) hoặc RNA GFP mạch đôi (dsGFP) làm đối chứng. Hai mươi nhóm MAG được sử dụng trong mỗi lần lặp lại (P = 0,0046, kiểm định t-test cặp đôi, hai phía), được biểu thị bằng các chấm riêng biệt. b, Con cái giao phối với con đực bị ức chế EPP có tỷ lệ 3D20E bị khử phosphoryl thấp hơn đáng kể ở 3 hpm (P = 0,0043, kiểm định t-test không cặp đôi, hai phía), trong khi mức độ 20E không bị ảnh hưởng (P = 0,063, không cặp đôi). (kiểm định t, hai phía). Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn từ ba nhóm gồm 13, 16 và 19 con cái mỗi nhóm. c, Những con cái giao phối với con đực bị ức chế EPP có tỷ lệ giao phối lại cao hơn đáng kể (P = 0,0002, kiểm định chính xác Fisher, hai phía). Trước tiên, các con cái bị ép giao phối để đảm bảo tình trạng giao phối của chúng; Hai ngày sau, chúng được liên hệ với những con đực khác mang tinh trùng biến đổi gen để đánh giá tỷ lệ giao phối lại bằng phương pháp phát hiện gen biến đổi bằng PCR định lượng.d, Muỗi cái đã hút máu và giao phối với muỗi đực bị ức chế gen EPP có khả năng sinh sản giảm đáng kể (P < 0.0001; kiểm định Mann-Whitney, hai phía) và số lượng trứng giảm nhẹ (P = 0.088, kiểm định Mann-Whitney, hai phía), trong khi tỷ lệ đẻ trứng không bị ảnh hưởng (P = 0.94, kiểm định chính xác Fisher, hai phía). Trong tất cả các bảng, n biểu thị số lượng mẫu muỗi độc lập về mặt sinh học. NS, không có ý nghĩa thống kê. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Tiếp theo, chúng tôi đánh giá xem quá trình khử phosphoryl hóa ecdysone có quan trọng trong việc gây ra hiện tượng kháng giao phối ở con cái hay không. Đáng chú ý, những con cái giao phối với con đực thiếu EPP đã giao phối lại với tần suất cao hơn nhiều (44,9%) so với con cái đối chứng (10,4%) khi tiếp xúc với thêm con đực (biến đổi gen) (Hình 3c). Chúng tôi cũng quan sát thấy sự giảm đáng kể về khả năng sinh sản (Hình 3d, bên trái) và sự giảm nhẹ về số lượng trứng do những con cái này đẻ ra (Hình 3d, giữa), trong khi tỷ lệ trứng do con cái đẻ ra (một phản ứng khác được tạo ra ở con cái khi giao phối) không bị ảnh hưởng (Hình 3d, bên phải). Với tính đặc hiệu của EPP đối với 3D20E22P đã được quan sát, những kết quả này cho thấy rằng việc kích hoạt 3D20E bởi EPP được truyền trong quá trình giao phối có thể đóng vai trò quan trọng trong việc tắt khả năng tiếp nhận giao phối tiếp theo của con cái, một hành vi trước đây được cho là do sự truyền 20E qua đường tình dục. Do đó, hormone đặc hiệu ở con đực này cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến khả năng sinh sản của con cái.
Tiếp theo, chúng tôi so sánh hoạt động của 20E và 3D20E trong các thí nghiệm tiêm vào những con cái trinh tiết đã trưởng thành về mặt sinh dục bằng cách sử dụng 3D20E được tổng hợp hóa học (Hình 4a–c) và 20E có sẵn trên thị trường. Chúng tôi nhận thấy rằng 3D20E hiệu quả hơn đáng kể so với 20E trong việc làm giảm độ nhạy cảm của con cái đối với việc giao phối ở cả hai nồng độ (Hình 4d). Đáng chú ý, một nửa nồng độ sinh lý của 3D20E trong LRT (1.066 pg sau khi tiêm so với 2.022 pg sau khi giao phối) đã tạo ra tỷ lệ con cái kháng giao phối cao gấp 20 lần so với nồng độ sinh lý của 20E (361 pg sau khi tiêm) 24 giờ sau khi tiêm ở nồng độ cao nhất là 18 pg sau khi giao phối; (Bảng dữ liệu mở rộng 1). Kết quả này phù hợp với quan điểm cho rằng sự truyền gen 20E qua đường tình dục không gây ra giai đoạn trơ giao phối, và càng chỉ ra rằng 3D20E là yếu tố chính đảm bảo mối quan hệ cha mẹ - con cái. 3D20E cũng hoạt động mạnh hơn đáng kể so với 20E trong các thí nghiệm đẻ trứng ở con cái chưa giao phối (Hình 4e), cho thấy tỷ lệ đẻ trứng bình thường mà chúng tôi quan sát được sau khi ức chế một phần EPP là do sự hiện diện của hoạt động 3D20E còn sót lại vẫn được tạo ra bởi các yếu tố ở con cái do giao phối gây ra.
(a,b) 3D20E được tổng hợp hóa học từ 20E (a) với hiệu suất/chuyển đổi rất cao (dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn từ ba phản ứng tổng hợp độc lập) (b).c, Phổ khối lượng (nửa dưới) hoàn toàn khớp với ecdysone được tìm thấy trong LRT của con cái đã giao phối (nửa trên).d, So với 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; kiểm định chính xác Fisher, hai phía) và ethanol 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; kiểm định chính xác Fisher, hai phía), trong khi 20E chỉ cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng ở liều cao hơn (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; kiểm định chính xác Fisher). (kiểm định, 2 phía).e, tiêm 3D20E gây ra tỷ lệ sinh sản cao hơn đáng kể ở muỗi cái chưa giao phối so với nhóm đối chứng dùng ethanol 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; kiểm định chính xác Fisher, hai phía), trong khi 20E so với nhóm đối chứng chỉ ở liều cao hơn (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; kiểm định chính xác Fisher, hai phía). 3D20E gây ra tỷ lệ sinh sản cao hơn đáng kể so với 20E ở liều cao hơn (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; kiểm định chính xác Fisher, hai phía). Trong tất cả các bảng, n đại diện cho số lượng mẫu muỗi độc lập về mặt sinh học. NS, không có ý nghĩa thống kê. *P < 0,05, **P < 0,05 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Dữ liệu được lấy từ ba lần lặp lại.
Trong các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã xác định rằng sự truyền hormone steroid qua đường tình dục gây ra sự biểu hiện của MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), một gen sinh sản ở con cái bảo vệ muỗi cái A. gambiae khỏi nhiễm trùng P. falciparum 13, ký sinh trùng sốt rét nguy hiểm nhất ở người. Do tầm quan trọng của MISO đối với khả năng sinh sản của muỗi Anopheles ở các vùng lưu hành bệnh sốt rét, chúng tôi quyết định xác định hormone nào, 3D20E hay 20E, kích hoạt sự biểu hiện của gen này. Chúng tôi nhận thấy rằng trong khi tiêm 20E đặc hiệu hoặc mạnh hơn gây ra sự biểu hiện của một số thụ thể hormone hạt nhân (HR), chẳng hạn như HR3 và HR4, và các mục tiêu steroid điển hình ở hạ nguồn, chẳng hạn như các gen tạo noãn hoàng Vg14, 15, 16, thì MISO lại được kích thích mạnh hơn bởi 3D20E (Hình dữ liệu mở rộng 3). Do đó, sự truyền hormone steroid androgenic này qua đường tình dục dường như gây ra các cơ chế bảo vệ con cái khỏi những tổn thất do nhiễm ký sinh trùng gây ra. Hơn nữa, 3D20E Nó tác động khác nhau đến cả hai dạng đồng phân của thụ thể EcR, gây cảm ứng EcR-A và ức chế EcR-B, đồng thời kích hoạt mạnh hơn các gen gây giao phối khác, bao gồm HPX15, ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của con cái. Điều này có thể giải thích tình trạng vô sinh đáng kể được quan sát thấy ở những con cái giao phối với con đực bị ức chế EPP (Hình dữ liệu mở rộng 3). Những dữ liệu này cho thấy sự tồn tại của các con đường hạ nguồn được kích hoạt ưu tiên bởi hai hormone ecdysone có thể là cơ sở cho chức năng đặc thù theo giới tính.
Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra chức năng của hai gen EcK được xác định trong quy trình tin sinh học của chúng tôi. Việc ức chế EcK1 hoặc EcK2 dẫn đến tỷ lệ tử vong đáng kể ở con đực (Hình dữ liệu mở rộng 4a), cho thấy rằng quá trình phosphoryl hóa ecdysone, và do đó là sự bất hoạt, rất quan trọng đối với sự sống còn. Vì EcK2 được biểu hiện ở mức độ cao hơn EcK1 và được phát hiện trong MAG bằng phương pháp proteomics (Hình 2b,c và Bảng bổ sung 2), chúng tôi đã xác nhận hoạt tính kinase ecdysteroid của nó bằng cách ủ nó với 20E, dẫn đến quá trình phosphoryl hóa 20E22P (Hình dữ liệu mở rộng 2). 4b). Khi sử dụng 3D20E làm chất nền, chúng tôi không thể phát hiện sản phẩm phosphoryl hóa 3D20E22P (Hình dữ liệu mở rộng 4c), cho thấy rằng 20E chứ không phải 3D20E có thể là mục tiêu ưu tiên của EcK2.
Theo phân tích RNA-seq của chúng tôi, EcK2 cũng được biểu hiện cao trong LRT của những con cái chưa giao phối, nơi nó bị tắt sau khi giao phối (Hình 2b). Chúng tôi đã xác nhận dữ liệu này và xác định rằng biểu hiện của EcK2 không bị ảnh hưởng bởi việc hút máu (Hình dữ liệu bổ sung 5a). Mở rộng các thí nghiệm MS ban đầu của chúng tôi, chúng tôi xác định rằng đỉnh của 20E22P có liên quan chặt chẽ đến đỉnh của 20E (22-26 giờ sau khi hút máu; Hình dữ liệu bổ sung 5b). Việc ức chế EcK2 ở những con cái chưa giao phối dẫn đến sự gia tăng gấp 3 lần tỷ lệ tương đối của 20E so với 20E22P ở 26 giờ sau khi hút máu (Hình dữ liệu bổ sung 2c và 5c), xác nhận rằng EcK2 cũng phosphoryl hóa 20E ở con cái. Đáng chú ý, những con cái chưa giao phối bị thiếu EcK2 vẫn duy trì khả năng tiếp nhận tình dục đầy đủ (Hình dữ liệu bổ sung 5d,e), điều này càng cho thấy rằng việc sản xuất 20E ở con cái không gây ra giao phối. thời kỳ trơ. Tuy nhiên, những con cái này có tỷ lệ đẻ trứng tăng đáng kể so với nhóm đối chứng, với hơn 30% số cá thể chưa giao phối đẻ trứng (Hình dữ liệu mở rộng 5f). Nếu tiêm RNA Eck2 chuỗi kép (dsEcK2) được thực hiện sau khi hút máu, quá trình sinh sản không xảy ra, tại thời điểm đó đỉnh 20E do hút máu đã giảm. Nhìn chung, những kết quả này ủng hộ mô hình cho rằng 20E được tạo ra sau khi hút máu có thể gây ra sinh sản, nhưng chỉ khi cơ chế ngăn chặn sinh sản (EcK2 và có thể các yếu tố khác) bị tắt bởi quá trình giao phối. Cả tiêm 20E và 3D20E đều không ức chế biểu hiện EcK2 ở cá thể chưa giao phối (Hình dữ liệu mở rộng 5g), cho thấy các yếu tố khác đóng vai trò trung gian trong việc ức chế kinase này. Tuy nhiên, nồng độ 20E sau khi hút máu không đủ để gây khó chịu khi giao phối, nhưng đã được kích hoạt hiệu quả bởi nồng độ cao của 3D20E được truyền qua đường tình dục.
Kết quả của chúng tôi cung cấp những hiểu biết quan trọng về cơ chế điều chỉnh sự thành công sinh sản của A. gambiae. Một mô hình đã xuất hiện, trong đó con đực đã tiến hóa để tổng hợp nồng độ cao 3D20E, một ecdysone biến đổi đặc hiệu ở con đực, đảm bảo quan hệ huyết thống bằng cách làm giảm độ nhạy cảm của con cái đối với việc giao phối tiếp theo. Đồng thời, những vật chủ truyền bệnh sốt rét này cũng đã tiến hóa một hệ thống hiệu quả để kích hoạt 3D20E ở con cái để đáp ứng với sự chuyển giao tình dục của EPP đặc hiệu ở con đực. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là ví dụ đầu tiên về một hệ thống hormone steroid do con đực và con cái chi phối thực hiện một chức năng độc đáo và quan trọng ở côn trùng. Chức năng của ecdysone đặc hiệu ở con đực đã được giả thuyết nhưng chưa được chứng minh một cách chắc chắn. Ví dụ, một giả thuyết phần lớn bị bác bỏ 18 là các chức năng này có thể được thực hiện bởi tiền chất 20E là E1. Người ta biết rằng ở Drosophila, chế độ đơn phối được kích hoạt bởi sự chuyển giao tình dục của các peptide giới tính nhỏ 19,20 tương tác với các tế bào thần kinh chi phối đường sinh sản của con cái thông qua các thụ thể peptide giới tính đặc hiệu 21,22. Cần có thêm nghiên cứu để xác định Nghiên cứu này nhằm xác định các chuỗi tín hiệu truyền dẫn hạ nguồn được điều khiển bởi 3D20E ở muỗi cái A. gambiae và xem liệu các chuỗi tín hiệu này có được bảo tồn giữa muỗi và ruồi giấm Drosophila hay không.
Với vai trò quan trọng của 3D20E đối với khả năng sinh sản và hành vi của muỗi cái được xác định trong nghiên cứu của chúng tôi, các con đường dẫn đến tổng hợp và hoạt hóa 3D20E mở ra những cơ hội mới cho các chiến lược kiểm soát muỗi trong tương lai, chẳng hạn như tạo ra những con đực vô sinh cạnh tranh trong các chiến lược công nghệ côn trùng vô sinh để thả vào tự nhiên hoặc để bắt chước 3D20E trong hoạt động giao phối của muỗi cái chưa giao phối. Chức năng đặc hiệu ở con đực của 3D20E có thể đã tiến hóa khi A. gambiae và các loài Cellia khác có được khả năng làm đông tinh dịch thành nút giao phối, vì điều này cho phép chuyển giao hiệu quả một lượng lớn hormone và enzyme hoạt hóa hormone. Ngược lại, sự tiến hóa của 3D20E thực hiện chế độ một chồng cung cấp một cơ chế cho con cái (thông qua biểu hiện cao của MISO) để ưu tiên khả năng sinh sản của chúng ở những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh sốt rét cao, điều này gián tiếp góp phần vào sự lây truyền Plasmodium. Vì 20E ở con cái đã được chứng minh là có ảnh hưởng sâu sắc đến sự sống sót và phát triển của P. falciparum trong muỗi Anopheles cái,24 cả con đường hormone steroid ở con đực và con cái hiện là những khía cạnh quan trọng của tương tác giữa muỗi và ký sinh trùng.
Các chủng A. gambiae G3 được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn dành cho côn trùng (26-28 °C, độ ẩm tương đối 65-80%, chu kỳ chiếu sáng/tối 12:12 giờ). Ấu trùng được cho ăn thức ăn dạng bột dành cho cá (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets và Tetra Pond Sticks theo tỷ lệ 7:7:2). Muỗi trưởng thành được cho ăn dung dịch dextrose 10% không giới hạn và máu người hàng tuần (các thành phần máu nghiên cứu). Muỗi cái chưa giao phối được thu nhận bằng cách phân tách giới tính ở giai đoạn nhộng sau khi kiểm tra phần cuối bằng kính hiển vi. Muỗi đực mang gen chuyển DsRed đã được mô tả trước đây.
Các thí nghiệm giao phối cưỡng bức được thực hiện theo các quy trình đã mô tả trước đó. Đối với giao phối tự nhiên, các con cái trinh nguyên 4 ngày tuổi được nuôi chung với các con đực trinh nguyên đã trưởng thành về mặt sinh dục theo tỷ lệ 1:3 trong hai đêm. Đối với các thí nghiệm trong đó con đực được tiêm dsEPP, việc nhốt chung lồng trùng với ngày thứ 3-4 sau khi tiêm, khi hoạt động phosphatase bị ức chế tối đa (Hình dữ liệu mở rộng 2b).
Mô muỗi, phần còn lại của cơ thể (phần xác còn lại), hoặc toàn bộ cơ thể được mổ xẻ trong methanol 100% và đồng nhất hóa bằng máy nghiền hạt (hạt thủy tinh 2 mm, 2400 vòng/phút, 90 giây). Lượng mô và thể tích methanol như sau: phần còn lại của cơ thể, 50 trong 1000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT cái, 25–50 80 µl. Kết tủa được tiến hành chiết xuất methanol lần thứ hai với cùng thể tích methanol. Cặn tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm. Methanol từ cả hai lần chiết xuất được kết hợp và làm khô dưới dòng khí nitơ, sau đó được hòa tan lại trong các thể tích methanol 80% trong nước như sau: phần còn lại của cơ thể, 50 µl; MAG và LRT cái, 30 µl.
Các mẫu được phân tích trên máy quang phổ khối (ID-X, Thermo Fisher) kết hợp với thiết bị sắc ký lỏng (LC) (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl mẫu được tiêm vào cột 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) được duy trì ở 25 °C. Pha động cho LC là A (nước, 0,1% axit formic) và B (acetonitrile, 0,1% axit formic). Gradient LC như sau: 5% B trong 1 phút, sau đó tăng lên 100% B trong 11 phút. Sau 8 phút ở 100%, cân bằng lại cột ở 5% B trong 4 phút. Tốc độ dòng chảy là 0,3 ml min-1. Quá trình ion hóa trong nguồn MS được thực hiện bằng phương pháp ion hóa phun điện tử gia nhiệt ở chế độ dương và âm.
Máy đo phổ khối lượng đo dữ liệu trong dải m/z từ 350 đến 680 ở độ phân giải 60.000 ở chế độ MS đầy đủ. Dữ liệu MS/MS được thu thập trên [M + H]+ (tất cả các mục tiêu), [M - H2O + H]+ (tất cả các mục tiêu) và [M - H]- (các mục tiêu được phosphoryl hóa). Dữ liệu MS/MS được sử dụng để xác nhận các đặc tính ecdysone của các mục tiêu mà không có chất chuẩn. Để xác định các ecdysteroid không phải mục tiêu, dữ liệu MS/MS cho tất cả các đỉnh HPLC có độ phong phú tương đối >15% đã được phân tích. Định lượng bằng cách sử dụng đường cong chuẩn được tạo từ các chất chuẩn tinh khiết (20E, 3D20E) để tính toán lượng tuyệt đối hoặc độ pha loãng của một mẫu cụ thể (tất cả các mục tiêu khác) để tính toán sự tương đương của chúng với lượng được tìm thấy ở một nam giới. Đối với 3D20E, định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng tổng của các chất cộng hợp sau: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + [Cl]-, [M + NO3]-.Dữ liệu được trích xuất và định lượng bằng Tracefinder (phiên bản 4.1).Dữ liệu MS/MS được phân tích bằng Xcalibur (phiên bản 4.4).Phổ MS của E, 20E và 3D20E được so sánh với các tiêu chuẩn tương ứng.3D20E22P được phân tích bằng cách dẫn xuất hóa với thuốc thử Girard.20E22P được phân tích bằng tỷ lệ m/z.
3D20E22P được tinh chế từ MAG. Quá trình tinh chế được thực hiện trên quy mô phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cực cao (Acquity, Waters) với đầu dò khối phổ tứ cực (QDa, Acquity, Waters) dưới cùng điều kiện sắc ký lỏng như phân tích HPLC-MS/MS. Việc thu thập phân đoạn được kích hoạt khi m/z tương ứng với 3D20E22P được phát hiện ở cùng thời gian lưu giữ như đã xác định trước đó. Độ tinh khiết của các hợp chất được chiết xuất sau đó được kiểm tra bằng HPLC-MS/MS như đã mô tả ở trên.
Tổng RNA được chiết xuất từ 10-12 mô sinh sản hoặc các bộ phận khác của cơ thể (không đầu) bằng thuốc thử TRI (Thermo Fisher) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được xử lý bằng TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng enzyme phiên mã ngược virus gây bệnh bạch cầu ở chuột Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mồi cho PCR định lượng phiên mã ngược (RT-qPCR; Bảng dữ liệu mở rộng 2) đã được công bố trước đó24 hoặc được thiết kế bằng Primer-BLAST26, ưu tiên các sản phẩm có kích thước 70-150 bp và trải dài qua các điểm nối exon-exon hoặc các cặp mồi tách biệt các exon. Các mẫu cDNA từ ba đến bốn bản sao sinh học được pha loãng gấp bốn lần trong nước để thực hiện RT-qPCR. Định lượng được thực hiện trong các phản ứng lặp lại 15 µl chứa 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), mồi và 5 µl cDNA đã pha loãng. Các phản ứng được chạy trên QuantStudio 6 Pro. Hệ thống PCR thời gian thực (Thermo Fisher) và dữ liệu được thu thập và phân tích bằng phần mềm Design and Analysis (phiên bản 2.4.3). Như đã được chứng minh trong nghiên cứu này, lượng tương đối được chuẩn hóa theo gen ribosome RpL19 (AGAP004422), có biểu hiện không thay đổi đáng kể khi cho ăn máu 27 hoặc giao phối 3.
Chất lượng RNA được kiểm tra bằng máy phân tích sinh học Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent). Các thư viện Illumina ghép cặp được chuẩn bị và chạy tại Viện Broad của MIT và Harvard. Các trình tự đọc được căn chỉnh với bộ gen A. gambiae (chủng PEST, phiên bản 4.12) bằng HISAT2 (phiên bản 2.0.5) với các tham số mặc định. Các trình tự đọc có điểm chất lượng ánh xạ (MAPQ) <30 đã bị loại bỏ bằng Samtools (phiên bản 1.3.1). Số lượng trình tự đọc được ánh xạ tới các gen được đếm bằng htseq-count (phiên bản 0.9.1) với các tham số mặc định. Số lượng trình tự đọc được chuẩn hóa được tính toán và biểu hiện gen khác biệt được phân tích bằng gói DESeq2 (phiên bản 1.28.1) trong R (phiên bản 4.0.3).
Các ứng viên gen điều chỉnh ecdysone được xác định bằng cách đầu tiên tìm kiếm trong bộ gen của A. gambiae bằng thuật toán PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), sử dụng các giá trị mặc định của Tham số với các chuỗi protein truy vấn sau: từ Bombyx mori (Số hiệu truy cập NP_001038956.1), Musca domestica (Số hiệu truy cập XP_005182020.1, XP_005175332.1 và XP_011294434.1) và Microplitis demolitor (Số hiệu truy cập XP_008552646.1 và XP_008552645.1); EcK từ B. mori (Số hiệu truy cập NP_001036900), Drosophila melanogaster (Số hiệu truy cập NP_651202), Apis mellifera (Số hiệu truy cập XP_394838) và Acyrthosiphon pisum (Số hiệu truy cập XP_001947166); và EPP từ B. mori (Số hiệu truy cập XP_001947166) NP_001177919.1 và NP_001243996.1) và EO của D. melanogaster (Số hiệu truy cập NP_572986.1) (bước 1). Tiếp theo, lọc các kết quả dựa trên biểu hiện mRNA cao (>100 đoạn/kilobase exon trên một triệu lượt đọc được ánh xạ (FPKM) hoặc >85%) trong mô sinh sản (LRT hoặc MAG của con cái) ở Gambia (bước 2). Để cải thiện tính đặc hiệu, chúng tôi đã chọn các enzyme ứng cử viên cũng được biểu hiện trong mô sinh sản của A. albimanus, một loài muỗi Anopheles không tổng hợp hoặc chuyển ecdysone trong quá trình giao phối. Các gen ứng cử viên được lọc dựa trên biểu hiện thấp (<100 FPKM hoặc
Những con cái trinh nguyên được gắn thẻ 15N, 4-6 ngày tuổi, được ép giao phối với những con đực trinh nguyên không được gắn thẻ cùng tuổi. Việc giao phối thành công được xác minh bằng cách phát hiện nút giao phối dưới kính hiển vi huỳnh quang. Ở các thời điểm 3, 12 và 24 giờ sau khi giao phối, tâm nhĩ của 45-55 con cái đã giao phối được mổ tách thành 50 µl dung dịch đệm amoni bicacbonat (pH 7,8) và nghiền nhuyễn bằng chày. Hỗn dịch được ly tâm và dịch nổi được trộn với 50 µl dung dịch RapiGest 0,1% (186001860, Waters) trong dung dịch amoni bicacbonat 50 mM. Dịch nổi và cặn từ mỗi mẫu được đông lạnh nhanh trên đá khô và vận chuyển qua đêm đến phòng thí nghiệm MacCoss tại Đại học Washington, nơi hoàn tất quá trình chuẩn bị mẫu cho LC-MS/MS. Hòa tan lại cặn trong 50 µl dung dịch 0,1% RapiGest được hòa tan trong dung dịch amoni bicacbonat 50 mM và siêu âm trong bể nước. Nồng độ protein của phần cặn và dịch nổi được đo bằng phương pháp BCA. Các mẫu được khử bằng dithiothreitol (DTT; Sigma) 5 mM, alkyl hóa bằng iodoacetamide 15 mM (Sigma) và ủ ở 37 °C (tỷ lệ trypsin hóa: chất nền là 1:50) trong 1 giờ. RapiGest được phân giải bằng cách thêm HCl 200 mM, sau đó ủ ở 37 °C trong 45 phút và ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 °C để loại bỏ cặn. Các mẫu được rửa bằng phương pháp chiết pha rắn hai chế độ (hộp Oasis MCX, Waters) và huyền phù lại trong axit formic 0,1% để đạt nồng độ protein cuối cùng là 0,33 µg µl-1. MAG không được đánh dấu Tương tự, proteome cũng được phân tích từ những con đực chưa giao phối. Mỗi mẫu được phân tích hai lần. Tiếp theo, 1 µg mỗi mẫu được phân tích bằng cột silica nung chảy 25 cm, kích thước hạt 75 μm, có bẫy lọc silica nung chảy Kasil1 (PQ) 4 cm chứa nhựa pha đảo Jupiter C12 (Phenomenex) và sắc ký lỏng trong 180 phút. Phân tích mẫu – MS/MS được thực hiện trên máy quang phổ khối Q-Exactive HF (Thermo Fisher) với hệ thống nanoACQUITY UPLC (Waters). Dữ liệu thu thập liên quan được tạo ra cho mỗi lần chạy được chuyển đổi sang định dạng mzML bằng Proteowizard (phiên bản 3.0.20287) và sử dụng Comet31 (phiên bản 3.2) so với cơ sở dữ liệu FASTA chứa trình tự protein từ Anopheles gambiae (VectorBase phiên bản 54), Anopheles coluzzi. Một tìm kiếm đã được thực hiện trên Mali-NIH (VectorBase phiên bản 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, tháng 3 năm 2021), A. gambiae RNA-seq và bản dịch ba khung của các chất gây ô nhiễm ở người đã biết. FDR khớp với bản đồ peptide được xác định bằng Percolator32 (phiên bản 3.05) với ngưỡng 0,01, và các peptide được tập hợp thành các định danh protein bằng cách sử dụng tính tiết kiệm protein trong Limelight33 (phiên bản 3.0.20287). 2.2.0). Độ phong phú tương đối của protein được ước tính bằng cách sử dụng hệ số phong phú phổ chuẩn hóa (NSAF) được tính cho mỗi protein trong mỗi lần chạy như đã mô tả trước đây. NSAF tương đối so với mỗi protein được tính trung bình trên các mẫu từ hai bản sao sinh học khác nhau. Việc dán nhãn 15N đã che giấu thành công hệ protein của con cái, mặc dù một lượng nhỏ protein không được dán nhãn vẫn có thể được phát hiện từ những cá thể chưa giao phối được dán nhãn. Chúng tôi chỉ ghi nhận sự phát hiện giảm protein của con đực (1-5 phổ) trong các mẫu thô của con cái trong các lần chạy kỹ thuật, trong đó các mẫu thô được chạy sau các mẫu của con đực/giao phối, do hiện tượng "mang theo" HPLC. Các protein thỉnh thoảng được tìm thấy là 'chất gây ô nhiễm' từ những cá thể chưa giao phối được dán nhãn được liệt kê trong Bảng bổ sung 1.
Hai peptide kháng nguyên, QTTDRVAPAPDQQQ (trong isotype PA) và MESDGTTPSGDSEQ (trong isotype PA và PB) trong Genscript. Hai peptide này được kết hợp, sau đó liên hợp với protein mang KLH và tiêm vào thỏ New Zealand. Thỏ được giết mổ sau lần tiêm thứ tư, và tổng IgG được phân lập bằng phương pháp tinh chế ái lực. IgG từ con thỏ đặc hiệu EPP nhất được sử dụng cho phân tích Western blotting tiếp theo.
Đối với Western blot, MAG (n = 10, trong đó n đại diện cho số lượng mẫu muỗi độc lập về mặt sinh học) và LRT cái (n = 30) từ muỗi đực trinh nguyên 4 ngày tuổi và muỗi cái trinh nguyên hoặc bị ép giao phối (<10 ngày sau giao phối), dung dịch đệm chiết xuất protein (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0,25% natri deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× hỗn hợp chất ức chế protease (Roche)) được thêm vào riêng biệt. Các mẫu được đồng nhất hóa ngay sau khi mổ bằng máy nghiền hạt (hạt thủy tinh 2 mm, 2400 vòng/phút, 90 giây). Các mảnh vụn không tan được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 20000 g ở 4 °C. Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford (Bio-Rad). Sau đó, 20 µg protein MAG, 40 µg protein LRT và 20 µg protein còn lại được thêm vào. Các protein được biến tính và tách bằng điện di gel polyacrylamide 10% Bis-Tris NuPAGE sử dụng dung dịch đệm MOPS. Protein được chuyển lên màng polyvinylidene fluoride bằng hệ thống chuyển iBlot2 (Thermo Fisher). Màng được rửa hai lần trong dung dịch PBS-T 1× (0,1% Tween-20 trong PBS) và sau đó được ủ trong dung dịch đệm chặn Odyssey (Li-Cor) trong 1 giờ ở 22°C. Màng được lắc qua đêm ở 4°C với kháng thể chính đa dòng thỏ kháng EPP tùy chỉnh (tỷ lệ 1:700 trong dung dịch đệm chặn) và kháng thể chính đơn dòng chuột kháng actin MAC237 (Abeam; tỷ lệ 1:4000). Màng được rửa bằng PBS-T và sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp (kháng thể lừa kháng thỏ 800CW và kháng thể dê kháng chuột 680LT (Li-Cor), cả hai đều ở tỷ lệ 1:20000) trong dung dịch đệm chặn chứa 0,01% SDS và 0,2% Tween. Ủ ở -20°C trong 1 giờ ở 22°C. Màng được rửa bằng PBS-T và chụp ảnh bằng máy quét Odyssey CLx. Hình ảnh được thu thập và xử lý trong Image Studio (phiên bản 5.2). Không phát hiện thấy dải đặc hiệu tương ứng với dạng EPP-RA (82 kDa).
Các vùng mã hóa của EPP (dưới dạng đồng phân AGAP002463-RB chứa miền histidine phosphatase, tìm kiếm miền bảo tồn NCBI 34) và EcK2 (AGAP002181) đã được nhân bản vào plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Các đoạn mồi được liệt kê trong Bảng Dữ liệu Mở rộng 2. Tám đoạn nối GS4 (nối tiếp nhau) được chèn trước thẻ 6xHis ở đầu C của cấu trúc pET-21a(+)-EcK2. Các protein tái tổ hợp được sản xuất bằng phản ứng tổng hợp protein E. coli không tế bào NEBExpress (New England BioLabs). Các protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột ly tâm Ni NEBExpress (New England BioLabs). Protein kiểm soát dihydrofolate reductase (DHFR) được sản xuất bằng khuôn DNA từ Bộ dụng cụ tổng hợp protein E. coli không tế bào NEBExpress. Các protein được bảo quản trong dung dịch glycerol 50% trong PBS ở -20 °C trong tối đa 3 tháng.
Hoạt tính phosphatase của EPP và dịch chiết mô được đo bằng 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Dung dịch đệm phản ứng chứa 25 mM Tris, 50 mM axit axetic, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA và 1 mM DTT. Mô được đồng nhất hóa trong dung dịch đệm phản ứng và các mảnh vụn tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm. Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm enzyme hoặc dịch chiết mô vào dung dịch đệm phản ứng chứa 2,5 mg ml-1 pNPP. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, và lượng pNP chuyển hóa từ pNPP được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm tại các thời điểm khác nhau.
Để xác định hoạt tính EcK trong ống nghiệm, protein được ủ với 0,2 mg 20E hoặc 3D20E trong 200 µl dung dịch đệm (pH 7,5) chứa 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP và 10 mM MgCl2 trong 2 giờ ở 27 °C. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 800 µl methanol, sau đó làm lạnh ở -20 °C trong 1 giờ, rồi ly tâm ở 20.000 g trong 10 phút ở 4 °C. Dịch nổi sau đó được phân tích bằng HPLC-MS/MS. Để bất hoạt nhiệt các protein được sử dụng trong nhóm đối chứng, các protein được ủ trong 50% glycerol trong PBS trong 20 phút ở 95°C.
Đối với hoạt tính EPP in vitro, protein được ủ với 3D20E22P (tương đương với lượng tìm thấy trong 18 cặp MAG, được tinh chế bằng HPLC-MS/MS) trong 100 µl dung dịch đệm (pH 7,5) chứa 25 mM Tris, 50 mM axit axetic, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA và 1 mM DTT trong 3 giờ ở 27 °C. Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 400 µl methanol và làm lạnh ở -20 °C trong 1 giờ, sau đó ly tâm ở 20.000 g trong 10 phút ở 4 °C. Dịch nổi được phân tích bằng HPLC-MS/MS.
Các đoạn PCR cho EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) và EcK2 (556 bp) được khuếch đại từ cDNA được điều chế từ xác muỗi không đầu thuộc cả hai giới. Đoạn PCR của mẫu đối chứng eGFP (495 bp) được khuếch đại từ pCR2.1-eGFP đã được mô tả trước đó; Các mồi PCR được liệt kê trong Bảng Dữ liệu Mở rộng 2. Đoạn PCR được chèn vào giữa các promoter T7 đảo ngược trên plasmid pL4440. Các cấu trúc plasmid được thu hồi từ E. coli NEB 5-α có khả năng chuyển nạp (New England Biolabs) và được xác minh bằng trình tự DNA trước khi sử dụng (xem Dữ liệu Bổ sung 1 để biết trình tự chèn). Các mồi phù hợp với promoter T7 (Bảng Dữ liệu Mở rộng 2) được sử dụng để khuếch đại đoạn chèn từ plasmid dựa trên pL4440. Kích thước sản phẩm PCR được xác nhận bằng điện di trên gel agarose. dsRNA được phiên mã từ các khuôn mẫu PCR bằng cách sử dụng Bộ kit Phiên mã Megascript T7 (Thermo Fisher) và được tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các sửa đổi đã được mô tả trước đó.
Đối với tiêm dsRNA, 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) được tiêm với nồng độ 10 ng/nl vào ngực của con đực hoặc con cái trưởng thành (Nanoject III, Drummond) trong vòng 1 ngày sau khi nở. Mức độ giảm biểu hiện gen được xác định trong ít nhất ba lần lặp lại sinh học bằng cách chiết xuất RNA, tổng hợp cDNA và RT-qPCR. Đối với tiêm ecdysone, con cái chưa giao phối 4 ngày tuổi hoặc con cái chưa giao phối đã hút máu 6 ngày tuổi được tiêm 0,13, 0,21 hoặc 0,63 µg 20E hoặc 3D20E (Nanoject III, Drummond) với nồng độ tương ứng là 1,3, 2,1, tùy thuộc vào thiết kế thí nghiệm hoặc 6,3 ng/nl. Tiêm 100 nl ethanol 10% (thể tích/thể tích) trong nước; 100 nl 3D20E22P trong ethanol 10% (tương đương 75% lượng có trong một cặp MAG). Muỗi được phân ngẫu nhiên vào nhóm tiêm.
Đối với các thí nghiệm sinh sản, muỗi cái 3 ngày tuổi được cho ăn máu người không giới hạn. Loại bỏ những con muỗi đã ăn một phần hoặc chưa ăn. Tùy thuộc vào phương pháp điều trị, muỗi cái được đặt trong các cốc sinh sản riêng biệt trong bốn đêm, ít nhất 48 giờ sau khi ăn máu. Trứng được đếm dưới kính hiển vi soi nổi (Stemi 508, Zeiss); đối với muỗi cái đã giao phối, trứng nở thành ấu trùng được coi là có khả năng thụ tinh.
Đối với các thử nghiệm giao phối, con cái được cho ít nhất 2 ngày tùy thuộc vào phương pháp điều trị để phát triển khả năng kháng giao phối, và sau đó con đực hoang dã cùng tuổi được đưa vào cùng lồng. Hai đêm sau, túi tinh của con cái được mổ tách và DNA bộ gen được giải phóng bằng phương pháp đông lạnh-tan chảy và siêu âm trong dung dịch đệm chứa 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA và 25 mM NaCl (pH 8,2). Các mẫu được ủ với Proteinase K (0,86 µg µl-1) trong 15 phút ở 55 °C, sau đó là 10 phút ở 95 °C. Các chế phẩm DNA bộ gen thô được pha loãng 10 lần và được phân tích bằng qPCR để phát hiện trình tự nhiễm sắc thể Y; các mồi được liệt kê trong Bảng dữ liệu mở rộng 2. Sự vắng mặt của trình tự nhiễm sắc thể Y cho thấy không có sự giao phối.
Đối với các thí nghiệm giao phối lại, những con cái bị ép giao phối được kiểm tra sự hiện diện của nút giao phối để xác nhận tình trạng giao phối và được cho 2 ngày để phát triển khả năng kháng giao phối khi không có con đực, như đã mô tả trước đây 36. Sau đó, những con đực mang tinh trùng chuyển gen DsRed được đưa vào lồng của con cái. Hai đêm sau, túi thụ tinh được tách ra từ con cái, và DNA bộ gen được chuẩn bị như đã mô tả ở trên và được phân tích bằng qPCR để phát hiện gen chuyển DsRed; các mồi được liệt kê trong Bảng dữ liệu mở rộng 2. Sự vắng mặt của gen chuyển DsRed cho thấy không có sự giao phối lại nào xảy ra.
3D20E được tổng hợp như đã mô tả trước đây 37. Tóm lại, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) được hòa tan trong 10 ml nước, sau đó thêm 30 mg bạch kim đen (dạng bột, Sigma-Aldrich). Một dòng khí O2 nhẹ được sục liên tục vào hỗn hợp phản ứng, được khuấy ở nhiệt độ phòng. Sau 6 giờ, 30 ml metanol được thêm vào để dừng phản ứng. Hỗn hợp được ly tâm để loại bỏ các hạt xúc tác. Phần dịch nổi được làm bay hơi đến khô trong chân không ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm phản ứng khô được hòa tan trong 10% etanol và metanol để tiêm vào máy phân tích HPLC-MS/MS. Tỷ lệ chuyển đổi (từ 20E sang 3D20E) xấp xỉ 97% (Hình 4b), và phổ MS của 3D20E được tổng hợp phù hợp với phổ tìm thấy ở con cái đã giao phối (Hình 4c).
Phần chú thích chứa các chi tiết cụ thể về các phép kiểm định thống kê đã được thực hiện. Phần mềm GraphPad (phiên bản 9.0) được sử dụng để thực hiện phép kiểm định chính xác Fisher, phép kiểm định Mantel-Cox và phép kiểm định t của Student. Các phép kiểm định Cochran-Mantel-Haenszel được thực hiện bằng cách sử dụng một tập lệnh R tùy chỉnh (có sẵn tại https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Phân bố dữ liệu được kiểm tra tính chuẩn bằng phép kiểm định Shapiro-Wilk với ngưỡng ý nghĩa là 0,05. Khi dữ liệu không đạt phép kiểm định chuẩn, phép kiểm định Mann-Whitney được thực hiện. Dữ liệu về khả năng sống sót được phân tích bằng phép kiểm định Mantel-Cox. Gói DESeq2 (phiên bản 1.28.1) được sử dụng để thực hiện phân tích biểu hiện khác biệt ở cấp độ gen RNA-seq. Thanh ngang trên biểu đồ biểu thị giá trị trung vị. Giá trị ý nghĩa P = 0,05 được sử dụng làm ngưỡng cho tất cả các phép kiểm định.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, vui lòng xem bản tóm tắt Báo cáo Nghiên cứu Nature được liên kết với bài viết này.
Dữ liệu proteomics MS đã được gửi vào ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) thông qua PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) với mã định danh tập dữ liệu PXD032157.
Bộ dữ liệu RNA-seq được lưu trữ trong Thư viện Toàn diện Biểu hiện Gen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) với mã số GSE198665.
Các bộ dữ liệu bổ sung được tạo ra và/hoặc phân tích trong nghiên cứu hiện tại có thể được cung cấp bởi các tác giả tương ứng khi có yêu cầu hợp lý. Bài báo này cung cấp dữ liệu nguồn.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroid sinh dục bị lãng quên ở côn trùng? Con đực: Hộp đen. Khoa học côn trùng. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone và sự phát triển buồng trứng ở Anopheles stephens. Tạp chí Sinh lý côn trùng. 28, 97–109 (1982).
Thời gian đăng bài: 08/07/2022