Axit propionic (PPA), một chất chống nấm và chất phụ gia thực phẩm phổ biến, đã được chứng minh là gây ra sự phát triển thần kinh bất thường ở chuột kèm theo rối loạn chức năng đường tiêu hóa, có thể do rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột. Mối liên hệ giữa việc tiếp xúc với PPA trong chế độ ăn và rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột đã được đề xuất, nhưng chưa được nghiên cứu trực tiếp. Ở đây, chúng tôi đã nghiên cứu những thay đổi liên quan đến PPA trong thành phần hệ vi sinh vật đường ruột có thể dẫn đến rối loạn hệ vi sinh vật. Hệ vi sinh vật đường ruột của chuột được cho ăn chế độ ăn không được xử lý (n=9) và chế độ ăn giàu PPA (n=13) đã được giải trình tự bằng phương pháp giải trình tự metagenomic tầm xa để đánh giá sự khác biệt về thành phần vi khuẩn và các con đường trao đổi chất của vi khuẩn. PPA trong chế độ ăn có liên quan đến sự gia tăng số lượng các nhóm vi sinh vật quan trọng, bao gồm một số loài Bacteroides, Prevotella và Ruminococcus, những loài trước đây đã được chứng minh là có liên quan đến sản xuất PPA. Hệ vi sinh vật của chuột tiếp xúc với PPA cũng có nhiều con đường liên quan đến chuyển hóa lipid và sinh tổng hợp hormone steroid. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy PPA có thể làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột và các con đường trao đổi chất liên quan. Những thay đổi quan sát được này nhấn mạnh rằng các chất bảo quản được phân loại là an toàn cho tiêu dùng vẫn có thể ảnh hưởng đến thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột và từ đó ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Trong số đó, P, G hoặc S được chọn tùy thuộc vào mức độ phân loại đang được phân tích. Để giảm thiểu tác động của các phân loại dương tính giả, ngưỡng độ phong phú tương đối tối thiểu là 1e-4 (1/10.000 lượt đọc) đã được áp dụng. Trước khi phân tích thống kê, độ phong phú tương đối được báo cáo bởi Bracken (fraction_total_reads) đã được chuyển đổi bằng cách sử dụng phép biến đổi tỷ lệ logarit trung tâm (CLR) (Aitchison, 1982). Phương pháp CLR được chọn để chuyển đổi dữ liệu vì nó bất biến theo tỷ lệ và đủ cho các tập dữ liệu không thưa thớt (Gloor et al., 2017). Phép biến đổi CLR sử dụng logarit tự nhiên. Dữ liệu đếm được báo cáo bởi Bracken đã được chuẩn hóa bằng cách sử dụng biểu thức logarit tương đối (RLE) (Anders và Huber, 2010). Các hình ảnh được tạo ra bằng cách kết hợp matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 và logarit tuần tự (Gloor et al., 2017). 0.12.2 và stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Tỷ lệ Bacillus/Bacteroidetes được tính toán cho mỗi mẫu bằng cách sử dụng số lượng vi khuẩn được chuẩn hóa. Các giá trị được báo cáo trong bảng được làm tròn đến 4 chữ số thập phân. Chỉ số đa dạng Simpson được tính toán bằng cách sử dụng tập lệnh alpha_diversity.py được cung cấp trong gói KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Báo cáo Bracken được cung cấp trong tập lệnh và chỉ số Simpson “Si” được cung cấp cho tham số -an. Sự khác biệt đáng kể về độ phong phú được định nghĩa là sự khác biệt CLR trung bình ≥ 1 hoặc ≤ -1. Sự khác biệt CLR trung bình ±1 cho thấy sự gia tăng gấp 2,7 lần về độ phong phú của một loại mẫu. Dấu (+/-) cho biết liệu taxon đó có phong phú hơn trong mẫu PPA và mẫu đối chứng hay không. Mức độ ý nghĩa thống kê được xác định bằng phép thử Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Phần mềm Statsmodels phiên bản 0.14 (Benjamini và Hochberg, 1995; Seabold và Perktold, 2010) đã được sử dụng, và quy trình Benjamini-Hochberg được áp dụng để hiệu chỉnh cho việc kiểm định đa biến. Giá trị p điều chỉnh ≤ 0,05 được sử dụng làm ngưỡng để xác định ý nghĩa thống kê.
Hệ vi sinh vật đường ruột của con người thường được gọi là “cơ quan cuối cùng của cơ thể” và đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người (Baquero và Nombela, 2012). Đặc biệt, hệ vi sinh vật đường ruột được công nhận vì ảnh hưởng toàn hệ thống và vai trò của nó trong nhiều chức năng thiết yếu. Vi khuẩn cộng sinh rất phong phú trong ruột, chiếm nhiều vị trí sinh thái, sử dụng chất dinh dưỡng và cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh tiềm tàng (Jandhyala và cộng sự, 2015). Các thành phần vi khuẩn đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột có khả năng sản xuất các chất dinh dưỡng thiết yếu như vitamin và thúc đẩy quá trình tiêu hóa (Rowland và cộng sự, 2018). Các chất chuyển hóa của vi khuẩn cũng đã được chứng minh là ảnh hưởng đến sự phát triển mô và tăng cường các con đường trao đổi chất và miễn dịch (Heijtz và cộng sự, 2011; Yu và cộng sự, 2022). Thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người vô cùng đa dạng và phụ thuộc vào các yếu tố di truyền và môi trường như chế độ ăn uống, giới tính, thuốc men và tình trạng sức khỏe (Kumbhare và cộng sự, 2019).
Chế độ ăn của người mẹ là một thành phần quan trọng trong sự phát triển của thai nhi và trẻ sơ sinh, đồng thời là nguồn tiềm năng của các hợp chất có thể ảnh hưởng đến sự phát triển (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Một trong những hợp chất đáng quan tâm là axit propionic (PPA), một axit béo chuỗi ngắn là sản phẩm phụ thu được từ quá trình lên men của vi khuẩn và là một chất phụ gia thực phẩm (den Besten et al., 2013). PPA có đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm, do đó được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm và trong các ứng dụng công nghiệp để ức chế sự phát triển của nấm mốc và vi khuẩn (Wemmenhove et al., 2016). PPA có tác dụng khác nhau ở các mô khác nhau. Trong gan, PPA có tác dụng chống viêm bằng cách ảnh hưởng đến sự biểu hiện cytokine trong đại thực bào (Kawasoe et al., 2022). Tác dụng điều hòa này cũng đã được quan sát thấy ở các tế bào miễn dịch khác, dẫn đến giảm viêm (Haase et al., 2021). Tuy nhiên, tác dụng ngược lại đã được quan sát thấy ở não. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc tiếp xúc với PPA gây ra hành vi giống tự kỷ ở chuột (El-Ansary et al., 2012). Các nghiên cứu khác đã cho thấy PPA có thể gây ra chứng tăng sinh tế bào thần kinh đệm và kích hoạt các con đường gây viêm trong não (Abdelli et al., 2019). Vì PPA là một axit yếu, nó có thể khuếch tán qua biểu mô ruột vào máu và do đó vượt qua các rào cản hạn chế bao gồm cả hàng rào máu não cũng như nhau thai (Stinson et al., 2019), làm nổi bật tầm quan trọng của PPA như một chất chuyển hóa điều hòa được sản sinh bởi vi khuẩn. Mặc dù vai trò tiềm tàng của PPA như một yếu tố nguy cơ gây tự kỷ hiện đang được nghiên cứu, nhưng tác động của nó đối với những người mắc chứng tự kỷ có thể vượt ra ngoài việc gây ra sự biệt hóa thần kinh.
Các triệu chứng đường tiêu hóa như tiêu chảy và táo bón thường gặp ở bệnh nhân mắc các rối loạn phát triển thần kinh (Cao và cộng sự, 2021). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng hệ vi sinh vật đường ruột của bệnh nhân mắc chứng rối loạn phổ tự kỷ (ASD) khác với người khỏe mạnh, cho thấy sự hiện diện của chứng rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột (Finegold và cộng sự, 2010). Tương tự, đặc điểm hệ vi sinh vật của bệnh nhân mắc bệnh viêm ruột, béo phì, bệnh Alzheimer, v.v. cũng khác với người khỏe mạnh (Turnbaugh và cộng sự, 2009; Vogt và cộng sự, 2017; Henke và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có mối quan hệ nhân quả nào được thiết lập giữa hệ vi sinh vật đường ruột và các bệnh hoặc triệu chứng thần kinh (Yap và cộng sự, 2021), mặc dù một số loài vi khuẩn được cho là đóng vai trò trong một số trạng thái bệnh này. Ví dụ, các chi Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio và các chi khác có số lượng nhiều hơn trong hệ vi sinh vật của bệnh nhân tự kỷ (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Đáng chú ý, các loài thuộc một số chi này được biết là sở hữu các gen liên quan đến sản xuất PPA (Reichardt et al., 2014; Yun và Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur và Dürre, 2023). Do đặc tính kháng khuẩn của PPA, việc tăng số lượng PPA có thể có lợi cho sự phát triển của vi khuẩn sản xuất PPA (Jacobson et al., 2018). Do đó, môi trường giàu PFA có thể dẫn đến những thay đổi trong hệ vi sinh vật đường ruột, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa, đây có thể là những yếu tố tiềm tàng dẫn đến các triệu chứng đường tiêu hóa.
Một câu hỏi trọng tâm trong nghiên cứu hệ vi sinh vật là liệu sự khác biệt về thành phần vi sinh vật là nguyên nhân hay triệu chứng của các bệnh tiềm ẩn. Bước đầu tiên để làm sáng tỏ mối quan hệ phức tạp giữa chế độ ăn uống, hệ vi sinh vật đường ruột và các bệnh thần kinh là đánh giá tác động của chế độ ăn uống lên thành phần vi sinh vật. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp giải trình tự metagenomic đọc dài để so sánh hệ vi sinh vật đường ruột của chuột con được cho ăn chế độ ăn giàu PPA hoặc chế độ ăn thiếu PPA. Chuột con được cho ăn cùng chế độ ăn với chuột mẹ. Chúng tôi giả thuyết rằng chế độ ăn giàu PPA sẽ dẫn đến những thay đổi trong thành phần vi sinh vật đường ruột và các con đường chức năng của vi sinh vật, đặc biệt là những con đường liên quan đến chuyển hóa PPA và/hoặc sản xuất PPA.
Nghiên cứu này sử dụng chuột chuyển gen FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) biểu hiện quá mức protein huỳnh quang xanh (GFP) dưới sự kiểm soát của promoter GFAP đặc hiệu cho tế bào thần kinh đệm theo hướng dẫn của Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật thuộc Đại học Trung Florida (UCF-IACUC) (Số giấy phép sử dụng động vật: PROTO202000002). Sau khi cai sữa, chuột được nuôi riêng lẻ trong lồng, mỗi lồng có từ 1 đến 5 con chuột mỗi giới tính. Chuột được cho ăn tự do bằng chế độ ăn kiểm soát tinh khiết (chế độ ăn tiêu chuẩn nhãn mở đã được sửa đổi, 16 kcal% chất béo) hoặc chế độ ăn bổ sung natri propionat (chế độ ăn tiêu chuẩn nhãn mở đã được sửa đổi, 16 kcal% chất béo, chứa 5.000 ppm natri propionat). Lượng natri propionat được sử dụng tương đương với 5.000 mg PFA/kg tổng trọng lượng thức ăn. Đây là nồng độ PPA cao nhất được chấp thuận sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm. Để chuẩn bị cho nghiên cứu này, chuột bố mẹ được cho ăn cả hai chế độ ăn trong 4 tuần trước khi giao phối và tiếp tục cho ăn trong suốt thời gian mang thai của chuột mẹ. Chuột con [22 con chuột, 9 con đối chứng (6 con đực, 3 con cái) và 13 con chuột PPA (4 con đực, 9 con cái)] được cai sữa và sau đó tiếp tục được cho ăn cùng chế độ ăn với chuột mẹ trong 5 tháng. Chuột con được giết mổ ở 5 tháng tuổi và phân của chúng được thu thập và ban đầu được bảo quản trong ống ly tâm nhỏ 1,5 ml ở -20°C, sau đó được chuyển đến tủ đông -80°C cho đến khi DNA của vật chủ cạn kiệt và axit nucleic của vi khuẩn được chiết xuất.
ADN vật chủ được loại bỏ theo một quy trình đã được sửa đổi (Charalampous et al., 2019). Tóm lại, chất chứa trong phân được chuyển vào 500 µl InhibitEX (Qiagen, Mã số/ID: 19593) và bảo quản đông lạnh. Xử lý tối đa 1-2 viên phân cho mỗi lần chiết xuất. Sau đó, chất chứa trong phân được đồng nhất hóa bằng cơ học bằng chày nhựa bên trong ống nghiệm để tạo thành hỗn hợp sệt. Ly tâm mẫu ở 10.000 RCF trong 5 phút hoặc cho đến khi mẫu lắng xuống, sau đó hút bỏ phần dịch nổi và hòa tan lại phần lắng trong 250 µl dung dịch PBS 1×. Thêm 250 µl dung dịch saponin 4,4% (TCI, mã sản phẩm S0019) vào mẫu như một chất tẩy rửa để làm lỏng màng tế bào nhân chuẩn. Các mẫu được trộn nhẹ nhàng cho đến khi mịn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tiếp theo, để phá vỡ tế bào nhân chuẩn, thêm 350 μl nước không chứa nuclease vào mẫu, ủ trong 30 giây, sau đó thêm 12 μl dung dịch NaCl 5 M. Sau đó, ly tâm mẫu ở tốc độ 6000 RCF trong 5 phút. Hút bỏ phần dịch nổi và hòa tan lại phần cặn trong 100 μl dung dịch PBS 1X. Để loại bỏ DNA của vật chủ, thêm 100 μl dung dịch đệm HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml MgCl2 1M, 36 ml nước không chứa nuclease) và 10 μl enzyme HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Các mẫu được trộn đều bằng pipet và ủ ở 37 °C trong 30 phút với tốc độ 800 vòng/phút trên máy trộn nhiệt Eppendorf™ ThermoMixer C. Sau khi ủ, ly tâm ở 6000 RCF trong 3 phút và rửa hai lần với 800 µl và 1000 µl dung dịch PBS 1X. Cuối cùng, hòa tan lại cặn trong 100 µl dung dịch PBS 1X.
Tổng lượng DNA vi khuẩn được phân lập bằng Bộ dụng cụ tinh chế DNA hệ gen Monarch của New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Mã số T3010L). Quy trình vận hành tiêu chuẩn được cung cấp kèm theo bộ dụng cụ được sửa đổi một chút. Ủ và duy trì nước không chứa nuclease ở 60°C trước khi tiến hành bước rửa giải cuối cùng. Thêm 10 µl Proteinase K và 3 µl RNase A vào mỗi mẫu. Sau đó thêm 100 µl dung dịch đệm ly giải tế bào và trộn nhẹ nhàng. Các mẫu sau đó được ủ trong máy trộn nhiệt Eppendorf™ ThermoMixer C ở 56°C và 1400 vòng/phút trong ít nhất 1 giờ và tối đa 3 giờ. Các mẫu đã ủ được ly tâm ở 12.000 RCF trong 3 phút và dịch nổi từ mỗi mẫu được chuyển sang ống ly tâm nhỏ 1,5 mL riêng biệt chứa 400 µL dung dịch liên kết. Các ống nghiệm sau đó được lắc đều trong 5–10 giây với khoảng thời gian 1 giây giữa mỗi lần lắc. Chuyển toàn bộ lượng chất lỏng trong mỗi mẫu (khoảng 600–700 µL) vào hộp lọc đặt trong ống thu thập mẫu có hệ thống dẫn dòng. Các ống nghiệm được ly tâm ở tốc độ 1.000 RCF trong 3 phút để cho phép DNA liên kết ban đầu, sau đó ly tâm tiếp ở tốc độ 12.000 RCF trong 1 phút để loại bỏ chất lỏng còn sót lại. Cột mẫu được chuyển sang ống thu thập mới và rửa hai lần. Đối với lần rửa đầu tiên, thêm 500 µL dung dịch rửa vào mỗi ống. Lật ngược ống 3–5 lần và sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 RCF trong 1 phút. Loại bỏ chất lỏng trong ống thu thập và đặt hộp lọc trở lại vào cùng ống thu thập đó. Đối với lần rửa thứ hai, thêm 500 µL dung dịch rửa vào bộ lọc mà không cần lật ngược. Các mẫu được ly tâm ở tốc độ 12.000 RCF trong 1 phút. Chuyển màng lọc vào ống LoBind® 1,5 mL và thêm 100 µL nước không chứa nuclease đã được làm ấm trước. Màng lọc được ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó ly tâm ở 12.000 RCF trong 1 phút. DNA được tách chiết được bảo quản ở -80°C.
Nồng độ DNA được định lượng bằng máy đo huỳnh quang Qubit™ 4.0. DNA được chuẩn bị bằng bộ kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (Mã số Q33231) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân bố chiều dài đoạn DNA được đo bằng máy Aglient™ 4150 hoặc 4200 TapeStation. DNA được chuẩn bị bằng thuốc thử DNA bộ gen Agilent™ (Mã số 5067-5366) và băng sàng lọc DNA bộ gen (Mã số 5067-5365). Việc chuẩn bị thư viện được thực hiện bằng bộ kit mã vạch PCR nhanh Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA được giải trình tự bằng máy giải trình tự ONT GridION™ Mk1 với tế bào dòng chảy Min106D (R 9.4.1). Các thiết lập giải trình tự bao gồm: gọi base với độ chính xác cao, giá trị q tối thiểu là 9, thiết lập mã vạch và cắt bỏ mã vạch. Các mẫu được giải trình tự trong 72 giờ, sau đó dữ liệu gọi base được gửi để xử lý và phân tích thêm.
Quá trình xử lý tin sinh học được thực hiện bằng các phương pháp đã được mô tả trước đó (Greenman et al., 2024). Các tệp FASTQ thu được từ quá trình giải trình tự được chia thành các thư mục cho mỗi mẫu. Trước khi phân tích tin sinh học, dữ liệu được xử lý bằng quy trình sau: đầu tiên, các tệp FASTQ của các mẫu được hợp nhất thành một tệp FASTQ duy nhất. Sau đó, các đoạn đọc ngắn hơn 1000 bp được lọc bằng Filtlong v. 0.2.1, với tham số duy nhất được thay đổi là –min_length 1000 (Wick, 2024). Trước khi lọc thêm, chất lượng đoạn đọc được kiểm soát bằng NanoPlot v. 1.41.3 với các tham số sau: –fastq –plots dot –N50 -o
Để phân loại theo hệ thống phân loại sinh vật, các trình tự đọc và các đoạn contig đã được lắp ráp được phân loại bằng Kraken2 phiên bản 2.1.2 (Wood et al., 2019). Tạo báo cáo và tệp đầu ra cho các trình tự đọc và các đoạn lắp ráp tương ứng. Sử dụng tùy chọn –use-names để phân tích các trình tự đọc và các đoạn lắp ráp. Các tùy chọn –gzip-compressed và –paired được chỉ định cho các đoạn đọc. Độ phong phú tương đối của các đơn vị phân loại trong metagenome được ước tính bằng Bracken phiên bản 2.8 (Lu et al., 2017). Đầu tiên, chúng tôi tạo một cơ sở dữ liệu kmer chứa 1000 base bằng cách sử dụng bracken-build với các tham số sau: -d
Việc chú thích gen và ước tính độ phong phú tương đối được thực hiện bằng cách sử dụng phiên bản sửa đổi của giao thức được mô tả bởi Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Đầu tiên, các contig ngắn hơn 500 bp đã được loại bỏ khỏi tất cả các bản lắp ráp bằng cách sử dụng SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Sau đó, các bản lắp ráp được chọn được kết hợp thành một hệ gen vi sinh vật toàn diện. Các khung đọc mở (ORF) được xác định bằng cách sử dụng Prodigal v. 1.0.1 (một phiên bản song song của Prodigal v. 2.6.3) với các tham số sau: -d
Các gen được nhóm lại theo mã định danh ortholog (KO) của Bách khoa toàn thư về gen và bộ gen Kyoto (KEGG) do eggNOG gán để so sánh mức độ phong phú của các con đường gen. Các gen không bị loại bỏ hoặc các gen bị loại bỏ nhiều lần đã được loại bỏ trước khi phân tích. Sau đó, mức độ phong phú trung bình của mỗi KO trên mỗi mẫu được tính toán và phân tích thống kê được thực hiện. Các gen chuyển hóa PPA được định nghĩa là bất kỳ gen nào được gán hàng ko00640 trong cột KEGG_Pathway, cho thấy vai trò trong quá trình chuyển hóa propionate theo KEGG. Các gen được xác định là có liên quan đến sản xuất PPA được liệt kê trong Bảng bổ sung 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Các thử nghiệm hoán vị được thực hiện để xác định các gen chuyển hóa và sản xuất PPA có mức độ phong phú cao hơn đáng kể trong mỗi loại mẫu. Một nghìn phép hoán vị đã được thực hiện cho mỗi gen được phân tích. Giá trị p là 0,05 được sử dụng làm ngưỡng để xác định ý nghĩa thống kê. Chú thích chức năng được gán cho từng gen riêng lẻ trong một cụm dựa trên chú thích của các gen đại diện trong cụm đó. Các taxa liên quan đến chuyển hóa PPA và/hoặc sản xuất PPA có thể được xác định bằng cách đối khớp ID contig trong các tệp đầu ra của Kraken2 với cùng các ID contig được giữ lại trong quá trình chú thích chức năng bằng eggNOG. Kiểm định ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng phép thử Mann-Whitney U đã được mô tả trước đó. Hiệu chỉnh cho nhiều phép thử được thực hiện bằng quy trình Benjamini-Hochberg. Giá trị p ≤ 0,05 được sử dụng làm ngưỡng để xác định ý nghĩa thống kê.
Sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột ở chuột được đánh giá bằng chỉ số đa dạng Simpson. Không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát giữa mẫu đối chứng và mẫu PPA về sự đa dạng chi và loài (giá trị p đối với chi: 0,18, giá trị p đối với loài: 0,16) (Hình 1). Thành phần vi sinh vật sau đó được so sánh bằng phân tích thành phần chính (PCA). Hình 2 cho thấy sự phân cụm các mẫu theo ngành của chúng, cho thấy có sự khác biệt về thành phần loài của hệ vi sinh vật giữa mẫu PPA và mẫu đối chứng. Sự phân cụm này ít rõ rệt hơn ở cấp độ chi, cho thấy PPA ảnh hưởng đến một số loại vi khuẩn nhất định (Hình bổ sung 1).
Hình 1. Độ đa dạng alpha của các chi và thành phần loài trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột. Biểu đồ hộp thể hiện chỉ số đa dạng Simpson của các chi (A) và loài (B) trong mẫu PPA và mẫu đối chứng. Ý nghĩa thống kê được xác định bằng phép thử Mann-Whitney U, và hiệu chỉnh bội được thực hiện bằng quy trình Benjamini-Hochberg. ns, giá trị p không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Hình 2. Kết quả phân tích thành phần chính về thành phần hệ vi sinh vật đường ruột của chuột ở cấp độ loài. Biểu đồ phân tích thành phần chính hiển thị sự phân bố của các mẫu trên hai thành phần chính đầu tiên của chúng. Màu sắc biểu thị loại mẫu: chuột tiếp xúc với PPA có màu tím và chuột đối chứng có màu vàng. Thành phần chính 1 và 2 được vẽ trên trục x và trục y tương ứng, và được biểu thị bằng tỷ lệ phương sai được giải thích của chúng.
Sử dụng dữ liệu đếm được chuyển đổi bằng phương pháp RLE, người ta quan sát thấy sự giảm đáng kể về tỷ lệ trung vị Bacteroidetes/Bacilli ở chuột nhóm đối chứng và chuột PPA (nhóm đối chứng: 9,66, nhóm PPA: 3,02; giá trị p = 0,0011). Sự khác biệt này là do số lượng Bacteroidetes nhiều hơn ở chuột PPA so với nhóm đối chứng, mặc dù sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (CLR trung bình nhóm đối chứng: 5,51, CLR trung bình nhóm PPA: 6,62; giá trị p = 0,054), trong khi số lượng Bacteroidetes tương tự nhau (CLR trung bình nhóm đối chứng: 7,76, CLR trung bình nhóm PPA: 7,60; giá trị p = 0,18).
Phân tích sự phong phú của các thành viên phân loại trong hệ vi sinh vật đường ruột cho thấy có 1 ngành và 77 loài khác biệt đáng kể giữa mẫu PPA và mẫu đối chứng (Bảng bổ sung 2). Sự phong phú của 59 loài trong mẫu PPA cao hơn đáng kể so với mẫu đối chứng, trong khi sự phong phú của chỉ 16 loài trong mẫu đối chứng cao hơn so với mẫu PPA (Hình 3).
Hình 3. Sự khác biệt về số lượng các loài trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột PPA và chuột đối chứng. Biểu đồ núi lửa hiển thị sự khác biệt về số lượng chi (A) hoặc loài (B) giữa mẫu PPA và mẫu đối chứng. Các chấm màu xám cho biết không có sự khác biệt đáng kể về số lượng các loài. Các chấm màu cho biết sự khác biệt đáng kể về số lượng (giá trị p ≤ 0,05). 20 loài có sự khác biệt lớn nhất về số lượng giữa các loại mẫu được hiển thị bằng màu đỏ và xanh nhạt (mẫu đối chứng và mẫu PPA), tương ứng. Các chấm màu vàng và tím có số lượng nhiều hơn ít nhất 2,7 lần trong mẫu đối chứng hoặc mẫu PPA so với mẫu đối chứng. Các chấm màu đen đại diện cho các loài có số lượng khác biệt đáng kể, với sự khác biệt trung bình CLR từ -1 đến 1. Giá trị p được tính bằng phép thử Mann-Whitney U và được hiệu chỉnh cho nhiều phép thử bằng quy trình Benjamini-Hochberg. Sự khác biệt trung bình CLR được in đậm cho biết sự khác biệt đáng kể về số lượng.
Sau khi phân tích thành phần vi sinh vật đường ruột, chúng tôi đã thực hiện chú thích chức năng của hệ vi sinh vật. Sau khi lọc bỏ các gen chất lượng thấp, tổng cộng 378.355 gen độc nhất đã được xác định trên tất cả các mẫu. Độ phong phú được chuyển đổi của các gen này được sử dụng cho phân tích thành phần chính (PCA), và kết quả cho thấy mức độ phân cụm cao của các loại mẫu dựa trên hồ sơ chức năng của chúng (Hình 4).
Hình 4. Kết quả PCA sử dụng hồ sơ chức năng của hệ vi sinh vật đường ruột chuột. Biểu đồ PCA hiển thị sự phân bố của các mẫu trên hai thành phần chính đầu tiên của chúng. Màu sắc biểu thị loại mẫu: chuột tiếp xúc với PPA có màu tím và chuột đối chứng có màu vàng. Thành phần chính 1 và 2 được vẽ trên trục x và trục y tương ứng, và được biểu thị bằng tỷ lệ phương sai được giải thích của chúng.
Tiếp theo, chúng tôi đã kiểm tra sự phong phú của các gen bị loại bỏ (knockouts) trong các loại mẫu khác nhau. Tổng cộng có 3648 gen bị loại bỏ duy nhất được xác định, trong đó 196 gen có số lượng nhiều hơn đáng kể trong các mẫu đối chứng và 106 gen có số lượng nhiều hơn trong các mẫu PPA (Hình 5). Tổng cộng có 145 gen được phát hiện trong các mẫu đối chứng và 61 gen trong các mẫu PPA, với số lượng khác biệt đáng kể. Các con đường liên quan đến chuyển hóa lipid và aminosugar được làm giàu nhiều hơn đáng kể trong các mẫu PPA (Bảng bổ sung 3). Các con đường liên quan đến chuyển hóa nitơ và hệ thống truyền lưu huỳnh được làm giàu nhiều hơn đáng kể trong các mẫu đối chứng (Bảng bổ sung 3). Số lượng gen liên quan đến chuyển hóa aminosugar/nucleotide (ko:K21279) và chuyển hóa inositol phosphate (ko:K07291) cao hơn đáng kể trong các mẫu PPA (Hình 5). Các mẫu đối chứng có số lượng gen liên quan đến quá trình chuyển hóa benzoat (ko:K22270), chuyển hóa nitơ (ko:K00368) và quá trình đường phân/tổng hợp glucose (ko:K00131) nhiều hơn đáng kể (Hình 5).
Hình 5. Sự khác biệt về số lượng KO trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột PPA và chuột đối chứng. Biểu đồ núi lửa mô tả sự khác biệt về số lượng các nhóm chức năng (KO). Các chấm màu xám biểu thị các KO có số lượng không khác biệt đáng kể giữa các loại mẫu (giá trị p > 0,05). Các chấm màu biểu thị sự khác biệt đáng kể về số lượng (giá trị p ≤ 0,05). 20 KO có sự khác biệt lớn nhất về số lượng giữa các loại mẫu được hiển thị bằng màu đỏ và xanh nhạt, tương ứng với mẫu đối chứng và mẫu PPA. Các chấm màu vàng và tím biểu thị các KO có số lượng nhiều hơn ít nhất 2,7 lần trong mẫu đối chứng và mẫu PPA. Các chấm màu đen biểu thị các KO có số lượng khác biệt đáng kể, với sự khác biệt CLR trung bình từ -1 đến 1. Giá trị p được tính bằng phép thử Mann-Whitney U và được điều chỉnh cho nhiều phép so sánh bằng quy trình Benjamini-Hochberg. NaN cho biết KO không thuộc về một con đường trong KEGG. Các giá trị khác biệt CLR trung bình được in đậm cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng. Để biết thông tin chi tiết về các con đường mà các KO được liệt kê thuộc về, xem Bảng bổ sung 3.
Trong số các gen được chú thích, 1601 gen có sự khác biệt đáng kể về mức độ biểu hiện giữa các loại mẫu (p ≤ 0,05), với mỗi gen có mức độ biểu hiện cao hơn ít nhất 2,7 lần. Trong số các gen này, 4 gen có mức độ biểu hiện cao hơn ở mẫu đối chứng và 1597 gen có mức độ biểu hiện cao hơn ở mẫu PPA. Vì PPA có đặc tính kháng khuẩn, chúng tôi đã kiểm tra mức độ biểu hiện của các gen chuyển hóa và sản xuất PPA giữa các loại mẫu. Trong số 1332 gen liên quan đến chuyển hóa PPA, 27 gen có mức độ biểu hiện cao hơn đáng kể ở mẫu đối chứng và 12 gen có mức độ biểu hiện cao hơn ở mẫu PPA. Trong số 223 gen liên quan đến sản xuất PPA, 1 gen có mức độ biểu hiện cao hơn đáng kể ở mẫu PPA. Hình 6A minh họa thêm mức độ biểu hiện cao hơn của các gen liên quan đến chuyển hóa PPA, với mức độ biểu hiện cao hơn đáng kể ở mẫu đối chứng và hiệu ứng kích thước lớn, trong khi Hình 6B làm nổi bật các gen riêng lẻ có mức độ biểu hiện cao hơn đáng kể được quan sát thấy ở mẫu PPA.
Hình 6. Sự khác biệt về số lượng gen liên quan đến PPA trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột. Biểu đồ núi lửa mô tả sự khác biệt về số lượng gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA (A) và sản xuất PPA (B). Các chấm màu xám biểu thị các gen có số lượng không khác biệt đáng kể giữa các loại mẫu (giá trị p > 0,05). Các chấm màu biểu thị sự khác biệt đáng kể về số lượng (giá trị p ≤ 0,05). 20 gen có sự khác biệt lớn nhất về số lượng được hiển thị bằng màu đỏ và xanh nhạt (mẫu đối chứng và mẫu PPA), tương ứng. Số lượng các chấm màu vàng và tím ít nhất gấp 2,7 lần ở mẫu đối chứng và mẫu PPA so với mẫu đối chứng. Các chấm màu đen đại diện cho các gen có số lượng khác biệt đáng kể, với sự khác biệt CLR trung bình từ -1 đến 1. Giá trị P được tính bằng phép thử Mann-Whitney U và được hiệu chỉnh cho nhiều phép so sánh bằng quy trình Benjamini-Hochberg. Các gen tương ứng với các gen đại diện trong danh mục gen không trùng lặp. Tên gen bao gồm ký hiệu KEGG biểu thị gen KO. Chữ in đậm biểu thị sự khác biệt về CLR cho thấy mức độ phong phú khác biệt đáng kể. Dấu gạch ngang (-) cho biết không có ký hiệu nào cho gen đó trong cơ sở dữ liệu KEGG.
Các đơn vị phân loại có gen liên quan đến quá trình chuyển hóa và/hoặc sản xuất PPA được xác định bằng cách đối chiếu danh tính phân loại của các đoạn trình tự với ID của đoạn trình tự đó. Ở cấp độ chi, 130 chi được tìm thấy có gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA và 61 chi được tìm thấy có gen liên quan đến sản xuất PPA (Bảng bổ sung 4). Tuy nhiên, không có chi nào cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng (p > 0,05).
Ở cấp độ loài, người ta phát hiện 144 loài vi khuẩn có gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA và 68 loài vi khuẩn có gen liên quan đến quá trình sản xuất PPA (Bảng bổ sung 5). Trong số các vi khuẩn chuyển hóa PPA, tám loại vi khuẩn cho thấy sự gia tăng đáng kể về số lượng giữa các loại mẫu, và tất cả đều cho thấy những thay đổi đáng kể về tác dụng (Bảng bổ sung 6). Tất cả các vi khuẩn chuyển hóa PPA được xác định có sự khác biệt đáng kể về số lượng đều có số lượng nhiều hơn trong các mẫu PPA. Phân loại ở cấp độ loài cho thấy các đại diện của các chi không có sự khác biệt đáng kể giữa các loại mẫu, bao gồm một số loài Bacteroides và Ruminococcus, cũng như Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus và Alcaligenes polymorpha. Trong số các vi khuẩn sản xuất PPA, bốn loại vi khuẩn cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng giữa các loại mẫu. Các loài có sự khác biệt đáng kể về số lượng bao gồm Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis và Ruminococcus bovis.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã kiểm tra tác động của việc tiếp xúc với PPA lên hệ vi sinh vật đường ruột của chuột. PPA có thể gây ra các phản ứng khác nhau ở vi khuẩn vì nó được sản xuất bởi một số loài, được sử dụng làm nguồn thức ăn bởi các loài khác hoặc có tác dụng kháng khuẩn. Do đó, việc bổ sung PPA vào môi trường đường ruột thông qua chế độ ăn uống có thể có những tác động khác nhau tùy thuộc vào khả năng dung nạp, tính nhạy cảm và khả năng sử dụng nó như một nguồn dinh dưỡng. Các loài vi khuẩn nhạy cảm có thể bị loại bỏ và được thay thế bởi những loài có khả năng kháng PPA cao hơn hoặc có thể sử dụng nó làm nguồn thức ăn, dẫn đến những thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột. Kết quả của chúng tôi cho thấy sự khác biệt đáng kể về thành phần vi khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến sự đa dạng vi khuẩn tổng thể. Tác động lớn nhất được quan sát thấy ở cấp độ loài, với hơn 70 loài có sự khác biệt đáng kể về số lượng giữa mẫu PPA và mẫu đối chứng (Bảng bổ sung 2). Việc đánh giá thêm thành phần của các mẫu tiếp xúc với PPA cho thấy tính không đồng nhất của các loài vi khuẩn cao hơn so với các mẫu không tiếp xúc, cho thấy rằng PPA có thể tăng cường đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn và hạn chế quần thể vi khuẩn có thể tồn tại trong môi trường giàu PPA. Do đó, PPA có thể gây ra những thay đổi có chọn lọc thay vì gây ra sự xáo trộn trên diện rộng đối với sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột.
Các chất bảo quản thực phẩm như PPA trước đây đã được chứng minh là làm thay đổi số lượng các thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột mà không ảnh hưởng đến sự đa dạng tổng thể (Nagpal et al., 2021). Ở đây, chúng tôi quan sát thấy sự khác biệt rõ rệt nhất giữa các loài Bacteroidetes trong ngành Bacteroidetes (trước đây được gọi là Bacteroidetes), được làm giàu đáng kể ở chuột tiếp xúc với PPA. Sự gia tăng số lượng các loài Bacteroides có liên quan đến sự gia tăng phân hủy chất nhầy, điều này có thể làm tăng nguy cơ nhiễm trùng và thúc đẩy viêm (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Một nghiên cứu cho thấy chuột đực sơ sinh được điều trị bằng Bacteroides fragilis thể hiện các hành vi xã hội gợi nhớ đến rối loạn phổ tự kỷ (ASD) (Carmel et al., 2023), và các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng các loài Bacteroides có thể làm thay đổi hoạt động miễn dịch và dẫn đến bệnh cơ tim viêm tự miễn dịch (Gil-Cruz et al., 2019). Các loài thuộc các chi Ruminococcus, Prevotella và Parabacteroides cũng gia tăng đáng kể ở chuột tiếp xúc với PPA (Coretti et al., 2018). Một số loài Ruminococcus có liên quan đến các bệnh như bệnh Crohn thông qua việc sản xuất các cytokine gây viêm (Henke et al., 2019), trong khi các loài Prevotella như Prevotella humani có liên quan đến các bệnh chuyển hóa như tăng huyết áp và nhạy cảm insulin (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Cuối cùng, chúng tôi nhận thấy rằng tỷ lệ Bacteroidetes (trước đây được gọi là Firmicutes) so với Bacteroidetes thấp hơn đáng kể ở chuột tiếp xúc với PPA so với chuột đối chứng do tổng số lượng loài Bacteroidetes cao hơn. Tỷ lệ này trước đây đã được chứng minh là một chỉ số quan trọng về sự cân bằng nội môi đường ruột, và sự rối loạn trong tỷ lệ này có liên quan đến nhiều trạng thái bệnh khác nhau (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), bao gồm cả các bệnh viêm ruột (Stojanov et al., 2020). Nhìn chung, các loài thuộc ngành Bacteroidetes dường như bị ảnh hưởng mạnh nhất bởi lượng PPA trong chế độ ăn tăng cao. Điều này có thể là do khả năng chịu đựng PPA cao hơn hoặc khả năng sử dụng PPA làm nguồn năng lượng, điều này đã được chứng minh là đúng đối với ít nhất một loài, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Ngoài ra, việc mẹ tiếp xúc với PPA có thể thúc đẩy sự phát triển của thai nhi bằng cách làm cho đường ruột của chuột con dễ bị nhiễm khuẩn Bacteroidetes hơn; tuy nhiên, thiết kế nghiên cứu của chúng tôi không cho phép đánh giá như vậy.
Đánh giá nội dung metagenomic cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng gen liên quan đến quá trình chuyển hóa và sản xuất PPA, trong đó chuột tiếp xúc với PPA có số lượng gen chịu trách nhiệm sản xuất PPA cao hơn, trong khi chuột không tiếp xúc với PPA lại có số lượng gen chịu trách nhiệm chuyển hóa PAA cao hơn (Hình 6). Những kết quả này cho thấy tác động của PPA lên thành phần vi sinh vật có thể không chỉ do việc sử dụng nó, nếu không thì số lượng gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA sẽ cao hơn trong hệ vi sinh vật đường ruột của chuột tiếp xúc với PPA. Một lời giải thích là PPA điều hòa số lượng vi khuẩn chủ yếu thông qua tác dụng kháng khuẩn của nó chứ không phải thông qua việc vi khuẩn sử dụng nó như một chất dinh dưỡng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng PPA ức chế sự phát triển của Salmonella Typhimurium theo cách phụ thuộc vào liều lượng (Jacobson et al., 2018). Tiếp xúc với nồng độ PPA cao hơn có thể chọn lọc ra các vi khuẩn kháng lại đặc tính kháng khuẩn của nó và có thể không nhất thiết phải có khả năng chuyển hóa hoặc sản xuất ra nó. Ví dụ, một số loài Parabacteroides cho thấy sự phong phú cao hơn đáng kể trong các mẫu PPA, nhưng không phát hiện thấy gen nào liên quan đến quá trình chuyển hóa hoặc sản xuất PPA (Bảng bổ sung 2, 4 và 5). Hơn nữa, việc sản xuất PPA như một sản phẩm phụ của quá trình lên men được phân bố rộng rãi trong nhiều loại vi khuẩn khác nhau (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Sự đa dạng vi khuẩn cao hơn có thể là lý do dẫn đến sự phong phú cao hơn của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA trong các mẫu đối chứng (Averina et al., 2020). Hơn nữa, chỉ có 27 (2,14%) trong số 1332 gen được dự đoán là các gen chỉ liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA. Nhiều gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA cũng tham gia vào các con đường trao đổi chất khác. Điều này càng chứng tỏ rằng sự phong phú của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA cao hơn trong các mẫu đối chứng; các gen này có thể hoạt động trong các con đường không dẫn đến việc sử dụng hoặc hình thành PPA như một sản phẩm phụ. Trong trường hợp này, chỉ có một gen liên quan đến quá trình tạo ra PPA cho thấy sự khác biệt đáng kể về mức độ phong phú giữa các loại mẫu. Ngược lại với các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA, các gen đánh dấu cho quá trình sản xuất PPA được lựa chọn vì chúng tham gia trực tiếp vào con đường sản xuất PPA của vi khuẩn. Ở chuột tiếp xúc với PPA, tất cả các loài đều cho thấy sự gia tăng đáng kể về số lượng và khả năng sản xuất PPA. Điều này ủng hộ dự đoán rằng PPA sẽ chọn lọc các vi sinh vật sản xuất PPA và do đó dự đoán rằng khả năng sản xuất PPA sẽ tăng lên. Tuy nhiên, số lượng gen không nhất thiết tương quan với biểu hiện gen; do đó, mặc dù số lượng gen liên quan đến quá trình chuyển hóa PPA cao hơn trong các mẫu đối chứng, tỷ lệ biểu hiện có thể khác nhau (Shi et al., 2014). Để xác nhận mối quan hệ giữa sự phổ biến của các gen sản xuất PPA và quá trình sản xuất PPA, cần có các nghiên cứu về biểu hiện của các gen liên quan đến sản xuất PPA.
Phân tích chú thích chức năng của metagenome PPA và metagenome đối chứng cho thấy một số khác biệt. Phân tích PCA về nội dung gen cho thấy các cụm riêng biệt giữa mẫu PPA và mẫu đối chứng (Hình 5). Phân cụm trong mẫu cho thấy nội dung gen của mẫu đối chứng đa dạng hơn, trong khi các mẫu PPA được nhóm lại với nhau. Phân cụm theo nội dung gen tương đương với phân cụm theo thành phần loài. Do đó, sự khác biệt về độ phong phú của các con đường chuyển hóa phù hợp với những thay đổi về độ phong phú của các loài và chủng cụ thể trong đó. Trong các mẫu PPA, hai con đường chuyển hóa có độ phong phú cao hơn đáng kể liên quan đến chuyển hóa đường amin/đường nucleotide (ko:K21279) và nhiều con đường chuyển hóa lipid (ko:K00647, ko:K03801; Bảng bổ sung 3). Các gen liên quan đến ko:K21279 được biết là có liên quan đến chi Bacteroides, một trong những chi có số lượng loài cao hơn đáng kể trong các mẫu PPA. Enzyme này có thể né tránh phản ứng miễn dịch bằng cách biểu hiện polysaccharid vỏ (Wang et al., 2008). Điều này có thể giải thích sự gia tăng vi khuẩn Bacteroidetes được quan sát thấy ở chuột tiếp xúc với PPA. Điều này bổ sung cho sự gia tăng tổng hợp axit béo được quan sát thấy trong hệ vi sinh vật PPA. Vi khuẩn sử dụng con đường FASIIko:K00647 (fabB) để sản xuất axit béo, có thể ảnh hưởng đến các con đường trao đổi chất của vật chủ (Yao và Rock, 2015; Johnson et al., 2020), và những thay đổi trong chuyển hóa lipid có thể đóng vai trò trong sự phát triển thần kinh (Yu et al., 2020). Một con đường khác cho thấy sự gia tăng về số lượng trong các mẫu PPA là quá trình sinh tổng hợp hormone steroid (ko:K12343). Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy mối quan hệ nghịch đảo giữa khả năng của hệ vi sinh vật đường ruột ảnh hưởng đến nồng độ hormone và bị ảnh hưởng bởi hormone, theo đó nồng độ steroid tăng cao có thể dẫn đến những hậu quả sức khỏe về sau (Tetel et al., 2018).
Nghiên cứu này cũng có những hạn chế và điểm cần xem xét. Một điểm khác biệt quan trọng là chúng tôi không thực hiện đánh giá sinh lý trên động vật. Do đó, không thể kết luận trực tiếp liệu những thay đổi trong hệ vi sinh vật có liên quan đến bất kỳ bệnh nào hay không. Một điểm cần xem xét khác là chuột trong nghiên cứu này được cho ăn cùng chế độ ăn với chuột mẹ. Các nghiên cứu trong tương lai có thể xác định liệu việc chuyển từ chế độ ăn giàu PPA sang chế độ ăn không có PPA có cải thiện tác động của nó lên hệ vi sinh vật hay không. Một hạn chế của nghiên cứu chúng tôi, giống như nhiều nghiên cứu khác, là kích thước mẫu hạn chế. Mặc dù có thể rút ra những kết luận hợp lệ, nhưng kích thước mẫu lớn hơn sẽ cung cấp sức mạnh thống kê lớn hơn khi phân tích kết quả. Chúng tôi cũng thận trọng khi đưa ra kết luận về mối liên hệ giữa những thay đổi trong hệ vi sinh vật đường ruột và bất kỳ bệnh nào (Yap et al., 2021). Các yếu tố gây nhiễu bao gồm tuổi tác, giới tính và chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng đáng kể đến thành phần của vi sinh vật. Những yếu tố này có thể giải thích sự không nhất quán được quan sát thấy trong tài liệu liên quan đến mối liên hệ giữa hệ vi sinh vật đường ruột với các bệnh phức tạp (Johnson et al., 2019; Lagod và Naser, 2023). Ví dụ, các thành viên thuộc chi Bacteroidetes đã được chứng minh là tăng hoặc giảm ở động vật và người mắc chứng tự kỷ (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Tương tự, các nghiên cứu về thành phần đường ruột ở bệnh nhân mắc bệnh viêm ruột đã tìm thấy cả sự tăng và giảm ở cùng các nhóm vi sinh vật này (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Để hạn chế tác động của sự thiên vị giới tính, chúng tôi đã cố gắng đảm bảo sự đại diện bình đẳng giữa hai giới để sự khác biệt có nhiều khả năng là do chế độ ăn uống. Một thách thức của việc chú thích chức năng là loại bỏ các trình tự gen dư thừa. Phương pháp phân cụm gen của chúng tôi yêu cầu độ tương đồng trình tự 95% và độ tương đồng chiều dài 85%, cũng như độ phủ căn chỉnh 90% để loại bỏ các cụm sai. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, chúng tôi đã quan sát thấy các COG có cùng chú thích (ví dụ: MUT) (Hình 6). Cần có thêm các nghiên cứu để xác định xem các gen tương đồng này có khác biệt, liên quan đến các chi cụ thể hay đây là một hạn chế của phương pháp phân cụm gen. Một hạn chế khác của chú thích chức năng là khả năng phân loại sai; gen vi khuẩn mmdA là một enzyme đã biết tham gia vào quá trình tổng hợp propionate, nhưng KEGG không liên kết nó với con đường chuyển hóa propionate. Ngược lại, các gen tương đồng scpB và mmcD lại có liên quan. Số lượng lớn các gen không có gen bị loại bỏ được chỉ định có thể dẫn đến việc không thể xác định các gen liên quan đến PPA khi đánh giá sự phong phú của gen. Các nghiên cứu trong tương lai sẽ được hưởng lợi từ phân tích siêu phiên mã, có thể cung cấp sự hiểu biết sâu sắc hơn về các đặc điểm chức năng của hệ vi sinh vật đường ruột và liên kết biểu hiện gen với các tác động tiềm tàng ở hạ nguồn. Đối với các nghiên cứu liên quan đến các rối loạn phát triển thần kinh cụ thể hoặc bệnh viêm ruột, cần có các đánh giá sinh lý và hành vi của động vật để liên kết những thay đổi trong thành phần hệ vi sinh vật với các rối loạn này. Các nghiên cứu bổ sung cấy ghép hệ vi sinh vật đường ruột vào chuột không có vi khuẩn cũng sẽ hữu ích để xác định xem hệ vi sinh vật là tác nhân gây bệnh hay là đặc điểm của bệnh.
Tóm lại, chúng tôi đã chứng minh rằng PPA trong chế độ ăn uống đóng vai trò là yếu tố làm thay đổi thành phần hệ vi sinh vật đường ruột. PPA là chất bảo quản được FDA phê duyệt, được tìm thấy rộng rãi trong nhiều loại thực phẩm, khi tiếp xúc lâu dài có thể dẫn đến sự phá vỡ hệ vi khuẩn đường ruột bình thường. Chúng tôi đã tìm thấy những thay đổi về số lượng của một số vi khuẩn, cho thấy PPA có thể ảnh hưởng đến thành phần hệ vi sinh vật đường ruột. Những thay đổi trong hệ vi sinh vật có thể dẫn đến những thay đổi về mức độ của một số con đường trao đổi chất nhất định, từ đó dẫn đến những thay đổi sinh lý có liên quan đến sức khỏe của vật chủ. Cần có thêm các nghiên cứu để xác định liệu tác động của PPA trong chế độ ăn uống lên thành phần vi khuẩn có thể dẫn đến rối loạn hệ vi sinh vật hoặc các bệnh khác hay không. Nghiên cứu này đặt nền tảng cho các nghiên cứu trong tương lai về cách tác động của PPA lên thành phần đường ruột có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Các bộ dữ liệu được trình bày trong nghiên cứu này có sẵn trong các kho lưu trữ trực tuyến. Tên kho lưu trữ và mã số truy cập là: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Nghiên cứu trên động vật này đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Trung Florida (UCF-IACUC) phê duyệt (Số giấy phép sử dụng động vật: PROTO202000002). Nghiên cứu này tuân thủ luật pháp, quy định địa phương và các yêu cầu của tổ chức.
NG: Khái niệm hóa, Thu thập dữ liệu, Phân tích chính thức, Điều tra, Phương pháp luận, Phần mềm, Trực quan hóa, Viết (bản thảo gốc), Viết (xem xét và chỉnh sửa). LA: Khái niệm hóa, Thu thập dữ liệu, Phương pháp luận, Tài nguyên, Viết (xem xét và chỉnh sửa). SH: Phân tích chính thức, Phần mềm, Viết (xem xét và chỉnh sửa). SA: Điều tra, Viết (xem xét và chỉnh sửa). Giám khảo chính: Điều tra, Viết (xem xét và chỉnh sửa). SN: Khái niệm hóa, Quản lý dự án, Tài nguyên, Giám sát, Viết (xem xét và chỉnh sửa). TA: Khái niệm hóa, Quản lý dự án, Giám sát, Viết (xem xét và chỉnh sửa).
Các tác giả tuyên bố rằng họ không nhận được bất kỳ hỗ trợ tài chính nào cho nghiên cứu, việc viết bài và/hoặc xuất bản bài báo này.
Các tác giả tuyên bố rằng nghiên cứu được thực hiện mà không có bất kỳ mối quan hệ thương mại hoặc tài chính nào có thể được coi là xung đột lợi ích tiềm tàng. Không áp dụng.
Tất cả các ý kiến được nêu trong bài viết này hoàn toàn là của các tác giả và không nhất thiết phản ánh quan điểm của các tổ chức, nhà xuất bản, biên tập viên hoặc người đánh giá. Bất kỳ sản phẩm nào được đánh giá trong bài viết này, hoặc bất kỳ tuyên bố nào được đưa ra bởi nhà sản xuất của chúng, đều không được nhà xuất bản đảm bảo hoặc chứng thực.
Tài liệu bổ sung cho bài viết này có thể được tìm thấy trực tuyến tại: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Axit propionic gây ra chứng tăng sinh tế bào thần kinh đệm và viêm thần kinh bằng cách điều chỉnh con đường PTEN/AKT trong rối loạn phổ tự kỷ. Báo cáo khoa học 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Phân tích thống kê dữ liệu thành phần. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Tỷ lệ Firmicutes/Bacteroidetes như một yếu tố nguy cơ gây ung thư vú. Tạp chí Y học Lâm sàng, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Phân tích biểu hiện khác biệt của dữ liệu đếm trình tự. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Hệ vi sinh vật trong phân và hệ chuyển hóa ở trẻ em mắc chứng tự kỷ và rối loạn phát triển lan tỏa không được phân loại cụ thể. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Đặc điểm chuyển hóa thần kinh của vi khuẩn đường ruột ở trẻ nhỏ mắc chứng rối loạn phổ tự kỷ. Tạp chí Vi sinh Y học 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Hệ vi sinh vật như một cơ quan của con người. Vi sinh lâm sàng và nhiễm trùng 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Những hiểu biết mới về sinh lý học của vi khuẩn sản sinh axit propionic: Anaerotignum propionicum và Anaerotignum neopropionicum (trước đây là Clostridium propionicum và Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Dinh dưỡng bà mẹ và sự phát triển của thai nhi. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., và Hochberg, J. (1995). Kiểm soát tỷ lệ dương tính giả: Một cách tiếp cận thực tiễn và hiệu quả đối với kiểm định đa biến. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Thời gian đăng bài: 18/04/2025