Các chất chuyển hóa điều hòa miễn dịch là một đặc điểm quan trọng của môi trường vi mô khối u (TME), nhưng ngoại trừ một vài trường hợp, danh tính của chúng vẫn chưa được biết đến rộng rãi. Ở đây, chúng tôi đã phân tích các khối u và tế bào T từ khối u và dịch cổ trướng của bệnh nhân mắc ung thư biểu mô tuyến thanh dịch độ cao (HGSC) để làm sáng tỏ hệ thống chuyển hóa của các ngăn TME khác nhau này. Dịch cổ trướng và tế bào khối u có sự khác biệt đáng kể về chất chuyển hóa. So với dịch cổ trướng, các tế bào T xâm nhập khối u được làm giàu đáng kể 1-methylnicotinamide (MNA). Mặc dù nồng độ MNA trong tế bào T tăng cao, nhưng sự biểu hiện của nicotinamide N-methyltransferase (một enzyme xúc tác quá trình chuyển nhóm methyl từ S-adenosylmethionine sang nicotinamide) chỉ giới hạn ở các nguyên bào sợi và tế bào khối u. Về mặt chức năng, MNA kích thích tế bào T tiết ra cytokine thúc đẩy khối u là yếu tố hoại tử khối u alpha. Do đó, MNA có nguồn gốc từ TME góp phần vào sự điều hòa miễn dịch của tế bào T và đại diện cho một mục tiêu liệu pháp miễn dịch tiềm năng để điều trị ung thư ở người.
Các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ khối u có thể có tác dụng ức chế mạnh mẽ đối với khả năng miễn dịch chống khối u, và ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy chúng cũng có thể đóng vai trò là động lực chính thúc đẩy sự tiến triển của bệnh (1). Bên cạnh hiệu ứng Warburg, các nghiên cứu gần đây đã bắt đầu mô tả trạng thái chuyển hóa của tế bào khối u và mối quan hệ của nó với trạng thái miễn dịch của môi trường vi mô khối u (TME). Các nghiên cứu trên mô hình chuột và tế bào T người đã chỉ ra rằng quá trình chuyển hóa glutamine (2), quá trình chuyển hóa oxy hóa (3) và quá trình chuyển hóa glucose (4) có thể tác động độc lập lên các nhóm tế bào miễn dịch khác nhau. Một số chất chuyển hóa trong các con đường này ức chế chức năng chống khối u của tế bào T. Người ta đã chứng minh rằng việc ngăn chặn coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) có thể làm tổn thương sự tăng sinh của tế bào T, và việc tăng BH4 trong cơ thể có thể tăng cường phản ứng miễn dịch chống khối u do CD4 và CD8 điều hòa. Ngoài ra, tác dụng ức chế miễn dịch của kynurenine có thể được khắc phục bằng cách bổ sung BH4 (5). Trong u nguyên bào thần kinh đệm đột biến isocitrate dehydrogenase (IDH), sự tiết ra enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) ức chế hoạt động kích hoạt, tăng sinh và tiêu hủy tế bào T (6). Gần đây, người ta đã chứng minh rằng methylglyoxal, một sản phẩm phụ của quá trình đường phân, được tạo ra bởi các tế bào ức chế có nguồn gốc từ tủy xương, và việc chuyển methylglyoxal vào tế bào T có thể ức chế chức năng của tế bào T hiệu quả. Trong điều trị, việc trung hòa methylglyoxal có thể khắc phục hoạt động của các tế bào ức chế có nguồn gốc từ tủy xương (MDSC) và tăng cường một cách hiệp đồng liệu pháp phong tỏa điểm kiểm soát trong mô hình chuột (7). Những nghiên cứu này cùng nhau nhấn mạnh vai trò quan trọng của các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ TME trong việc điều chỉnh chức năng và hoạt động của tế bào T.
Rối loạn chức năng tế bào T đã được báo cáo rộng rãi trong ung thư buồng trứng (8). Điều này một phần là do đặc điểm chuyển hóa vốn có trong tình trạng thiếu oxy và mạch máu khối u bất thường (9), dẫn đến việc chuyển đổi glucose và tryptophan thành các sản phẩm phụ như axit lactic và kynurenine. Lactate ngoại bào dư thừa làm giảm sản xuất interferon-γ (IFN-γ) và thúc đẩy sự phân hóa của các nhóm ức chế tủy xương (10, 11). Việc tiêu thụ tryptophan trực tiếp ức chế sự tăng sinh tế bào T và ức chế tín hiệu thụ thể tế bào T (12-14). Mặc dù có những quan sát này, rất nhiều công trình nghiên cứu về chuyển hóa miễn dịch đã được thực hiện trong nuôi cấy tế bào T trong ống nghiệm bằng cách sử dụng môi trường tối ưu hóa, hoặc chỉ giới hạn ở các mô hình chuột đồng loại trong cơ thể sống, cả hai đều không phản ánh đầy đủ tính không đồng nhất của ung thư ở người và môi trường vĩ mô và vi mô sinh lý.
Một đặc điểm chung của ung thư buồng trứng là sự lan rộng phúc mạc và sự xuất hiện của cổ trướng. Sự tích tụ dịch tế bào trong cổ trướng có liên quan đến bệnh tiến triển và tiên lượng xấu (15). Theo các báo cáo, khoang đặc biệt này bị thiếu oxy, có nồng độ cao yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) và indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), và bị xâm nhập bởi các tế bào T điều hòa và các tế bào ức chế tủy (15-18). Môi trường chuyển hóa của cổ trướng có thể khác với môi trường của chính khối u, do đó việc lập trình lại các tế bào T trong khoang phúc mạc vẫn chưa rõ ràng. Ngoài ra, sự khác biệt chính và tính không đồng nhất giữa cổ trướng và các chất chuyển hóa có trong môi trường khối u có thể cản trở sự xâm nhập của các tế bào miễn dịch và chức năng của chúng đối với khối u, và cần nghiên cứu thêm.
Để giải quyết những vấn đề này, chúng tôi đã thiết kế một phương pháp tách tế bào nhạy cảm và sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS) để nghiên cứu các loại tế bào khác nhau (bao gồm tế bào T CD4+ và CD8+) cũng như các chất chuyển hóa trong và giữa các khối u. Chúng tôi sử dụng phương pháp này kết hợp với phân tích tế bào học dòng chảy đa chiều và giải trình tự RNA đơn bào (scRNA-seq) để cung cấp bức tranh chi tiết về tình trạng chuyển hóa của các quần thể quan trọng này. Phương pháp này đã phát hiện sự gia tăng đáng kể nồng độ 1-methylnicotinamide (MNA) trong tế bào T khối u, và các thí nghiệm trong ống nghiệm cho thấy tác dụng điều hòa miễn dịch của MNA đối với chức năng tế bào T trước đây chưa được biết đến. Nhìn chung, phương pháp này tiết lộ sự tương tác chuyển hóa lẫn nhau giữa khối u và tế bào miễn dịch, đồng thời cung cấp những hiểu biết độc đáo về các chất chuyển hóa điều hòa miễn dịch, có thể hữu ích cho việc điều trị ung thư buồng trứng bằng liệu pháp miễn dịch dựa trên tế bào T.
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp đo tế bào dòng chảy đa chiều để định lượng đồng thời sự hấp thụ glucose [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) và hoạt động của ty thể [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) là các dấu hiệu điển hình phân biệt các tế bào miễn dịch và quần thể tế bào khối u (Bảng S2 và Hình S1A). Phân tích này cho thấy so với tế bào T, dịch cổ trướng và tế bào khối u có mức độ hấp thụ glucose cao hơn, nhưng sự khác biệt về hoạt động của ty thể lại nhỏ hơn. Mức hấp thụ glucose trung bình của tế bào khối u [CD45-EpCAM (EpCAM)+] gấp ba đến bốn lần so với tế bào T, và mức hấp thụ glucose trung bình của tế bào T CD4+ gấp 1,2 lần so với tế bào T CD8+, điều này cho thấy các tế bào lympho xâm nhập khối u (TIL) có nhu cầu chuyển hóa khác nhau ngay cả trong cùng một môi trường vi mô khối u (TME) (Hình 1A). Ngược lại, hoạt động ty thể trong tế bào khối u tương tự như hoạt động của tế bào T CD4+, và hoạt động ty thể của cả hai loại tế bào đều cao hơn so với tế bào T CD8+ (Hình 1B). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy mức độ chuyển hóa. Hoạt động chuyển hóa của tế bào khối u cao hơn so với tế bào T CD4+, và hoạt động chuyển hóa của tế bào T CD4+ cao hơn so với tế bào T CD8+. Mặc dù có những tác động này trên các loại tế bào, nhưng không có sự khác biệt nhất quán về trạng thái chuyển hóa của tế bào T CD4+ và CD8+ hoặc tỷ lệ tương đối của chúng trong dịch cổ trướng so với khối u (Hình 1C). Ngược lại, trong phân đoạn tế bào CD45-, tỷ lệ tế bào EpCAM+ trong khối u tăng lên so với dịch cổ trướng (Hình 1D). Chúng tôi cũng quan sát thấy sự khác biệt chuyển hóa rõ ràng giữa các thành phần tế bào EpCAM+ và EpCAM-. Các tế bào EpCAM+ (khối u) có khả năng hấp thụ glucose và hoạt động ty thể cao hơn so với các tế bào EpCAM-, cao hơn nhiều so với hoạt động chuyển hóa của các nguyên bào sợi trong tế bào khối u trong môi trường vi mô khối u (Hình 1, E và F).
(A và B) Cường độ huỳnh quang trung bình (MFI) của sự hấp thụ glucose (2-NBDG) (A) và hoạt động ty thể của tế bào T CD4+ (MitoTracker màu đỏ đậm) (B) Đồ thị đại diện (trái) và dữ liệu được lập bảng (phải), tế bào T CD8+ và tế bào khối u EpCAM+ CD45- từ dịch cổ trướng và khối u. (C) Tỷ lệ tế bào CD4+ và CD8+ (trong số tế bào T CD3+) trong dịch cổ trướng và khối u. (D) Tỷ lệ tế bào khối u EpCAM+ trong dịch cổ trướng và khối u (CD45−). (E và F) Sự hấp thụ glucose (2-NBDG) của khối u EpCAM+ CD45- và chất nền EpCAM-CD45- (E) và hoạt động ty thể (MitoTracker màu đỏ đậm) (F) đồ thị đại diện (trái) và dữ liệu được lập bảng (phải) của dịch cổ trướng và tế bào khối u. (G) Đồ thị đại diện về biểu hiện CD25, CD137 và PD1 bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. (H và I) Biểu hiện CD25, CD137 và PD1 trên tế bào T CD4+ (H) và tế bào T CD8+ (I). (J và K) Kiểu hình tế bào T non, tế bào T nhớ trung tâm (Tcm), tế bào T hiệu quả (Teff) và tế bào T nhớ hiệu quả (Tem) dựa trên biểu hiện của CCR7 và CD45RO. Hình ảnh đại diện (trái) và dữ liệu dạng bảng (phải) của tế bào T CD4+ (J) và tế bào T CD8+ (K) trong dịch cổ trướng và khối u. Giá trị P được xác định bằng phép kiểm định t-test cặp đôi (*P<0,05, **P<0,01 và ***P<0,001). Đường thẳng biểu thị các bệnh nhân được ghép cặp (n = 6). FMO, huỳnh quang trừ một; MFI, cường độ huỳnh quang trung bình.
Phân tích sâu hơn cho thấy những khác biệt đáng kể khác giữa trạng thái kiểu hình tế bào T được phân giải cao. Tế bào T hoạt hóa (Hình 1, G đến I) và tế bào nhớ hiệu quả (Hình 1, J và K) trong khối u xuất hiện thường xuyên hơn nhiều so với dịch cổ trướng (tỷ lệ tế bào T CD3+). Tương tự, phân tích kiểu hình bằng biểu hiện của các dấu ấn hoạt hóa (CD25 và CD137) và dấu ấn suy giảm [protein chết tế bào theo chương trình 1 (PD1)] cho thấy mặc dù đặc điểm chuyển hóa của các quần thể này khác nhau (Hình S1, B đến E), nhưng không có sự khác biệt chuyển hóa đáng kể nào được quan sát thấy một cách nhất quán giữa các phân nhóm tế bào non, tế bào hiệu quả hoặc tế bào nhớ (Hình S1, F đến I). Những kết quả này đã được xác nhận bằng cách sử dụng các phương pháp học máy để tự động gán kiểu hình tế bào (21), điều này càng cho thấy sự hiện diện của một số lượng lớn tế bào tủy xương (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) trong dịch cổ trướng của bệnh nhân (Hình S2A). Trong số tất cả các loại tế bào được xác định, quần thể tế bào tủy này cho thấy khả năng hấp thụ glucose và hoạt động ty thể cao nhất (Hình S2, B đến G). Những kết quả này nhấn mạnh sự khác biệt mạnh mẽ về chuyển hóa giữa nhiều loại tế bào được tìm thấy trong dịch cổ trướng và khối u ở bệnh nhân HGSC.
Thách thức chính trong việc hiểu các đặc điểm chuyển hóa của TIL là cần phải phân lập các mẫu tế bào T có độ tinh khiết, chất lượng và số lượng đủ từ khối u. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các phương pháp phân loại và làm giàu bằng hạt dựa trên cytometry dòng chảy có thể dẫn đến những thay đổi trong hồ sơ chuyển hóa tế bào (22-24). Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi đã tối ưu hóa phương pháp làm giàu bằng hạt để phân lập TIL từ ung thư buồng trứng ở người được phẫu thuật cắt bỏ trước khi phân tích bằng LC-MS/MS (xem Phần Vật liệu và Phương pháp; Hình 2A). Để đánh giá tác động tổng thể của quy trình này đối với những thay đổi về chất chuyển hóa, chúng tôi đã so sánh hồ sơ chuyển hóa của các tế bào T được hoạt hóa bởi những người hiến tặng khỏe mạnh sau bước tách bằng hạt ở trên với các tế bào không được tách bằng hạt mà vẫn được giữ trên đá. Phân tích kiểm soát chất lượng này cho thấy có mối tương quan cao giữa hai điều kiện này (r = 0,77) và độ lặp lại kỹ thuật của nhóm 86 chất chuyển hóa có độ lặp lại cao (Hình 2B). Do đó, các phương pháp này có thể thực hiện phân tích chất chuyển hóa chính xác trong các tế bào trải qua quá trình làm giàu loại tế bào, từ đó cung cấp nền tảng độ phân giải cao đầu tiên để xác định các chất chuyển hóa cụ thể trong HGSC, giúp mọi người hiểu sâu hơn về chương trình chuyển hóa sinh dục đặc hiệu của tế bào.
(A) Sơ đồ quá trình làm giàu bằng hạt từ tính. Trước khi phân tích bằng LC-MS/MS, các tế bào sẽ trải qua ba vòng làm giàu bằng hạt từ tính liên tiếp hoặc được giữ lạnh. (B) Ảnh hưởng của loại làm giàu đến lượng chất chuyển hóa. Giá trị trung bình của ba phép đo cho mỗi loại làm giàu ± sai số chuẩn (SE). Đường màu xám biểu thị mối quan hệ 1:1. Hệ số tương quan nội lớp (ICC) của các phép đo lặp lại được hiển thị trên nhãn trục. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Sơ đồ quy trình phân tích chất chuyển hóa của bệnh nhân. Dịch cổ trướng hoặc khối u được thu thập từ bệnh nhân và đông lạnh. Một phần nhỏ của mỗi mẫu được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy, trong khi các mẫu còn lại trải qua ba vòng làm giàu tế bào CD4+, CD8+ và CD45-. Các phân đoạn tế bào này được phân tích bằng LC-MS/MS. (D) Bản đồ nhiệt về lượng chất chuyển hóa được chuẩn hóa. Biểu đồ cây biểu thị sự phân cụm của Ward dựa trên khoảng cách Euclidean giữa các mẫu. (E) Phân tích thành phần chính (PCA) của bản đồ chất chuyển hóa mẫu, hiển thị ba bản sao của mỗi mẫu, các mẫu từ cùng một bệnh nhân được nối bằng một đường thẳng. (F) PCA của hồ sơ chất chuyển hóa của mẫu được điều kiện hóa theo bệnh nhân (tức là sử dụng sự dư thừa một phần); loại mẫu được giới hạn bởi bao lồi. PC1, thành phần chính 1; PC2, thành phần chính 2.
Tiếp theo, chúng tôi đã áp dụng phương pháp làm giàu này để phân tích 99 chất chuyển hóa trong các phân đoạn tế bào CD4+, CD8+ và CD45- trong dịch cổ trướng và khối u nguyên phát của sáu bệnh nhân HGSC (Hình 2C, Hình S3A và Bảng S3 và S4). Quần thể quan tâm chiếm từ 2% đến 70% mẫu lớn ban đầu gồm các tế bào sống, và tỷ lệ tế bào thay đổi rất nhiều giữa các bệnh nhân. Sau khi tách các hạt, phân đoạn được làm giàu (CD4+, CD8+ hoặc CD45-) chiếm trung bình hơn 85% tổng số tế bào sống trong mẫu. Phương pháp làm giàu này cho phép chúng tôi phân tích quần thể tế bào từ quá trình chuyển hóa mô khối u ở người, điều không thể thực hiện được với các mẫu lớn. Sử dụng quy trình này, chúng tôi đã xác định rằng l-kynurenine và adenosine, hai chất chuyển hóa ức chế miễn dịch đã được xác định rõ, có nồng độ cao trong tế bào T khối u hoặc tế bào khối u (Hình S3, B và C). Do đó, những kết quả này chứng minh tính chính xác và khả năng của công nghệ tách tế bào và quang phổ khối lượng của chúng tôi trong việc tìm kiếm các chất chuyển hóa quan trọng về mặt sinh học trong mô bệnh nhân.
Phân tích của chúng tôi cũng cho thấy sự phân tách chuyển hóa mạnh mẽ giữa các loại tế bào trong và giữa các bệnh nhân (Hình 2D và Hình S4A). Đặc biệt, so với các bệnh nhân khác, bệnh nhân 70 cho thấy các đặc điểm chuyển hóa khác biệt (Hình 2E và Hình S4B), cho thấy có thể có sự không đồng nhất đáng kể về chuyển hóa giữa các bệnh nhân. Điều đáng chú ý là so với các bệnh nhân khác (1,2 đến 2 lít; Bảng S1), tổng lượng dịch cổ trướng thu được ở bệnh nhân 70 (80 ml) ít hơn. Việc kiểm soát sự không đồng nhất giữa các bệnh nhân trong quá trình phân tích thành phần chính (ví dụ, sử dụng phân tích dư thừa một phần) cho thấy những thay đổi nhất quán giữa các loại tế bào, và các loại tế bào và/hoặc môi trường vi mô được tập hợp rõ ràng theo hồ sơ chất chuyển hóa (Hình 2F). Phân tích các chất chuyển hóa đơn lẻ đã nhấn mạnh những tác động này và cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các loại tế bào và môi trường vi mô. Điều đáng chú ý là sự khác biệt rõ rệt nhất được quan sát thấy là MNA, thường được làm giàu trong các tế bào CD45- và trong các tế bào CD4+ và CD8+ xâm nhập vào khối u (Hình 3A). Đối với tế bào CD4+, hiệu ứng này rõ rệt nhất, và MNA trong tế bào CD8+ dường như cũng bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi môi trường. Tuy nhiên, điều này không quan trọng, vì chỉ có ba trong số sáu bệnh nhân có thể được đánh giá điểm số CD8+ khối u. Ngoài MNA, trong các loại tế bào khác nhau trong dịch cổ trướng và khối u, các chất chuyển hóa khác chưa được đặc trưng rõ ràng trong TIL cũng có sự phong phú khác biệt (Hình S3 và S4). Do đó, những dữ liệu này cho thấy một tập hợp các chất chuyển hóa điều hòa miễn dịch đầy hứa hẹn cho nghiên cứu sâu hơn.
(A) Hàm lượng MNA được chuẩn hóa trong các tế bào CD4+, CD8+ và CD45- từ dịch cổ trướng và khối u. Biểu đồ hộp hiển thị giá trị trung vị (đường thẳng), khoảng tứ phân vị (khung bản lề) và phạm vi dữ liệu, lên đến 1,5 lần khoảng tứ phân vị (khung râu). Như đã mô tả trong Vật liệu và Phương pháp của Bệnh nhân, hãy sử dụng giá trị limma của bệnh nhân để xác định giá trị P (*P<0,05 và **P<0,01). (B) Sơ đồ chuyển hóa MNA (60). Các chất chuyển hóa: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Các enzyme (màu xanh lá): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE của scRNA-seq dịch cổ trướng (màu xám) và khối u (màu đỏ; n = 3 bệnh nhân). (D) Biểu hiện NNMT trong các quần thể tế bào khác nhau được xác định bằng scRNA-seq. (E) Biểu hiện của NNMT và AOX1 trong SK-OV-3, tế bào thận phôi người (HEK) 293T, tế bào T và tế bào T được xử lý bằng MNA. Mức độ biểu hiện được thể hiện tương đối so với SK-OV-3. Mẫu biểu hiện với SEM được hiển thị (n = 6 người hiến tặng khỏe mạnh). Giá trị Ct lớn hơn 35 được coi là không thể phát hiện (UD). (F) Biểu hiện của SLC22A1 và SLC22A2 trong tế bào SK-OV-3, HEK293T, tế bào T và tế bào T được xử lý với 8mM MNA. Mức độ biểu hiện được thể hiện tương đối so với SK-OV-3. Mẫu biểu hiện với SEM được hiển thị (n = 6 người hiến tặng khỏe mạnh). Giá trị Ct lớn hơn 35 được coi là không thể phát hiện (UD). (G) Hàm lượng MNA trong tế bào T của người hiến tặng khỏe mạnh được hoạt hóa sau 72 giờ ủ với MNA. Mẫu biểu hiện với SEM được hiển thị (n = 4 người hiến tặng khỏe mạnh).
MNA được tạo ra bằng cách chuyển nhóm methyl từ S-adenosyl-1-methionine (SAM) sang nicotinamide (NA) bởi nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Hình 3B). NNMT được biểu hiện quá mức trong nhiều loại ung thư ở người và có liên quan đến sự tăng sinh, xâm lấn và di căn (25-27). Để hiểu rõ hơn về nguồn gốc của MNA trong tế bào T trong TME, chúng tôi đã sử dụng scRNA-seq để đặc trưng hóa sự biểu hiện của NNMT trên các loại tế bào trong dịch cổ trướng và khối u của ba bệnh nhân HGSC (Bảng S5). Phân tích khoảng 6.500 tế bào cho thấy rằng trong môi trường dịch cổ trướng và khối u, sự biểu hiện của NNMT bị hạn chế ở các quần thể tế bào nguyên bào sợi và tế bào khối u (Hình 3, C và D). Điều đáng chú ý là không có sự biểu hiện NNMT rõ ràng trong bất kỳ quần thể nào biểu hiện PTPRC (CD45 +) (Hình 3D và Hình S5A), điều này cho thấy MNA được phát hiện trong phổ chuyển hóa đã được đưa vào tế bào T. Sự biểu hiện của aldehyde oxidase 1 (AOX1) chuyển đổi MNA thành 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) hoặc 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Hình 3B) cũng bị hạn chế ở quần thể nguyên bào sợi biểu hiện COL1A1 (Hình S5A), điều này cùng nhau cho thấy tế bào T thiếu khả năng chuyển hóa MNA thông thường. Mô hình biểu hiện của các gen liên quan đến MNA này đã được xác minh bằng cách sử dụng bộ dữ liệu tế bào độc lập thứ hai từ dịch cổ trướng của bệnh nhân HGSC (Hình S5B; n = 6) (16). Ngoài ra, phân tích phản ứng chuỗi polymerase định lượng (qPCR) của tế bào T từ người hiến tặng khỏe mạnh được xử lý bằng MNA cho thấy rằng so với tế bào khối u buồng trứng SK-OV-3 đối chứng, NNMT hoặc AOX1 hầu như không được biểu hiện (Hình 3E). Những kết quả bất ngờ này cho thấy MNA có thể được tiết ra từ nguyên bào sợi hoặc khối u vào các tế bào T lân cận trong TME.
Mặc dù các ứng viên bao gồm họ vận chuyển cation hữu cơ 1 đến 3 (OCT1, OCT2 và OCT3) được mã hóa bởi họ chất mang hòa tan 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 và SLC22A3), nhưng các chất vận chuyển tiềm năng của MNA vẫn chưa được xác định (28). QPCR của mRNA từ tế bào T của người hiến tặng khỏe mạnh cho thấy mức độ biểu hiện thấp của SLC22A1 nhưng mức độ không thể phát hiện được của SLC22A2, điều này xác nhận rằng nó đã được báo cáo trước đó trong tài liệu (Hình 3F) (29). Ngược lại, dòng tế bào khối u buồng trứng SK-OV-3 biểu hiện mức độ cao của cả hai chất vận chuyển (Hình 3F).
Để kiểm tra khả năng tế bào T có thể hấp thụ MNA ngoại lai, các tế bào T từ người hiến tặng khỏe mạnh đã được nuôi cấy trong 72 giờ với sự hiện diện của các nồng độ MNA khác nhau. Khi không có MNA ngoại sinh, hàm lượng MNA trong tế bào không thể được phát hiện (Hình 3G). Tuy nhiên, các tế bào T được hoạt hóa và xử lý bằng MNA ngoại sinh cho thấy sự gia tăng hàm lượng MNA trong tế bào theo liều lượng, lên đến 6 mM MNA (Hình 3G). Kết quả này cho thấy rằng mặc dù mức độ biểu hiện chất vận chuyển thấp và thiếu enzyme chính chịu trách nhiệm chuyển hóa MNA nội bào, TIL vẫn có thể hấp thụ MNA.
Phổ chuyển hóa trong tế bào T của bệnh nhân và các thí nghiệm hấp thụ MNA trong ống nghiệm làm tăng khả năng các nguyên bào sợi liên quan đến ung thư (CAF) tiết ra MNA và tế bào khối u có thể điều chỉnh kiểu hình và chức năng của TIL. Để xác định tác dụng của MNA lên tế bào T, tế bào T của người hiến tặng khỏe mạnh được hoạt hóa trong ống nghiệm khi có hoặc không có MNA, và sự tăng sinh cũng như sản xuất cytokine của chúng được đánh giá. Sau 7 ngày bổ sung MNA ở liều cao nhất, số lần nhân đôi quần thể giảm vừa phải, trong khi sức sống được duy trì ở tất cả các liều (Hình 4A). Ngoài ra, điều trị bằng MNA ngoại sinh dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ tế bào T CD4+ và CD8+ biểu hiện yếu tố hoại tử khối u-α (TNFα; Hình 4B). Ngược lại, sản xuất IFN-γ nội bào giảm đáng kể ở tế bào T CD4+, nhưng không giảm ở tế bào T CD8+, và không có sự thay đổi đáng kể nào về interleukin 2 (IL-2; Hình 4, C và D). Do đó, xét nghiệm ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) trên dịch nổi từ các nuôi cấy tế bào T được xử lý bằng MNA cho thấy sự gia tăng đáng kể TNFα, giảm IFN-γ và không thay đổi IL-2 (Hình 4, E đến G). Sự giảm IFN-γ cho thấy MNA có thể đóng vai trò ức chế hoạt động chống khối u của tế bào T. Để mô phỏng tác dụng của MNA đối với độc tính tế bào do tế bào T trung gian, tế bào T mang thụ thể kháng nguyên chimeric (FRα-CAR-T) nhắm mục tiêu vào thụ thể folate α và tế bào CAR-T (GFP) được điều hòa bởi protein huỳnh quang xanh (GFP) -CAR-T được tạo ra từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) của người hiến tặng khỏe mạnh. Tế bào CAR-T được nuôi cấy trong 24 giờ với sự có mặt của MNA, sau đó được nuôi cấy đồng thời với tế bào khối u buồng trứng SK-OV-3 của người biểu hiện thụ thể folate α với tỷ lệ tế bào hiệu ứng/tế bào đích là 10:1. Điều trị bằng MNA dẫn đến giảm đáng kể hoạt động tiêu diệt của tế bào FRα-CAR-T, tương tự như tế bào FRα-CAR-T được điều trị bằng adenosine (Hình 4H).
(A) Tổng số tế bào sống và sự nhân đôi quần thể (PD) trực tiếp từ nuôi cấy vào ngày thứ 7. Biểu đồ cột thể hiện giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SEM) của sáu người hiến tặng khỏe mạnh. Biểu thị dữ liệu từ ít nhất n = 3 thí nghiệm độc lập. (B đến D) CD3/CD28 và IL-2 được sử dụng để hoạt hóa tế bào T ở nồng độ MNA tương ứng trong 7 ngày. Trước khi phân tích, các tế bào được kích thích bằng PMA/ionomycin với GolgiStop trong 4 giờ. Biểu hiện TNFα (B) trong tế bào T. Hình ảnh ví dụ (trái) và dữ liệu dạng bảng (phải) về biểu hiện TNFα trong tế bào sống. Biểu hiện IFN-γ (C) và IL-2 (D) trong tế bào T. Sự biểu hiện của cytokine được đo bằng phương pháp cytometry dòng chảy. Biểu đồ cột thể hiện giá trị trung bình (n = 6 người hiến tặng khỏe mạnh) ± SEM. Sử dụng phân tích phương sai một chiều và phép đo lặp lại (*P<0,05 và **P<0,01) để xác định giá trị P. Biểu thị dữ liệu từ ít nhất n = 3 thí nghiệm độc lập. (E đến G) CD3/CD28 và IL-2 được sử dụng để hoạt hóa tế bào T ở nồng độ MNA tương ứng trong 7 ngày. Môi trường nuôi cấy được thu thập trước và sau 4 giờ kích thích bằng PMA/ionomycin. Nồng độ TNFα (E), IFN-γ (F) và IL-2 (G) được đo bằng ELISA. Biểu đồ cột biểu thị giá trị trung bình (n = 5 người hiến tặng khỏe mạnh) ± SEM. Giá trị P được xác định bằng phân tích phương sai một chiều và phép đo lặp lại (*P<0,05). Đường chấm chấm biểu thị giới hạn phát hiện. (H) Thử nghiệm ly giải tế bào. Tế bào FRα-CAR-T hoặc GFP-CAR-T được điều chỉnh bằng adenosine (250μM) hoặc MNA (10 mM) trong 24 giờ, hoặc không được xử lý (Ctrl). Tỷ lệ tiêu diệt tế bào SK-OV-3 được đo. Giá trị P được xác định bằng phép thử t của Welch (*P<0,5 và **P<0,01).
Để hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa biểu hiện TNFα phụ thuộc MNA, sự thay đổi mRNA TNFα của tế bào T được xử lý bằng MNA đã được đánh giá (Hình 5A). Tế bào T của người hiến tặng khỏe mạnh được xử lý bằng MNA cho thấy mức độ phiên mã TNFα tăng gấp đôi, cho thấy MNA phụ thuộc vào sự điều hòa phiên mã TNFα. Để điều tra cơ chế điều hòa có thể này, hai yếu tố phiên mã đã biết điều hòa TNFα, cụ thể là yếu tố hạt nhân tế bào T hoạt hóa (NFAT) và protein đặc hiệu 1 (Sp1), đã được đánh giá khi phản ứng với sự liên kết của MNA với vùng khởi động TNFα gần đó (30). Vùng khởi động TNFα chứa 6 vị trí liên kết NFAT đã được xác định và 2 vị trí liên kết Sp1, chồng chéo tại một vị trí [-55 cặp bazơ (bp) từ 5'cap] (30). Phương pháp miễn dịch kết tủa chromatin (ChIP) cho thấy khi được xử lý bằng MNA, sự liên kết của Sp1 với vùng khởi động TNFα tăng gấp ba lần. Sự kết hợp của NFAT cũng tăng lên và trở nên quan trọng (Hình 5B). Dữ liệu này cho thấy MNA điều chỉnh sự biểu hiện của TNFα thông qua quá trình phiên mã Sp1, và ở mức độ thấp hơn là sự biểu hiện của NFAT.
(A) So với tế bào T được nuôi cấy không có MNA, sự thay đổi gấp bội của biểu hiện TNFα trong tế bào T được xử lý bằng MNA được thể hiện. Mẫu biểu hiện với SEM được hiển thị (n = 5 người hiến tặng khỏe mạnh). Đại diện cho dữ liệu từ ít nhất n = 3 thí nghiệm độc lập. (B) Vùng promoter TNFα của tế bào T được xử lý có hoặc không có 8 mM MNA sau khi NFAT và Sp1 được kết hợp với (Ctrl) và kích thích PMA/ionomycin trong 4 giờ. Globulin miễn dịch G (IgG) và H3 được sử dụng làm đối chứng âm và dương cho quá trình kết tủa miễn dịch, tương ứng. Định lượng ChIP cho thấy sự gắn kết của Sp1 và NFAT với vùng promoter TNFα trong các tế bào được xử lý bằng MNA tăng lên nhiều lần so với nhóm đối chứng. Đại diện cho dữ liệu từ ít nhất n = 3 thí nghiệm độc lập. Giá trị P được xác định bằng nhiều phép thử t (*** P <0,01). (C) So với dịch cổ trướng của HGSC, tế bào T (không gây độc tế bào) cho thấy sự biểu hiện TNF tăng lên trong khối u. Các màu sắc đại diện cho các bệnh nhân khác nhau. Các ô được hiển thị đã được lấy mẫu ngẫu nhiên thành 300 và được làm nhiễu để hạn chế vẽ quá mức (** Padj = 0,0076). (D) Mô hình đề xuất của MNA cho ung thư buồng trứng. MNA được sản xuất trong các tế bào khối u và nguyên bào sợi trong TME và được các tế bào T hấp thụ. MNA làm tăng sự gắn kết của Sp1 với chất xúc tiến TNFα, dẫn đến tăng cường phiên mã TNFα và sản xuất cytokine TNFα. MNA cũng gây ra sự giảm IFN-γ. Ức chế chức năng tế bào T dẫn đến giảm khả năng tiêu diệt và tăng tốc độ phát triển khối u.
Theo các báo cáo, TNFα có tác dụng chống khối u và ức chế khối u phụ thuộc vào phía trước và phía sau, nhưng nó có vai trò nổi tiếng trong việc thúc đẩy sự phát triển và di căn của ung thư buồng trứng (31-33). Theo các báo cáo, nồng độ TNFα trong dịch cổ trướng và mô khối u ở bệnh nhân ung thư buồng trứng cao hơn so với mô lành tính (34-36). Về cơ chế, TNFα có thể điều chỉnh sự hoạt hóa, chức năng và sự tăng sinh của bạch cầu, và thay đổi kiểu hình của tế bào ung thư (37, 38). Phù hợp với những phát hiện này, phân tích biểu hiện gen khác biệt cho thấy TNF được điều chỉnh tăng đáng kể trong tế bào T ở mô khối u so với dịch cổ trướng (Hình 5C). Sự gia tăng biểu hiện TNF chỉ rõ ràng ở quần thể tế bào T có kiểu hình không gây độc tế bào (Hình S5A). Tóm lại, những dữ liệu này ủng hộ quan điểm rằng MNA có tác dụng kép ức chế miễn dịch và thúc đẩy khối u trong HGSC.
Phương pháp đánh dấu huỳnh quang dựa trên đo lưu lượng tế bào đã trở thành phương pháp chính để nghiên cứu quá trình chuyển hóa của TIL. Các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng so với tế bào lympho máu ngoại vi hoặc tế bào T từ các cơ quan bạch huyết thứ cấp, TIL ở chuột và người có xu hướng hấp thụ glucose cao hơn (4, 39) và mất dần chức năng ty thể (19, 40). Mặc dù chúng tôi đã quan sát thấy kết quả tương tự trong nghiên cứu này, nhưng điểm phát triển quan trọng là so sánh quá trình chuyển hóa của tế bào khối u và TIL từ cùng một mô khối u đã được cắt bỏ. Phù hợp với một số báo cáo trước đây, tế bào khối u (CD45-EpCAM +) từ dịch cổ trướng và khối u có khả năng hấp thụ glucose cao hơn so với tế bào T CD8 + và CD4 +, hỗ trợ cho khái niệm cạnh tranh tế bào T trong môi trường vi mô khối u (TME). Tuy nhiên, hoạt động ty thể của tế bào khối u cao hơn so với tế bào T CD8 +, nhưng hoạt động ty thể tương tự như tế bào T CD4 +. Những kết quả này củng cố chủ đề đang nổi lên rằng quá trình chuyển hóa oxy hóa rất quan trọng đối với tế bào khối u (41, 42). Họ cũng cho rằng tế bào T CD8+ có thể dễ bị rối loạn chức năng oxy hóa hơn tế bào T CD4+, hoặc tế bào T CD4+ có thể sử dụng các nguồn carbon khác ngoài glucose để duy trì hoạt động của ty thể (43, 44). Cần lưu ý rằng chúng tôi không quan sát thấy sự khác biệt về hấp thụ glucose hoặc hoạt động của ty thể giữa tế bào T CD4+ hiệu quả, tế bào T nhớ hiệu quả và tế bào T nhớ trung tâm trong dịch cổ trướng. Tương tự, trạng thái biệt hóa của tế bào T CD8+ trong khối u không liên quan đến sự thay đổi trong hấp thụ glucose, làm nổi bật sự khác biệt đáng kể giữa tế bào T được nuôi cấy trong ống nghiệm và TIL người trong cơ thể sống (22). Những quan sát này cũng được xác nhận bằng cách sử dụng phân bổ quần thể tế bào tự động không thiên vị, điều này cho thấy thêm rằng các tế bào CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ có khả năng hấp thụ glucose và hoạt động ty thể cao hơn tế bào khối u phổ biến hơn nhưng có quần thể tế bào hoạt động chuyển hóa. Quần thể này có thể đại diện cho quần thể phụ giả định của tế bào ức chế tủy hoặc tế bào dendritic dạng tương bào được xác định trong phân tích scRNA-seq. Mặc dù cả hai đều đã được báo cáo trong các khối u buồng trứng ở người [45], nhưng vẫn cần nghiên cứu thêm để mô tả quần thể tế bào tủy này.
Mặc dù các phương pháp dựa trên đo lưu lượng tế bào có thể làm rõ sự khác biệt chung về chuyển hóa glucose và oxy hóa giữa các loại tế bào, nhưng các chất chuyển hóa chính xác được tạo ra bởi glucose hoặc các nguồn carbon khác cho quá trình chuyển hóa ty thể trong TME vẫn chưa được xác định. Việc xác định sự hiện diện hoặc vắng mặt của các chất chuyển hóa đối với một tập hợp con TIL nhất định đòi hỏi phải tinh chế quần thể tế bào từ mô đã được cắt bỏ. Do đó, phương pháp làm giàu tế bào của chúng tôi kết hợp với phép đo khối phổ có thể cung cấp thông tin chi tiết về các chất chuyển hóa được làm giàu khác biệt trong tế bào T và quần thể tế bào khối u trong các mẫu bệnh nhân phù hợp. Mặc dù phương pháp này có ưu điểm hơn so với phân loại tế bào kích hoạt huỳnh quang, nhưng một số thư viện chất chuyển hóa có thể bị ảnh hưởng do tính ổn định vốn có và/hoặc tốc độ chuyển hóa nhanh (22). Tuy nhiên, phương pháp của chúng tôi đã có thể xác định được hai chất chuyển hóa ức chế miễn dịch được công nhận, adenosine và kynurenine, vì chúng thay đổi rất nhiều giữa các loại mẫu.
Phân tích chuyển hóa của chúng tôi về các khối u và các phân nhóm TIL cung cấp thêm thông tin chi tiết về vai trò của các chất chuyển hóa trong môi trường vi mô khối u buồng trứng. Đầu tiên, bằng cách sử dụng phương pháp đo tế bào dòng chảy, chúng tôi xác định rằng không có sự khác biệt về hoạt động của ty thể giữa các khối u và tế bào T CD4+. Tuy nhiên, phân tích LC-MS/MS cho thấy những thay đổi đáng kể về lượng chất chuyển hóa giữa các quần thể này, cho thấy rằng các kết luận về chuyển hóa TIL và hoạt động chuyển hóa tổng thể của nó cần được giải thích cẩn thận. Thứ hai, MNA là chất chuyển hóa có sự khác biệt lớn nhất giữa tế bào CD45 và tế bào T trong dịch cổ trướng, chứ không phải trong khối u. Do đó, sự phân vùng và vị trí khối u có thể có những tác động khác nhau đến chuyển hóa TIL, điều này làm nổi bật tính không đồng nhất có thể có trong một môi trường vi mô nhất định. Thứ ba, sự biểu hiện của enzyme sản xuất MNA NNMT chủ yếu giới hạn ở CAF, ở mức độ ít hơn là ở các tế bào khối u, nhưng mức MNA có thể phát hiện được quan sát thấy ở các tế bào T có nguồn gốc từ khối u. Sự biểu hiện quá mức của NNMT trong CAF buồng trứng có tác dụng thúc đẩy ung thư đã biết, một phần là do thúc đẩy chuyển hóa CAF, xâm lấn khối u và di căn (27). Mặc dù mức độ TIL tổng thể ở mức trung bình, nhưng sự biểu hiện của NNMT trong CAF có liên quan chặt chẽ đến phân nhóm trung mô của Dự án Bản đồ Gen Ung thư (TCGA), vốn liên quan đến tiên lượng xấu (27, 46, 47). Cuối cùng, sự biểu hiện của enzyme AOX1 chịu trách nhiệm phân hủy MNA cũng chỉ giới hạn ở quần thể CAF, điều này cho thấy tế bào T thiếu khả năng chuyển hóa MNA. Những kết quả này ủng hộ ý tưởng rằng mặc dù cần nghiên cứu thêm để xác minh phát hiện này, nhưng nồng độ MNA cao trong tế bào T có thể cho thấy sự hiện diện của môi trường vi mô CAF ức chế miễn dịch.
Với mức độ biểu hiện thấp của các chất vận chuyển MNA và mức độ không thể phát hiện được của các protein chủ chốt liên quan đến quá trình chuyển hóa MNA, sự hiện diện của MNA trong tế bào T là điều không ngờ tới. Cả NNMT và AOX1 đều không thể được phát hiện bằng phân tích scRNA-seq và qPCR nhắm mục tiêu trên hai nhóm đối tượng độc lập. Những kết quả này cho thấy MNA không được tổng hợp bởi tế bào T, mà được hấp thụ từ môi trường vi mô khối u xung quanh. Các thí nghiệm trong ống nghiệm cho thấy tế bào T có xu hướng tích lũy MNA ngoại sinh.
Các nghiên cứu trong ống nghiệm của chúng tôi đã chỉ ra rằng MNA ngoại sinh gây ra sự biểu hiện của TNFα trong tế bào T và tăng cường sự gắn kết của Sp1 với chất xúc tiến TNFα. Mặc dù TNFα có cả chức năng chống khối u và ức chế khối u, nhưng trong ung thư buồng trứng, TNFα có thể thúc đẩy sự phát triển của ung thư buồng trứng (31-33). Việc trung hòa TNFα trong nuôi cấy tế bào khối u buồng trứng hoặc loại bỏ tín hiệu TNFα trong mô hình chuột có thể cải thiện sản xuất cytokine gây viêm do TNFα và ức chế sự phát triển của khối u (32, 35). Do đó, trong trường hợp này, MNA có nguồn gốc từ TME có thể hoạt động như một chất chuyển hóa gây viêm thông qua cơ chế phụ thuộc TNFα thông qua vòng tự tiết, do đó thúc đẩy sự xuất hiện và lan rộng của ung thư buồng trứng (31). Dựa trên khả năng này, việc ngăn chặn TNFα đang được nghiên cứu như một tác nhân điều trị tiềm năng cho ung thư buồng trứng (37, 48, 49). Ngoài ra, MNA làm suy giảm độc tính của tế bào CAR-T đối với tế bào khối u buồng trứng, cung cấp thêm bằng chứng cho thấy sự ức chế miễn dịch do MNA gây ra. Nhìn chung, những kết quả này cho thấy một mô hình trong đó các khối u và tế bào CAF tiết ra MNA vào môi trường vi mô khối u ngoại bào. Thông qua (i) sự kích thích tăng trưởng ung thư buồng trứng do TNF gây ra và (ii) sự ức chế hoạt động gây độc tế bào T do MNA gây ra, điều này có thể có tác động kép lên khối u (Hình 5D).
Tóm lại, bằng cách kết hợp phương pháp làm giàu tế bào nhanh, giải trình tự tế bào đơn và phân tích chuyển hóa, nghiên cứu này đã tiết lộ sự khác biệt lớn về miễn dịch chuyển hóa giữa tế bào khối u và tế bào dịch cổ trướng ở bệnh nhân HGSC. Phân tích toàn diện này cho thấy có sự khác biệt về hấp thụ glucose và hoạt động ty thể giữa các tế bào T, và xác định MNA là chất chuyển hóa điều hòa miễn dịch không phụ thuộc vào tế bào. Những dữ liệu này có tác động đến cách môi trường vi mô khối u (TME) ảnh hưởng đến chuyển hóa tế bào T trong ung thư ở người. Mặc dù sự cạnh tranh trực tiếp về chất dinh dưỡng giữa tế bào T và tế bào ung thư đã được báo cáo, các chất chuyển hóa cũng có thể hoạt động như các chất điều hòa gián tiếp để thúc đẩy sự tiến triển của khối u và có thể ức chế các phản ứng miễn dịch nội sinh. Việc mô tả sâu hơn vai trò chức năng của các chất chuyển hóa điều hòa này có thể mở ra các chiến lược thay thế để tăng cường phản ứng miễn dịch chống khối u.
Các mẫu bệnh phẩm và dữ liệu lâm sàng được thu thập thông qua kho lưu trữ mô khối u ung thư BC được chứng nhận bởi Mạng lưới Kho lưu trữ Mô Canada. Theo quy trình được Ủy ban Đạo đức Nghiên cứu Ung thư BC và Đại học British Columbia phê duyệt (H07-00463), tất cả các mẫu bệnh phẩm và dữ liệu lâm sàng của bệnh nhân đều được sự đồng ý bằng văn bản hoặc tự nguyện từ bỏ quyền đồng ý. Các mẫu được lưu trữ trong Ngân hàng Sinh học được chứng nhận (BRC-00290). Đặc điểm chi tiết của bệnh nhân được trình bày trong Bảng S1 và S5. Để bảo quản lạnh, một dao mổ được sử dụng để phân hủy cơ học mẫu khối u của bệnh nhân và sau đó lọc qua màng lọc 100 micron để thu được huyền dịch tế bào đơn. Dịch cổ trướng của bệnh nhân được ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để tạo thành khối tế bào và loại bỏ dịch nổi. Các tế bào thu được từ khối u và dịch cổ trướng được bảo quản đông lạnh trong hỗn hợp gồm 50% huyết thanh AB người bất hoạt bằng nhiệt (Sigma-Aldrich), 40% môi trường RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) và 10% dimethyl sulfoxide. Các huyền dịch tế bào đơn được bảo quản này sau đó được rã đông và sử dụng cho phân tích chuyển hóa và xác định chất chuyển hóa như mô tả bên dưới.
Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh bao gồm RPMI 1640 và AimV được bổ sung theo tỷ lệ 50:50, đã được lọc qua màng lọc 0,22 μm. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) được bổ sung 10% huyết thanh AB người bất hoạt bằng nhiệt (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific), 1 x dung dịch Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) và 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) được bổ sung 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) và 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Dung dịch nhuộm cho máy đo tế bào dòng chảy bao gồm dung dịch muối đệm phosphat (PBS; Invitrogen) đã được lọc qua màng lọc 0,22 μm, bổ sung thêm 3% huyết thanh người nhóm AB đã bất hoạt bằng nhiệt (Sigma). Dung dịch làm giàu tế bào bao gồm PBS đã được lọc qua màng lọc 0,22 μm và bổ sung thêm 0,5% huyết thanh người nhóm AB đã bất hoạt bằng nhiệt (Sigma-Aldrich).
Trong môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh ở 37°C, tế bào được nhuộm với 10 nM MT DR và ​​100 μM 2-NBDG trong 30 phút. Tiếp theo, tế bào được nhuộm với thuốc nhuộm khả năng sống eF506 ở 4°C trong 15 phút. Hòa tan lại tế bào trong FC Block (eBioscience) và Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), pha loãng trong dung dịch đệm nhuộm tế bào dòng chảy (theo hướng dẫn của nhà sản xuất), và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Nhuộm tế bào với một bộ kháng thể (Bảng S2) trong dung dịch đệm nhuộm tế bào dòng chảy ở 4°C trong 20 phút. Hòa tan lại tế bào trong dung dịch đệm nhuộm tế bào dòng chảy (Cytek Aurora; cấu hình 3L-16V-14B-8R) trước khi phân tích. Sử dụng SpectroFlo và FlowJo V10 để phân tích dữ liệu đếm tế bào, và sử dụng GraphPad Prism 8 để tạo dữ liệu. Cường độ huỳnh quang trung vị (MFI) của 2-NBDG và MT DR được chuẩn hóa theo logarit, sau đó sử dụng phép kiểm định t cặp đôi để phân tích thống kê nhằm tính đến các bệnh nhân được ghép cặp. Loại bỏ tất cả các quần thể có ít hơn 40 sự kiện khỏi phân tích; nhập giá trị MFI bằng 1 cho bất kỳ giá trị âm nào trước khi thực hiện phân tích thống kê và trực quan hóa dữ liệu.
Để bổ sung cho chiến lược phân loại thủ công của bảng quy trình trên, chúng tôi đã sử dụng chú thích đầy đủ bằng cây hạn chế hình dạng (FAUST) (21) để tự động gán tế bào vào quần thể sau khi loại bỏ các tế bào chết trong FlowJo. Chúng tôi quản lý thủ công đầu ra để hợp nhất các quần thể dường như bị phân bổ sai (kết hợp các tế bào khối u PD1+ với PD1-) và các quần thể được giữ lại. Mỗi mẫu chứa trung bình hơn 2% tế bào, tổng cộng là 11 quần thể.
Phương pháp ly tâm phân tách theo gradient mật độ Ficoll được sử dụng để tách tế bào PBMC khỏi các sản phẩm tách bạch cầu (STEMCELL Technologies). Tế bào T CD8+ được phân lập từ PBMC bằng cách sử dụng hạt vi cầu CD8 (Miltenyi) và được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường hoàn chỉnh bằng TransAct (Miltenyi) trong 2 tuần theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các tế bào được để yên trong 5 ngày trong môi trường hoàn chỉnh có chứa IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), sau đó được kích thích lại bằng TransAct. Vào ngày thứ 7, theo hướng dẫn của nhà sản xuất, hạt vi cầu CD45 người (Miltenyi) được sử dụng để làm giàu tế bào trong ba vòng liên tiếp. Các tế bào được chia nhỏ để phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy (như mô tả ở trên), và một triệu tế bào được chia nhỏ ba lần để phân tích LC-MS/MS. Các mẫu được xử lý bằng LC-MS/MS như mô tả bên dưới. Chúng tôi ước tính giá trị chất chuyển hóa bị thiếu với số ion là 1.000. Mỗi mẫu được chuẩn hóa theo tổng số ion (TIC), chuyển đổi theo logarit và tự động chuẩn hóa trong MetaboAnalystR trước khi phân tích.
Dịch huyền phù tế bào đơn của mỗi bệnh nhân được rã đông và lọc qua màng lọc 40 μm vào môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (như mô tả ở trên). Theo quy trình của nhà sản xuất, ba vòng chọn lọc dương tính liên tiếp bằng phương pháp tách hạt từ tính sử dụng MicroBeads (Miltenyi) được sử dụng để làm giàu mẫu tế bào CD8+, CD4+ và CD45- (trên đá). Tóm lại, các tế bào được huyền phù lại trong dung dịch đệm làm giàu tế bào (như mô tả ở trên) và đếm số lượng. Các tế bào được ủ với hạt CD8 người, hạt CD4 người hoặc hạt CD45 người (Miltenyi) ở 4°C trong 15 phút, sau đó rửa bằng dung dịch đệm làm giàu tế bào. Mẫu được cho đi qua cột LS (Miltenyi), và các phần dương tính và âm tính được thu thập. Để giảm thời gian và tối đa hóa bước thu hồi tế bào, phần CD8- sau đó được sử dụng cho vòng làm giàu CD4+ thứ hai, và phần CD4- được sử dụng cho quá trình làm giàu CD45- tiếp theo. Giữ dung dịch trên đá trong suốt quá trình tách.
Để chuẩn bị mẫu phân tích chất chuyển hóa, tế bào được rửa một lần bằng dung dịch muối lạnh, sau đó thêm 1 ml methanol 80% vào mỗi mẫu, khuấy đều và đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng. Các mẫu được thực hiện ba chu kỳ đông lạnh-tan chảy và ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Phần dịch nổi chứa chất chuyển hóa được làm bay hơi cho đến khi khô. Chất chuyển hóa được hòa tan lại trong 50 μl axit formic 0,03%, khuấy đều để trộn, sau đó ly tâm để loại bỏ cặn.
Chiết xuất các chất chuyển hóa như mô tả ở trên. Chuyển dịch nổi sang bình sắc ký lỏng hiệu năng cao để nghiên cứu chuyển hóa học. Sử dụng quy trình xử lý ngẫu nhiên để xử lý mỗi mẫu với số lượng tế bào tương tự nhằm ngăn ngừa ảnh hưởng của lô. Chúng tôi đã thực hiện đánh giá định tính các chất chuyển hóa toàn cầu đã được công bố trước đây trên máy quang phổ khối tứ cực ba lần AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Phân tích sắc ký và tích hợp diện tích đỉnh được thực hiện bằng phần mềm MultiQuant phiên bản 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Số lượng ion là 1000 được sử dụng để ước tính giá trị chất chuyển hóa bị thiếu, và TIC của mỗi mẫu được sử dụng để tính diện tích đỉnh được chuẩn hóa của mỗi chất chuyển hóa được phát hiện nhằm hiệu chỉnh các thay đổi do phân tích dụng cụ từ quá trình xử lý mẫu gây ra. Sau khi TIC được chuẩn hóa, MetaboAnalystR(51) (tham số mặc định) được sử dụng để chuyển đổi logarit và tự động điều chỉnh tỷ lệ đường chuẩn. Chúng tôi đã sử dụng PCA với gói vegan R để thực hiện phân tích thăm dò sự khác biệt về chuyển hóa giữa các loại mẫu và sử dụng phân tích dư thừa một phần để phân tích bệnh nhân. Sử dụng phương pháp Ward để xây dựng biểu đồ cây bản đồ nhiệt để phân cụm khoảng cách Euclidean giữa các mẫu. Chúng tôi đã sử dụng limma (52) trên độ phong phú chất chuyển hóa được chuẩn hóa để xác định các chất chuyển hóa phong phú khác nhau trên toàn bộ loại tế bào và môi trường vi mô. Để đơn giản hóa giải thích, chúng tôi sử dụng tham số trung bình nhóm để chỉ định mô hình và coi các loại tế bào trong môi trường vi mô là mỗi nhóm (n = 6 nhóm); Để kiểm định ý nghĩa thống kê, chúng tôi đã thực hiện ba lần đo lặp lại cho mỗi chất chuyển hóa. Để tránh sai sót do sao chép, bệnh nhân được đưa vào như một trở ngại trong thiết kế limma. Để kiểm tra sự khác biệt về chất chuyển hóa giữa các bệnh nhân khác nhau, chúng tôi đã điều chỉnh mô hình limma bao gồm các bệnh nhân theo cách cố định. Chúng tôi báo cáo ý nghĩa thống kê của sự tương phản được xác định trước giữa loại tế bào và môi trường vi mô với Padj <0,05 (hiệu chỉnh Benjamini-Hochberg).
Sau khi làm giàu tế bào sống bằng Bộ dụng cụ loại bỏ tế bào chết Miltenyi (>80% khả năng sống), quá trình giải trình tự transcriptome tế bào đơn được thực hiện trên toàn bộ mẫu dịch cổ trướng và khối u đông lạnh còn sống bằng giao thức biểu hiện gen 5′ 10x. Năm trường hợp có khối u và dịch cổ trướng trùng khớp đã được phân tích, mặc dù khả năng sống thấp của một mẫu khối u đã ngăn cản việc đưa nó vào. Để có được nhiều lựa chọn bệnh nhân, chúng tôi đã kết hợp các mẫu của mỗi bệnh nhân trong các làn của bộ điều khiển crom 10x và phân tích dịch cổ trướng và vị trí khối u riêng biệt. Sau khi giải trình tự [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ghép cặp đầu cuối (PE), bộ gen Quebec; trung bình 73.488 và 41.378 lượt đọc trên mỗi tế bào cho khối u và dịch cổ trướng tương ứng]], chúng tôi đã sử dụng CellSNP và Vireo (53) (dựa trên CellSNP là SNP phổ biến của con người (VCF) do GRCh38 cung cấp được gán danh tính người hiến tặng. Chúng tôi sử dụng SNPRelate để suy ra danh tính gần nhất (IBS) của tình trạng kiểu gen của bệnh nhân (IBS), loại trừ các tế bào chưa được gán và các tế bào được xác định là tế bào kép và người hiến tặng phù hợp giữa các mẫu dịch cổ trướng và khối u (54). Dựa trên nhiệm vụ này, chúng tôi đã giữ lại ba trường hợp có số lượng tế bào dồi dào trong khối u và dịch cổ trướng để phân tích tiếp theo. Sau khi thực hiện bước lọc hàng loạt trong gói BioConductor scater (55) và scran (56), kết quả thu được 6975 tế bào (2792 và 4183 tế bào từ khối u và dịch cổ trướng, tương ứng) để phân tích. Chúng tôi sử dụng phân cụm Louvain của igraph (57) của mạng lưới lân cận gần nhất được chia sẻ (SNN) dựa trên khoảng cách Jaccard để phân cụm tế bào theo biểu hiện. Các cụm được chú thích thủ công thành các loại tế bào giả định dựa trên biểu hiện gen đánh dấu và được hiển thị bằng t-SNE. Tế bào T gây độc được xác định bằng biểu hiện của CD8A và GZMA, loại trừ các cụm con có biểu hiện protein ribosome thấp. Chúng tôi đã truy cập dữ liệu đã được công bố của Izar et al. (16), bao gồm cả việc nhúng t-SNE của họ, có thể kiểm soát sự chồng chéo biểu hiện giữa các dấu hiệu tế bào miễn dịch và biểu hiện NNMT.
Tế bào PBMC được tách từ sản phẩm phân tách bạch cầu (STEMCELL Technologies) bằng phương pháp ly tâm phân tách theo gradient mật độ Ficoll. Tế bào CD3+ được phân lập từ PBMC bằng cách sử dụng hạt CD3 (Miltenyi). Có hoặc không có MNA, tế bào CD3+ được hoạt hóa bằng CD3 gắn trên đĩa (5μg/ml), CD28 hòa tan (3μg/ml) và IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Vào ngày cuối cùng của quá trình tăng sinh, khả năng sống sót (Thuốc nhuộm khả năng sống sót cố định eFluor450, eBioscience) và sự tăng sinh (123 hạt eBeads, Thermo Fisher Scientific) được đánh giá bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Đánh giá chức năng hiệu quả bằng cách kích thích tế bào với PMA (20 ng/ml) và ionomycin (1 μg/ml) cùng với GolgiStop trong 4 giờ, và theo dõi CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) và TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Kích thích tế bào qPCR và ChIP với PMA (20 ng/ml) và ionomycin (1 μg/ml) trong 4 giờ. Thu thập dịch nổi ELISA trước và sau khi kích thích với PMA (20 ng/ml) và ionomycin (1 μg/ml) trong 4 giờ.
Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tách chiết RNA bằng bộ kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Sử dụng QIAshredder (QIAGEN) để đồng nhất mẫu. Sử dụng bộ kit chuyển đổi RNA thành cDNA dung lượng cao (Thermo Fisher Scientific) để tổng hợp DNA bổ sung (cDNA). Sử dụng TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) để định lượng biểu hiện gen (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) với các đầu dò sau: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] và Hs01010726_m1 (SLC22A2). Các mẫu được chạy trên hệ thống PCR thời gian thực StepOnePlus (Applied Biosystems) trong khay phản ứng quang học nhanh 96 giếng MicroAmp (Applied Biosystems) với màng quang học MicroAmp. Bất kỳ giá trị Ct nào vượt quá 35 đều được coi là vượt quá ngưỡng phát hiện và được đánh dấu là không phát hiện được.
Thực hiện ChIP như đã mô tả trước đây (58). Tóm lại, các tế bào được xử lý bằng formaldehyde (nồng độ cuối cùng là 1,42%) và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sử dụng dung dịch đệm trương nở bổ sung (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl và 0,1% NP-40) trên đá trong 10 phút, sau đó huyền phù lại trong dung dịch đệm kết tủa miễn dịch như đã mô tả (58). Sau đó, mẫu được siêu âm với các chu kỳ sau: 10 chu kỳ (20 xung 1 giây) và thời gian tĩnh 40 giây. Ủ kháng thể immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) và SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) loại ChIP với mẫu ở 4°C, lắc qua đêm. Ủ mẫu với hạt protein A (Thermo Fisher Scientific) ở 4°C và lắc nhẹ trong 1 giờ, sau đó dùng hạt chelex (Bio-Rad) để làm giàu DNA, và dùng proteinase K (Thermo Fisher) để tiêu hóa protein. Vùng promoter TNFα được phát hiện bằng PCR: mồi xuôi, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; mồi ngược, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (sản phẩm 207 bp). Hình ảnh được tạo ra bằng phần mềm Image Lab (Bio-Rad) và định lượng bằng phần mềm ImageJ.
Dịch nuôi cấy tế bào được thu thập như mô tả ở trên. Việc xác định được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất bộ kit ELISA TNFα người (Invitrogen), bộ kit ELISA IL-2 người (Invitrogen) và bộ kit ELISA IFN-γ người (Abcam). Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, dịch nuôi cấy được pha loãng 1:100 để phát hiện TNFα và IL-2, và 1:3 để phát hiện IFN-γ. Sử dụng máy đọc đa nhãn EnVision 2104 (PerkinElmer) để đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.
Tế bào PBMC được tách từ sản phẩm phân tách bạch cầu (STEMCELL Technologies) bằng phương pháp ly tâm phân tách theo gradient mật độ Ficoll. Tế bào CD3+ được phân lập từ PBMC bằng cách sử dụng hạt CD3 (Miltenyi). Có hoặc không có MNA, tế bào CD3+ được hoạt hóa bằng CD3 gắn trên đĩa (5μg/ml), CD28 hòa tan (3μg/ml) và IL-2 (300 U/ml; Proleukin) trong 3 ngày. Sau 3 ngày, các tế bào được thu thập và rửa bằng dung dịch muối sinh lý 0,9%, và phần cặn được đông lạnh nhanh. Số lượng tế bào được đếm bằng phương pháp cytometry dòng chảy (Cytek Aurora; cấu hình 3L-16V-14B-8R) sử dụng hạt eBeads 123count.
Chiết xuất các chất chuyển hóa như mô tả ở trên. Dịch chiết khô được hòa tan lại ở nồng độ 4000 tế bào tương đương/μl. Phân tích mẫu bằng sắc ký pha đảo (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) và cột CORTECS T3 (2,1×150 mm, kích thước hạt 1,6 μm, kích thước lỗ xốp 120 Å; #186008500, Waters). Máy quang phổ khối phân cực (6470, Agilent), trong đó phương pháp ion hóa phun điện hoạt động ở chế độ dương. Pha động A là axit formic 0,1% (trong H2O), pha động B là 90% acetonitrile, axit formic 0,1%. Quy trình sắc ký lỏng (LC) sử dụng gradient như sau: từ 0 đến 2 phút với 100% pha A, từ 2 đến 7,1 phút với 99% pha B, và từ 7,1 đến 8 phút với 99% pha B. Sau đó, tái cân bằng cột với pha động A ở tốc độ dòng 0,6 ml/phút trong 3 phút. Tốc độ dòng là 0,4 ml/phút, và buồng cột được gia nhiệt đến 50°C. Sử dụng chất chuẩn hóa học tinh khiết của MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) để xác định thời gian lưu (RT) và chuyển hóa (RT = 0,882 phút, chuyển hóa 1 = 137→94,1, chuyển hóa 2 = 137→92, chuyển hóa 3 = 137→78). Khi cả ba chuyển hóa xảy ra ở thời gian lưu chính xác, chuyển hóa 1 được sử dụng để định lượng nhằm đảm bảo tính đặc hiệu. Đường cong chuẩn của MNA (Công ty Hóa chất Nghiên cứu Toronto) được tạo ra bằng sáu lần pha loãng nối tiếp dung dịch gốc (1 mg/ml) để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,1, 1,0, 10 và 100 ng/ml và 1,0 và 10 μg/ml. Giới hạn phát hiện là 1 ng/ml, và đáp ứng tuyến tính nằm trong khoảng từ 10 ng/ml đến 10 μg/ml. Mỗi lần tiêm 2 microlít mẫu và dung dịch chuẩn được sử dụng cho phân tích LC/MS, và một mẫu kiểm soát chất lượng hỗn hợp được chạy sau mỗi tám lần tiêm để đảm bảo tính ổn định của nền tảng phân tích. Đáp ứng MNA của tất cả các mẫu tế bào được xử lý bằng MNA đều nằm trong phạm vi tuyến tính của phép thử. Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm phân tích định lượng MassHunter (v9.0, Agilent).
Cấu trúc αFR-CAR thế hệ thứ hai được lấy từ Song et al. (59). Tóm lại, cấu trúc này chứa các thành phần sau: trình tự dẫn đầu CD8a, đoạn biến đổi chuỗi đơn đặc hiệu αFR của người, vùng bản lề và vùng xuyên màng CD8a, miền nội bào CD27 và miền nội bào CD3z. Trình tự CAR hoàn chỉnh được tổng hợp bởi GenScript, sau đó được nhân bản vào vectơ biểu hiện lentivirus thế hệ thứ hai ở phía thượng nguồn của cassette biểu hiện GFP được sử dụng để đánh giá hiệu quả chuyển gen.
Lentivirus được sản xuất bằng cách chuyển nạp vào tế bào HEK293T [Bộ sưu tập chủng loại tế bào Mỹ (ATCC); được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle medium chứa 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) và 1% PenStrep, và sử dụng vector CAR-GFP cùng các plasmid đóng gói (psPAX2 và pMD2.G, Addgene) bằng phương pháp lipofection amine (Sigma-Aldrich). Dịch nổi chứa virus được thu thập sau 48 và 72 giờ chuyển nạp, lọc và cô đặc bằng ly tâm siêu tốc. Bảo quản dịch nổi virus cô đặc ở -80°C cho đến khi chuyển nạp.
PBMC được tách từ sản phẩm phân tách bạch cầu của người hiến tặng khỏe mạnh (STEMCELL Technologies) bằng phương pháp ly tâm phân tách theo gradient mật độ Ficoll. Sử dụng hạt vi cầu CD8 chọn lọc dương tính (Miltenyi) để phân lập tế bào CD8+ từ PBMC. Kích thích tế bào T bằng TransAct (Miltenyi) và trong môi trường TexMACS [Miltenyi; bổ sung 3% huyết thanh người bất hoạt bằng nhiệt, 1% PenStrep và IL-2 (300 U/ml)]. Hai mươi bốn giờ sau khi kích thích, tế bào T được chuyển gen bằng lentivirus (10 μl dịch nổi virus đậm đặc trên 106 tế bào). Từ 1 đến 3 ngày sau khi chuyển gen trên Cytek Aurora (trên FSC (Tán xạ phía trước)/SSC (Tán xạ bên), Singlet, GFP+), đánh giá sự biểu hiện GFP của tế bào để chứng minh hiệu quả chuyển gen đạt ít nhất 30%.
Tế bào CAR-T được nuôi cấy trong 24 giờ trong môi trường Immunocult (STEMCELL Technologies; bổ sung 1% PenStrep) với các điều kiện sau: không xử lý, xử lý với 250 μM adenosine hoặc 10 mM MNA. Sau khi xử lý sơ bộ, tế bào CAR-T được rửa bằng PBS và kết hợp với 20.000 tế bào SK-OV-3 [ATCC; trong môi trường McCoy 5A (Sigma-Aldrich) bổ sung 10% FBS và 1% PenStrep với tỷ lệ 10:1. Tỷ lệ tế bào hiệu ứng/tế bào đích là 1 được khuếch đại ba lần trong môi trường Immunocult bổ sung. Tế bào SK-OV-3 và tế bào SK-OV-3 được ly giải bằng digitalis saponin (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) được sử dụng làm đối chứng âm và dương tương ứng. Sau 24 giờ đồng nuôi cấy, dịch nổi được thu thập và hoạt tính lactate dehydrogenase (LDH) được đo theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Bộ dụng cụ xét nghiệm độc tính tế bào LDH Glo, Promega). Dịch nổi LDH được pha loãng 1:50 trong dung dịch đệm LDH. Tỷ lệ tiêu diệt được đo bằng công thức sau: tỷ lệ tiêu diệt = tỷ lệ hiệu chỉnh / tỷ lệ tiêu diệt tối đa x 100%, trong đó tỷ lệ hiệu chỉnh = đồng nuôi cấy - chỉ tế bào T, và tỷ lệ tiêu diệt tối đa = đối chứng dương - đối chứng âm.
Như đã mô tả trong văn bản hoặc phần vật liệu và phương pháp, hãy sử dụng GraphPad Prism 8, Microsoft Excel hoặc R v3.6.0 để phân tích thống kê. Nếu thu thập nhiều mẫu từ cùng một bệnh nhân (ví dụ như dịch cổ trướng và khối u), chúng tôi sử dụng phép kiểm định t cặp đôi hoặc đưa bệnh nhân vào như một hiệu ứng ngẫu nhiên trong mô hình tuyến tính hoặc mô hình tổng quát tùy theo trường hợp. Đối với phân tích chuyển hóa học, phép kiểm định tầm quan trọng được thực hiện ba lần.
Để xem tài liệu bổ sung cho bài viết này, vui lòng truy cập http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Đây là bài báo được truy cập mở, phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Creative Commons Ghi công phi thương mại, cho phép sử dụng, phân phối và sao chép trên mọi phương tiện, miễn là mục đích sử dụng cuối cùng không nhằm mục đích thương mại và giả định rằng tác phẩm gốc là chính xác. Tài liệu tham khảo.
Lưu ý: Chúng tôi chỉ yêu cầu bạn cung cấp địa chỉ email để người mà bạn giới thiệu đến trang này biết rằng bạn muốn họ xem email đó và đó không phải là thư rác. Chúng tôi sẽ không thu thập bất kỳ địa chỉ email nào.
Câu hỏi này được sử dụng để kiểm tra xem bạn có phải là khách truy cập hay không và ngăn chặn việc gửi thư rác tự động.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA góp phần ức chế miễn dịch tế bào T và là mục tiêu tiềm năng trong liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư ở người.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA góp phần ức chế miễn dịch tế bào T và là mục tiêu tiềm năng trong liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư ở người.
©2021 Hiệp hội vì sự tiến bộ của khoa học Hoa Kỳ. mọi quyền được bảo lưu. AAAS là đối tác của HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef và COUNTER. Khoa học nâng cao ISSN 2375-2548.